Optimisation et effets d'amélioration du sommeil d'un extrait de boisson Congrong – Zaoren – Wumei chez la souris

2 Résultats et analyse

2.1 Optimisation du processus de préparation de l’extrait de boisson Congrong – Zaoren – Wumei

 

D'après la figure 1, la méthode HPLC établie a permis d'obtenir une séparation efficace entre les pics chromatographiques des quatre composés de référence (acide citrique, échinacoside, verbascoside et spinosine) et les pics adjacents. Les temps de rétention étaient respectivement tR1=9.0 min, tR2=21.6 min, tR3=24.3 min et tR4=25.9 min. Les régressions linéaires de la surface du pic par rapport à la concentration de l'analyte ont donné des plages linéaires de 12,12 à 2016, 0,14 à 110, 0,18 à 112,50 et 2,44 à 18,30 µg·mL-1, avec des valeurs R2 de 0,9998, 1, 1 et 1, indiquant une excellente linéarité. Dans ces conditions, les limites de détection (LOD) pour l'acide citrique, l'échinacoside, le verbascoside et la spinosine étaient de 3,636, 0,045144, 0,058 et 0,7564 µg·mL–1, et les limites de quantification (LOQ) étaient de 12,12, 0,14, 0,18 et 2,44 µg·mL–1, respectivement. Les tests de précision ont montré des RSD de 0,10 %, 0,07 %, 0,06 % et 0,33 % pour les quatre analytes, indiquant une bonne précision de l'instrument. La stabilité sur 0 à 12 h était bonne, avec des RSD de 0,78 %, 0,16 %, 0,20 % et 1,46 %. Les tests de répétabilité ont produit des RSD de 0,51 %, 0,42 %, 0,37 % et 0,38 % pour les analytes, démontrant une bonne répétabilité. Les tests de récupération en pointe ont montré des récupérations moyennes de 97,42 %, 103,32 %, 98,90 % et 99,71 %, avec des RSD de 0,70 %, 0,52 %, 1,05 % et 0,63 %, respectivement. Par conséquent, la méthode HPLC établie pour la détermination simultanée de ces quatre composants majeurs est précise et fiable, adaptée aux tests ultérieurs d’optimisation des processus.

 

 

 

 

Fig.1 Chromatogrammes HPLC de la référence et des solutions à longueur d'onde 210 nm (A) et 330 nm (B et C)

 

Lors de l'évaluation méthodologique des polysaccharides bruts, la LOD était de 0,098 µg·mL–1. Les valeurs de DO du blanc solvant et du contrôle blanc à 485 nm n'ont montré aucun changement évident, indiquant une bonne spécificité. La régression linéaire de la DO en fonction de la concentration a donné R2=0.9997, indiquant une excellente linéarité. Le RSD pour six mesures consécutives était de 0,47 %, démontrant une bonne précision. Le RSD pour la teneur en polysaccharides en 12 h était de 0,44 %, indiquant une bonne stabilité. Le RSD sur six échantillons préparés indépendamment était de 2,51 %, ce qui indique une bonne répétabilité. Par conséquent, la méthode convient à la quantification des polysaccharides bruts lors de l’optimisation du processus.

 

 

Avantages de la Cistanche Roucongrong dans le Livre Ancien

Cliquez pour plus de détails

Service de soutien de Wecistanche-Pour plus de détails sur la coopération
E-mail :wallence.suen@wecistanche.com

 

 

2.1.2 Résultats des enquêtes à facteur unique

En utilisant la méthode HPLC établie combinée au test des polysaccharides et en prenant la teneur en acide citrique, échinacoside, verbascoside, spinosine et polysaccharides de l'extrait comme indices d'évaluation, des enquêtes à facteur unique ont été menées sur la température d'extraction, le rapport solide-liquide et le temps d'extraction pour soutenir la conception orthogonale.

À des températures d'extraction de 60, 80 et 100 degrés, les teneurs en acide citrique, échinacoside, verbascoside, spinosine et polysaccharides bruts dans les extraits ont augmenté avec la température.

Aux ratios solide-liquide de 1:3, 1:5, 1:7, 1:10 et 1:12 (g·mL-1), les teneurs en acide citrique, spinosine et polysaccharides bruts ont augmenté avec des ratios plus élevés ; l'échinacoside et le verbascoside ont culminé à 1:10 (g·mL–1) et diminué à 1:12 (g·mL–1). Cependant, la teneur totale de tous les composants du marqueur augmentait avec le rapport solide-liquide.

Aux temps d'extraction de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 et 3,0 h, le contenu des analytes individuels variait différemment, mais le contenu total des composants marqueurs augmentait avec le temps.

Des données détaillées sont fournies dans les documents supplémentaires. Compte tenu des aspects pratiques industriels (en évitant une extraction trop longue), les facteurs et les niveaux pour la conception orthogonale ont été définis comme dans le tableau 2, et le schéma orthogonal est présenté dans le tableau 3.

Tableau 2. Niveaux de facteurs du plan expérimental orthogonal pour la méthode d'extraction de Congrong – Zaoren – Wumei Beverage

Facteurs :

A : Température d'extraction (degré)

B : rapport solide-liquide (g mL–1)

C : Temps d'extraction (h)

Niveau	A : Température (degré)	B : Rapport (g mL–1)	C : heure (heures)
1	60	1:7	1.0
2	80	1:10	1.5
3	100	1:12	2.0

2.1.3 Résultats de conception orthogonale

L'extraction a été effectuée selon le réseau orthogonal. Les teneurs en acide citrique, échinacoside, verbascoside, spinosine et polysaccharides bruts sont présentées dans le tableau 3. Sur la base de l'analyse de la plage (R), l'ordre d'influence des facteurs sur la teneur totale en marqueurs était A > B > C, c'est-à-dire température d'extraction > rapport solide-liquide > temps d'extraction. La comparaison des valeurs de k suggère la combinaison optimale A3B3C3 : température d'extraction de 100 degrés, rapport solide-liquide de 1:12 (g·mL-1) et temps d'extraction de 2 h. L'ANOVA (tableau 4) a indiqué que la température d'extraction avait un effet significatif sur la teneur totale en marqueurs, tandis que les effets du rapport solide-liquide et du temps n'étaient pas significatifs.

Tableau 3. Plan expérimental orthogonal et teneurs mesurées en composants de la boisson Congrong – Zaoren – Wumei (mg g – 1)

Facteurs : A (température), B (rapport solide-liquide), C (temps)

Numéro d'essai	A	B	C	Total des marqueurs	Acide citrique	Spinosine	Échinacoside	Verbascoside	Polysaccharides bruts
1	3	3	1	116.71	75.55	4.08	1.62	0.48	34.98
2	1	2	3	70.98	59.01	2.60	0.80	0.36	8.22
3	3	1	3	117.86	73.87	3.53	1.21	0.45	38.80
4	1	3	2	72.55	59.73	2.37	0.94	0.41	9.99
5	2	3	3	83.64	63.20	2.15	1.08	0.44	16.77
6	2	1	2	117.76	74.09	2.58	1.37	0.48	39.24
7	2	2	1	110.74	70.96	2.36	1.07	0.43	35.92
8	2	1	1	69.63	58.37	1.74	0.54	0.34	8.65
9	1	1	3	69.66	58.14	2.48	0.86	0.36	7.83

K statistiques (somme des totaux par niveau de facteur)

K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49

K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65

K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83

Plage R : A = 46.38, B = 5.25, C = 4.19

2.1.4 Validation et mise à l'échelle

La validation du processus dans les conditions optimales a donné une teneur totale moyenne en composants marqueurs de 119,74 mg·g–1 avec un RSD de 0,57 %, indiquant la stabilité et la fiabilité. L'essai de mise à l'échelle dans les mêmes conditions a donné une teneur totale moyenne en marqueurs de 120,89 mg·g–1 avec un RSD de 0,95 %, ce qui est cohérent avec les résultats préalables à l'échelle, confirmant ainsi la robustesse. Des échantillons des trois lots d’intensification ont été utilisés pour des études ultérieures liées au sommeil ; leurs teneurs moyennes étaient : acide citrique 77,73 mg·g–1, échinacoside 2,69 mg·g–1, verbascoside 1,03 mg·g–1, spinosine 0,50 mg·g–1 et polysaccharides 38,93 mg·g–1.

Tableau 4. Analyse de variance à partir d'expériences orthogonales

Facteur	Somme des carrés	df	Carré moyen	F	P
Température d'extraction	4010.50	2	2005.25	116.26	0.01
Rapport solide-liquide	49.79	2	24.90	1.44	0.41
Temps d'extraction	47.37	2	23.68	1.37	0.42

Liu et coll. [16] ont optimisé l'extraction aqueuse des glycosides phényléthanoïdes de Cistanche tubulosa et ont identifié 1:15 (g·mL–1), 80 degrés et 2 h comme étant optimaux ; la teneur en glycoside phényléthanoïde a diminué au-dessus de 90 degrés. Dans la présente étude, les teneurs en échinacoside et en verbascoside ont culminé à un rapport de 1:10 (g·mL–1) et ont diminué à 1:12 (g·mL–1), tout en augmentant avec des températures de 60, 80 et 100 degrés. Cette divergence peut être liée à l'utilisation de Cistanche deserticola (Cistanche du désert) dans notre boisson et aux effets de matrice des Suanzaoren et Wumei coexistants qui pourraient influencer la dissolution des glycosides phényléthanoïdes.

Tableau 5. Effet de l'extrait de boisson Congrong – Zaoren – Wumei sur le sommeil direct chez la souris (n=12)

Groupe	Total des animaux	Animaux endormis	Taux de sommeil (%)
Vide	12	0	0
Estazolam	12	0	0
Extrait faiblement dosé	12	0	0
Extrait à dose moyenne	12	0	0
Extrait à haute dose	12	0	0

En résumé, en utilisant la HPLC et la méthode phénol-acide sulfurique, nous avons optimisé le processus d'extraction en fonction de la teneur en acide citrique, échinacoside, verbascoside, spinosine et polysaccharides. Des expériences monofactorielles et orthogonales suivies d'une validation ont établi les conditions optimales : 100 degrés, rapport solide-liquide de 1:12 (g·mL–1) et temps d'extraction de 2 h, fournissant une référence pour le développement industriel futur.

Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85 000 acres), une capacité de stockage de cistanche fraîche (~ 15 000 tonnes) et des ateliers de fabrication certifiés GMP (salles blanches de classe 100 000) équipés d'ultrafiltration et de nanofiltration avancées pour la purification et la concentration, ainsi qu'un laboratoire de microbiologie de classe 10 000. Les certifications incluent China SC, HACCP et les programmes biologiques (par exemple, NOP). Cette infrastructure prend en charge la traduction directe du protocole optimisé d’extraction aqueuse et de normalisation des marqueurs vers une production à grande échelle et conforme à l’exportation de boissons et d’extraits fonctionnels.

Tableau 6. Effet de l'extrait sur l'effet hypnotique du pentobarbital sodique sous-seuil chez la souris (x̄ ± s, n=12)

Groupe	Total des animaux	Animaux endormis	Taux de sommeil (%)
Vide	12	1	8.33
Estazolam	12	10	83.33**
Extrait faiblement dosé	12	4	33.33
Extrait à dose moyenne	12	5	41.67
Extrait à haute dose	12	6	50.00*

Remarque : Par rapport au groupe vierge, * P < 0,05 ; ** P < 0,001.

 

2.2 Effets de l'extrait sur le comportement et le sommeil de la souris

2.2.1 Sommeil direct

Comme le montre le tableau 5, après 30 jours d'administration continue, les souris du groupe estazolam et des groupes d'extrait à dose faible/moyenne/élevée n'ont pas présenté de sommeil évident dans les 20 minutes suivant la dose finale, sans différence significative par rapport au groupe vierge. Cela n’indique aucun effet direct induisant le sommeil après 30 jours d’administration de l’extrait.

 

2.2.2 Effets comportementaux

Un test en champ ouvert a évalué les effets de type sédatif. Les impacts sur la distance totale parcourue et les entrées au centre sont présentés dans la figure 2. Par rapport au groupe vierge, l'estazolam a augmenté la distance totale et les entrées au centre de 14,48 % et 31,07 %, respectivement, sans signification statistique. L'extrait à faible dose a augmenté de manière significative la distance totale de 25,10 % (P < 0,05) et a augmenté de manière non significative les entrées centrales de 50,93 %. La dose moyenne a augmenté de manière significative la distance totale et les entrées au centre de 27,09 % et 72,33 % (P < 0,05). La dose élevée a augmenté les entrées totales de distance et de centre de 15,60 % et 40,78 %, respectivement, sans signification. Par rapport à l'estazolam, les doses faibles/moyennes/élevées ont augmenté la distance totale de 1,73, 1,87 et 1,07 fois, et les entrées centrales de 1,64, 2,33 et 1,31 fois, respectivement, sans aucune signification significative. Ces résultats indiquent que l'extrait a réduit les comportements anxieux en plein champ après 30 jours, suggérant un effet sédatif.

2.2.3 Sommeil induit par le pentobarbital sodique sous le seuil

Comme le montre le tableau 6, par rapport au groupe témoin, l'estazolam et les trois doses d'extrait ont augmenté le taux de sommeil sous une dose inférieure au seuil de pentobarbital sodique. L'Estazolam a multiplié par 9 le nombre d'animaux endormis par rapport au blanc (P < 0,001). Les groupes d'extraits à faible, moyenne et forte dose ont augmenté le nombre d'animaux endormis de 3, 4 et 5 fois respectivement ; seule la dose élevée a atteint une signification statistique (P < 0,05). Par rapport à l’estazolam, aucune des doses d’extrait n’a montré un effet somnifère plus fort. Ainsi, l’extrait peut améliorer dans une certaine mesure le sommeil induit par le pentobarbital sodique inférieur au seuil.

 

2.2.4 Latence du sommeil au pentobarbital sodique

Par rapport au groupe témoin, l'estazolam et les trois doses d'extrait ont considérablement réduit la latence du sommeil induite par le pentobarbital (P < 0,001). L'estazolam a réduit la latence de 58,44 % (P < 0,001). Les groupes d'extraits à faible, moyenne et forte dose ont réduit la latence de 29,59 %, 31,42 % et 53,83 % (tous P < 0,001), respectivement. Il n’y avait pas de différence significative entre les doses faibles et moyennes ; la dose élevée a considérablement réduit le temps de latence par rapport aux doses faibles et moyennes de 34,43 % et 32,69 % (P < 0,01), avec un effet similaire à celui de l'estazolam (Tableau 7). Par conséquent, les trois doses ont considérablement réduit la latence du sommeil induite par le pentobarbital, la dose élevée étant la plus performante.

Les médecines traditionnelles chinoises contiennent divers constituants bioactifs agissant sur de multiples cibles, offrant des avantages uniques pour le traitement de l'insomnie [17]. Avec l’attention croissante portée aux problèmes de sommeil, les MTC médicinales et comestibles sont de plus en plus étudiées pour la modulation du sommeil (18). Par exemple, une boisson solide composite comprenant principalement du Suanzaoren et du Poria a considérablement raccourci la latence du sommeil induite par le pentobarbital et prolongé la durée du sommeil chez la souris, potentiellement via des modifications des taux de 5-HT, DA et GABA (19). Ici, l'extrait a considérablement augmenté le sommeil sous le pentobarbital sous le seuil et a raccourci la latence du sommeil induite par le pentobarbital, favorisant l'endormissement et diminuant la latence, tout en ne montrant aucun effet direct induisant le sommeil. Les teneurs mesurées en composants principaux étaient, par ordre décroissant : acide citrique (77,73 mg·g–1), polysaccharides (38,93 mg·g–1), échinacoside (2,69 mg·g–1), verbascoside (1,03 mg·g–1) et spinosine (0,50 mg·g–1). Il a été démontré que la spinosine améliore le sommeil induit par le pentobarbital ; il peut augmenter le sommeil non paradoxal et modifier l'expression de c-Fos dans les régions cérébrales régulatrices du sommeil et de l'éveil [20], atténuer l'insomnie induite par le PCPA, réduire la latence du sommeil et prolonger le sommeil [21]. Le verbascoside a rapporté des activités anxiolytiques, hypnotiques et myorelaxantes [22]. En revanche, les principaux constituants - l'acide citrique, les polysaccharides (de Cistanche, Suanzaoren et Wumei) et l'échinacoside - ont moins de rapports directs sur l'amélioration du sommeil ; cependant, des recherches récentes sur les polysaccharides de la MTC (par exemple, les polysaccharides d'Acanthopanax senticosus) suggèrent des bienfaits potentiels sur le sommeil via des voies telles que SIRT1/PGC-1 [23]. Par conséquent, les rôles de l’acide citrique, des polysaccharides et de l’échinacoside dans la modulation du sommeil justifient une étude plus approfondie.

 

capable 7. Effet de l'extrait sur la latence du sommeil induite par le pentobarbital de sodium chez la souris (x̄ ± s, n=12)

Groupe	Total des animaux	Latence de sommeil (min)
Vide	12	32.34 ± 4.27
Estazolam	12	13.44 ± 3.20**
Extrait faiblement dosé	12	22.77 ± 5.81**#
Extrait à dose moyenne	12	22.18 ± 6.05**#
Extrait à haute dose	12	14.93 ± 3.35**

Remarques :

Par rapport au groupe vierge : ** P < 0,0001.

Par rapport au groupe d'extraits à haute dose : # P < 0,01.

 

3 Conclusion

En utilisant les MTC médicinaux comestibles Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen et Mume Fructus pour formuler une boisson Congrong – Zaoren – Wumei, nous avons optimisé le processus de préparation de son extrait en utilisant le contenu de quatre composants marqueurs (échinacoside, verbascoside, spinosine, acide citrique) et des polysaccharides comme indices d'évaluation. Les conditions d'extraction optimales ont été déterminées à 100 degrés, un rapport solide-liquide de 1:12 (g·mL-1) et 2 h, fournissant des conseils théoriques pour la production industrielle. Une évaluation plus approfondie a montré qu'une administration continue de 30 jours n'avait aucun effet direct sur le sommeil chez la souris, mais qu'elle réduisait de manière significative les comportements anxieux lors du test en champ ouvert (suggérant un effet sédatif), améliorait le sommeil sous une dose inférieure au seuil de pentobarbital de sodium et la latence d'endormissement induite par le pentobarbital était nettement raccourcie. Ces résultats indiquent que l'extrait préparé selon le processus optimisé présente des effets favorables sur l'amélioration du sommeil chez la souris, fournissant ainsi une base scientifique pour le développement de gammes de produits améliorant le sommeil à base de Cistanche.

Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85 000 acres ; stockage de cistanche fraîche ~15 000 tonnes) soutiennent l'homogénéité des matières premières et le contrôle de qualité conforme aux normes internationales, facilitant ainsi la commercialisation de boissons fonctionnelles et de suppléments de santé répondant aux attentes des États-Unis et de l'Union européenne.