Coordonner la régulation du métabolisme systémique et rénal du tryptophane par les transporteurs de médicaments OAT1 et OAT3

Jeffry C. Granados¹, Anne Richelle², Jahir M. Gutierrez¹, Patrick Zhang³, Xinlian Zhang⁴, Vibha Bhatnagar⁵, Nathan E. Lewis^1,2,6, et Sanjay K. Nigam^2,7,*

^{Contact:joanna.jia@wecistanche.com}

expérience cistanche

La façon dont les organes détectent les métabolites en circulation est une question clé. Ici, nous montrons que les transporteurs d'anions organiques multispécifiques de médicaments, OAT1 (SLC22A6 ou NKT) et OAT3 (SLC22A8), jouent un rôle dans le sens des organes. Des analyses métabolomiques du sérum de souris knock-out Oat1 et Oat3 ont révélé des changements dans les dérivés du tryptophane impliqués dans le métabolisme et la signalisation. Plusieurs de ces métabolites sont dérivés du microbiote intestinal et sont impliqués comme toxines urémiques danschroniqueun reinmaladie. L'interaction directe avec les transporteurs a été soutenue par des tests de transport à base de cellules. Pour évaluer l'impact de la perte de la fonction OAT1 ou OAT3 sur le rein, un organe où ces transporteurs d'absorption sont fortement exprimés, des données transcriptomiques knock-out ont été cartographiées sur un modèle informatique basé sur une "tâche métabolique" qui évalue plus de 150 fonctions cellulaires. Malgré les changements des métabolites du tryptophane dans les deux knock-outs, ce n'est que dans le knock-out Oat1 que plusieurs fonctions cellulaires liées au tryptophane ont augmenté. Ainsi, privé de la capacité de prendre de la kynurénine, du kynurénate, de l'anthranilate et du N-for-mylanthranilate via OAT1, le rein répond en activant ses propres voies de biosynthèse liées au tryptophane. Les résultats appuient la théorie de la télédétection et de la signalisation, qui décrit comment les transporteurs de "médicaments" aident à optimiser les niveaux de métabolites et de molécules de signalisation en facilitant la diaphonie des organes. Étant donné que l'OAT1 et l'OAT3 sont inhibées par de nombreux médicaments, les données impliquent le potentiel d'interactions médicament-métabolite. En effet, le traitement des humains avec du probénécide, un inhibiteur de l'OAT utilisé pour traiter la goutte, a élevé les métabolites circulants du tryptophane. De plus, étant donné que les organismes de réglementation ont recommandé que les médicaments soient testés pour la liaison ou le transport d'OAT1 et d'OAT3, il s'ensuit que ces métabolites peuvent être utilisés comme biomarqueurs endogènes pour déterminer si les médicaments candidats interagissent avec OAT1 et/ou OAT3.

Les transporteurs d'anions organiques OAT1 (SLC22A6, à l'origine NKT (1)) et OAT3 (SLC22A8, à l'origine ROCT (2)) se trouvent dans le tubule proximal duun reinet le plexus choroïde du cerveau et contrôlent la distribution physiologique et l'élimination de nombreux médicaments et toxines environnementales ainsi que des métabolites endogènes tels que le -cétoglutarate, les prostaglandines et l'urate (3, 4). De plus, les OAT aident à réguler les niveaux de produits naturels ingérés et de composés dérivés du microbiome intestinal (par exemple, l'épicatéchine, le 3-sulfate d'indoxyle, le sulfate de p-crésol) (5, 6).

OAT1 et OAT3, membres de la famille SLC22, sont parmi les transporteurs de médicaments multispécifiques les plus connus. Ce groupe de transporteurs de médicaments comprend d'autres membres des superfamilles SLC (solute carrier) et ABC (ATP-binding cassette) (7, 8). Il existe une abondante littérature sur les rôles pharmaceutiques et toxicologiques de ces transporteurs, mais les fonctions endogènes de ces protéines conservées au cours de l'évolution, ainsi que le réseau de régulation auquel elles participent, commencent seulement à être caractérisés (9). Ces transporteurs multispécifiques influencent de nombreux aspects de la physiologie et de la physiopathologie, probablement en fonctionnant en combinaison avec des transporteurs mono- ou oligo-spécifiques. Trois exemples physiopathologiques bien caractérisés sont les rôles de OAT1, OAT3, URAT1 et ABCG2 dans la goutte (10), le rôle de OAT1 et OAT3 dans l'accumulation de toxines urémiques associées à laun rein(CKD) (11, 12), et la famille SLC22 en phase aiguëun reinblessure (13).

En raison de la vaste gamme de petits composés anioniques organiques transportés par OAT1 et OAT3, un large éventail de xénobiotiques et de molécules endogènes peut éventuellement entrer en compétition pour l'accès et la clairance rénale de ces transporteurs OAT (14, 15). Cela a des implications importantes car de nombreux métabolites, y compris ceux provenant du microbiome intestinal et transportés par OAT1 et OAT3, régulent la physiologie endogène et ont été liés au développement de troubles cliniques, tels que l'IRC, le syndrome métabolique et le diabète (14, 16, 17). Par exemple, la quantité de CMPF (acide 3-carboxy-4-méthyl-5-propyl-2- furane propanoïque), un substrat de l'OAT3, dans la circulation a été liée au diabète. Le CMPF est un métabolite d'acide gras furane présent dans les huiles de poisson, les huiles végétales, le beurre et d'autres aliments et perturbe la fonction des cellules pancréatiques, entraînant une intolérance au glucose (18, 19). Les conséquences potentielles de la compétition au niveau du transporteur entre un médicament et le métabolite endogène transporté comprennent (a) des concentrations intracellulaires modifiées de métabolites parce qu'un médicament transporté bloque l'entrée du métabolite dans la cellule ; (b) des concentrations sériques altérées du médicament, du métabolite ou des deux, entraînant une augmentation des demi-vies et/ou des taux de métabolite ; et (c) un métabolisme systémique altéré résultant d'effets en cascade distaux sur de multiples voies métaboliques qui dépendent de l'OAT1 ou de l'OAT3 ou des deux.

Nous avons appliqué une approche de biologie des systèmes qui a utilisé des données métabolomiques et transcriptomiques de souris Oat1 et Oat3knockout (KO) pour analyser les principales fonctions métaboliques influencées par OAT1 et OAT3. Les données métabolomiques sériques des souris Oat1 et Oat3 KO représentaient l'impact de ces transporteurs sur le métabolisme systémique endogène. Nous avons utilisé les données transcriptomiques de laun rein, qui est le site d'expression des gènes transporteurs codants, pour évaluer l'activité de centaines de fonctions métaboliques à l'aide de l'analyse des tâches métaboliques. Ce faisant, nous avons pu compléter la compréhension des modifications des métabolites extracellulaires dues à la perte du transporteur OAT1 ou OAT3 par une analyse des voies métaboliques intracellulaires affectées.

Ensemble, l'approche multi-omique et l'analyse de la biologie des systèmes utilisées ici fournissent un portrait des voies métaboliques et de signalisation locales et systémiques modulées séparément et conjointement par OAT1 et OAT3. Nous montrons que OAT1 régule non seulement le métabolisme du tryptophane de manière systémique, mais joue également un rôle clé dans les voies métaboliques du tryptophane à l'intérieur du tissu où il se trouve. Ainsi, nos résultats indiquent que les études de nouvelles entités médicamenteuses devraient non seulement prendre en compte les effets de l'interaction médicament-métabolite (DMI) dans le sérum, mais également évaluer les changements potentiels dans le métabolisme cellulaire dus à la perte d'influx de métabolites par compétition au niveau du transporteur. À l'appui de la pertinence humaine de notre travail, nous montrons que bon nombre des altérations des taux sériques de métabolites du tryptophane observées chez les souris knock-out sont également observées chez l'homme après l'administration de probénécide, un médicament utilisé pour traiter la goutte qui inhibe OAT1 et OAT3.

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Résultats

Résumé de l'approche globale

La famille de gènes SLC22 (OAT, OCT, OCTN) code pour des transporteurs qui participent à l'absorption de nombreux composés uniques dans plusieurs tissus, bien qu'une grande partie de la recherche se soit concentrée sur une poignée de membres (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A6, SLC22A8) qui gèrent de nombreux médicaments courants (20, 21). Cependant, ces gènes sont hautement conservés, avec des orthologues chez la mouche, le ver, le poisson et l'oursin (22); cela implique qu'ils ont des rôles physiologiques importants au-delà de la manipulation de médicaments. Pour déterminer les rôles endogènes d'OAT1 et d'OAT3 dans le contrôle du métabolisme au niveau des tissus et des organismes, indépendamment de leurs rôles bien connus en tant que transporteurs de médicaments et de toxines, nous avons analysé les données transcriptomiques spécifiques aux tissus et les données métabolomiques sériques (Fig. 1). Nous avons comparé les données de souris génétiquement déficientes en Oat1 ou Oat3 et leurs témoins de type sauvage. Ces ensembles de données ont déjà été examinés d'un point de vue chimioinformatique (23) et pour fournir un large aperçu des voies affectées (24), mais nous mettons ici l'accent sur leur rôle spécifique dans la disposition des métabolites du tryptophane. Parce que ces deux transporteurs se trouvent dans leun rein, nous avons analyséun reindes données transcriptomiques à l'aide de l'analyse des tâches métaboliques, une méthode de biologie des systèmes qui regroupe les gènes en fonction de leurs rôles coordonnés dans la biosynthèse d'un ensemble limité d'intermédiaires de métabolites clés à partir de divers apports de métabolites (voir la section Méthodes pour plus de détails). Nous avons soutenu ces études dans des essais de transport in vitro ; nous soutenons également la pertinence clinique de nos découvertes avec des données de métabolomique humaine.

Caractéristiques connues des souris Oat1 KO et Oat3 KO Presque toutes les caractéristiques des souris déficientes en Oat1 ou Oat3 sont similaires à celles des souris sauvages (25–27) (Tableau 1). Les souris knock-out sont viables avec une survie comparable à celle des souris de type sauvage. De plus, ils ne présentent aucune anomalie apparente du développement ou de la croissance, et l'examen histologique et physiologique de ces différents knock-out (âgés d'environ 2 à 8 mois) n'a révélé que peu ou pas de différences par rapport au type sauvage, à l'exception des souris Oat3 KO ayant une tension artérielle légèrement inférieure ( 28). Une tendance au dépôt de lipides hépatiques dans le KO Oat1 a également été notée, mais uniquement pour les souris très âgées (29).

Ces souris transporteuses knock-out ont également été caractérisées d'un point de vue pharmacologique et toxicologique (tableau 2). OAT1 et OAT3 jouent un rôle important dans la manipulation de divers médicaments et toxines, à la fois environnementaux et produits de manière endogène (30–38). Les deux souris knock-out ont des réponses modifiées aux diurétiques de l'anse et aux diurétiques thiazidiques en raison de l'incapacité de ces médicaments à accéder à la lumière du néphron, un processus dépendant de l'absorption médiée par l'OAT1-ou l'OAT3-dans la cellule du tubule proximal . Les animaux Oat1 KO sont protégés contre la néphrotoxicité induite par le mercure en raison d'un manque deun reinabsorption de conjugués de mercure. Les deux souris ont accumulé des toxines urémiques dans le sérum et ont présenté une sécrétion réduite d'acide urique. L'analyse ex vivo des tissus de souris Oat1 KO ou Oat3 KO montre une absorption réduite de plusieurs antiviraux.

Nous avons signalé que les animaux déficients en avoine 1- peuvent avoir une expression réduite de l'OAT3 (39). Cependant, un certain nombre d'études ont indiqué que l'impact fonctionnel de ceci est au mieux modeste à l'état basal. Par exemple, le knock-out Oat1reinsont nettement réduit le transport des PAH, mais aucune perte apparente de transport du substrat OAT3, le sulfate d'estrone (26). L'analyse chimioinformatique a identifié des ensembles de propriétés moléculaires qui distinguent les métabolites altérés dans Oat1 par rapport aux souris déficientes en Oat3 (23). De plus, embryonnaireun reinles cultures d'organes des deux lignées de souris transportaient différents ensembles d'antiviraux (36–38). Il existe également des différences dans les types de toxines urémiques trouvées dans l'Oat1 par rapport à l'Oat3 KO (34).

Le métabolisme du tryptophane est altéré de manière systémique chez les souris Oat1 et Oat3 KO

Les analyses métabolomiques publiées des souris Oat1 KO et Oat3 KO suggèrent des altérations physiologiquement importantes dans la manipulation des métabolites endogènes et des produits du microbiome intestinal, y compris certaines toxines urémiques (34, 35). Ici, nous avons analysé 731 métabolites d'identité connue dans le sérum prélevé sur des souris témoins et Oat1 KO. De même, 611 métabolites d'identité connue ont été détectés dans le sérum des souris témoins et Oat3 KO.

Pour les souris Oat1 KO, nous avons constaté que 63 métabolites de la supervoie des acides aminés (tableau supplémentaire S1) étaient significativement augmentés (p inférieur ou égal à 0.05, 54 métabolites, parmi lesquels 12 métabolites avaient des changements de pli supérieurs à 3) ou tendaient vers une augmentation significative (0.05 Inférieur ou égal à p Inférieur ou égal à 0,10, neuf métabolites), suggérant qu'ils sont soit des substrats d'OAT1, soit que leurs concentrations sériques dépendent sur OAT1. Pour les souris Oat3 KO, nous avons constaté que dix métabolites de la supervoie des acides aminés étaient significativement augmentés, tandis que 11 avaient tendance à augmenter de manière significative (tableau supplémentaire S2). En complément des valeurs p, nous avons également calculé le d de Cohen, qui a montré des tailles d'effet importantes (allant de 1,76 à 4,17) pour les métabolites du tryptophane. Conformément à d'autres données pharmacologiques et physiologiques obtenues à partir des souris knock-out OAT1 et OAT3 ou de leurs tissus indiquant des différences fonctionnelles importantes (23, 36, 38), la comparaison des changements dans les métabolites sériques de la voie Superpath des acides aminés entre Oat1 KO (63 métabolites) et Les souris Oat3 KO (21 métabolites) n'ont révélé que dix métabolites se chevauchant dans ces sous-ensembles (tableau supplémentaire S3).

Chaque métabolite a été classé à l'aide du logiciel de Metabolon dans l'une des huit supervoies (acides aminés, glucides, cofacteurs et vitamines, énergie, lipides, nucléotides, peptides, xénobiotiques) et l'une des 90 sous-voies. Sur les 17 métabolites qui se sont accumulés de manière significative dans le sérum des animaux Oat1 KO et Oat3 KO, quatre appartenaient à la sous-voie du métabolisme du tryptophane, indiquant que ces deux transporteurs ont un rôle partagé important dans la régulation du métabolisme systémique du tryptophane (Fig. 2) . Indépendamment, le métabolisme du tryptophane figurait parmi les sous-voies les plus enrichies pour les deux modèles d'inactivation (Fig. 3). Seize Figure 3. Le métabolisme du tryptophane est l'une des voies les plus altérées chez les deux souris knock-out. Un diagramme de volcan pour Oat1 KO (n=5) ​​montre les métabolites du tryptophane par rapport à tous les autres métabolites mesurés. B, le métabolisme du tryptophane est la deuxième voie la plus riche en métabolites significativement élevés. C, diagramme de volcan pour le Oat3 KO (n=3) montrant les métabolites du tryptophane par rapport à tous les autres métabolites mesurés. D, le métabolisme du tryptophane est la voie la plus enrichie pour les métabolites significativement élevés sur la base de l'analyse des sous-voies du métabolon. Rôle de OAT1 et OAT3 dans le métabolisme du tryptophane 4 J. Biol. Chim. (2021) 296 100575les métabolites du tryptophane ont été mesurés dans le sérum des deux souris, et 12 ont été significativement modifiés dans au moins un groupe. Les souris Oat1 KO présentaient 11 métabolites élevés, dont un (N-formylant hranilate) qui n'a pas été mesuré dans le sérum des Oat3 KO (Tableau 3). L'analyse de l'Oat3 KO a révélé que six des 16 métabolites étaient significativement ou tendaient à être significativement modifiés. Certains de ces métabolites, y compris ceux issus des bactéries de la microflore intestinale, sont connus pour avoir des effets distaux sur plusieurs autres organes. Par exemple, le 3-sulfate d'indoxyle est associé à la progression deun reinmaladie et syndrome urémique (12, 40). Les données indiquent que OAT1 et OAT3 travaillent ensemble pour réguler le métabolisme systémique du tryptophane, et pourtant ils ont également des fonctions spécifiques au sein du métabolisme du tryptophane en manipulant des ensembles distincts de métabolites affectant différentes réactions biochimiques.

Évaluation des interactions médicament-métabolite chez l'homme impliquant un médicament inhibiteur de l'OAT et des métabolites du tryptophane

Le probénécide, un médicament utilisé pour traiter la goutte, a été administré à l'homme pour déterminer l'impact à court terme d'un médicament de haute affinité se liant à l'OAT sur les niveaux de métabolites circulants. Le probénécide a trois cibles bien établies : SLC22A12 (URAT1, Rst), OAT1 et OAT3, qui sont tous des gènes étroitement apparentés dans le groupe des transporteurs d'anions organiques de la famille des transporteurs de solutés SLC22. URAT1 est un transporteur d'acide urique situé sur la membrane apicale (côté faisant face à l'urine) du tubule proximal, donc OAT1 et OAT3, qui sont multispécifiques et exprimés sur le côté faisant face au sang du tubule proximal, devraient exercer une effet plus profond sur le métabolome sérique. Les comparaisons des mesures métaboliques sur le sang avant et 5 h après le dosage montrent des changements majeurs dans la sous-voie du métabolisme du tryptophane (tableau 4). En raison de plates-formes différentes, il y avait 22 métabolites dans cette sous-voie, dont 16 ont été significativement modifiés. Quatorze métabolites ont été mesurés sur les trois plates-formes et ont révélé plusieurs points communs entre les souris knock-out et les humains traités au probénécide (Fig. 4). Par exemple, des augmentations du 3-sulfate d'indoxyle, de la kynurénine, de la N-acétylkynurénine et du lactate d'indole ont été observées dans les groupes de souris knock-out et chez les humains. Cependant, il y avait plus de chevauchement entre la souris Oat1 KO et les humains traités au probénécide. Les huit métabolites qui étaient significativement élevés dans le Oat1 KO étaient également significativement élevés chez les humains traités par le médicament. Seule la sérotonine, qui était élevée chez la souris Oat3 KO, n'a pas été altérée chez l'homme.

Des souris traitées avec un médicament inhibiteur de l'OAT présentent des altérations du métabolisme du tryptophane

En tant qu'intermédiaire entre nos modèles de souris knock-out et les humains, nous avons traité des souris de type sauvage avec du probénécide, un médicament inhibiteur de l'OAT bien établi. Ce traitement médicamenteux a conduit à l'élévation de six métabolites du tryptophane, dont la kynurénine, le kynurénate et l'indollactate (Fig. 5). Ces métabolites étaient élevés dans une ou les deux expériences d'inactivation et chez les humains traités au probénécide.

Ainsi, les résultats globaux chez les humains et les souris traités au probénécide, ainsi que chez les souris knock-out, confirment le rôle d'OAT1 et d'OAT3 dans la régulation des taux circulants de métabolites du tryptophane.

Les métabolites du tryptophane interagissent avec les tests de transport in vitro de l'OAT1 et de l'OAT3 humaines Pour confirmer nos résultats, nous avons effectué des tests de transport in vitro en utilisant des cellules surexprimant l'OAT1 et l'OAT3 humaines. De nombreux métabolites de cette sous-voie ont été testés contre ces transporteurs (tableau 3), mais d'autres métabolites restent inexplorés. Les tests de transport de l'acide indoleacétique (ILA) ont révélé que l'ILA interagit avec OAT1 et OAT3 (IC50=229.1 ± 74,56 μM, 74,49 ± 23,29 μM respectivement) (Fig. 6). De plus, la sérotonine, qui était uniquement élevée dans le Oat3 KO, n'a interagi qu'avec OAT3 in vitro (IC50=288.2 ± 167.0 μM) (données non présentées). Les valeurs IC50 ont ensuite été intégrées aux valeurs Km connues pour calculer les constantes inhibitrices. La constante inhibitrice (Ki) pour ILA avec OAT1 était de 119,3 μM.

L'analyse de la tâche métabolomique rénale knock-out indique un rôle central pour OAT1 dans la détection des tubules proximaux des métabolites du tryptophane

Nous avons utilisé des données de microarray de lareinsde Oat1 KO, Oat3 KO et leurs contrôles de type sauvage pour identifier comment les altérations du transporteur influencent laun reinfonctions métaboliques. À cette fin, nous avons utilisé une méthode de biologie des systèmes (analyse des tâches métaboliques (41) de l'outil CellFie) qui prédit comment les changements dans l'expression des gènes impactent une liste prédéfinie de 175 tâches métaboliques (tableau supplémentaire S4), couvrant les systèmes métaboliques généraux d'un cellulaire (énergie, nucléotide, glucides, acides aminés, lipides, vitamines et cofacteur, et métabolisme des glycanes). Comme décrit dans Méthodes, le calcul d'un "score de tâche métabolique" prend des données transcriptomiques et attribue un score d'activité génique pour chaque gène. Un modèle de métabolisme à l'échelle du génome est utilisé pour compiler une liste de réactions nécessaires pour accomplir chacune des 175 tâches métaboliques. Ainsi, l'analyse transcriptomique peut être directement utilisée pour comparer quantitativement l'activité relative de chaque fonction métabolique dans les différentes conditions (par exemple, de type sauvage contre Oat1 KO, de type sauvage contre Oat3 KO).

Nous avons constaté que les tâches métaboliques liées au tryptophane étaient courantes chez les souris présentant une grande différence entre les souris Oat KO et les souris de type sauvage. Ce qui était inattendu, cependant, c'est que leun reinles tâches métaboliques liées au tryptophane dépendaient de l'OAT1 mais pas de l'OAT3. Chez les souris Oat1 KO, la synthèse de la kynurénine, du kynurénate, de l'anthranilate et du N-pour-mylanthranilate à partir du tryptophane a augmenté les scores des tâches métaboliques, tandis que chacune de ces tâches a diminué le score des tâches métaboliques chez les Oat3 KO. Ceci est cohérent avec les analyses métabolomiques sériques, qui montrent des élévations significatives des niveaux de kynurénine, de kynurénate, d'anthranilate et de N-pour-mylanthranilate dans l'Oat1 KO.

Discussion

OAT1 et OAT3 sont reconnus pour leur rôle dans l'élimination de centaines de médicaments (42). Cependant, des études in vivo et in vitro sur OAT1 et OAT3 ont montré que ces protéines sont impliquées dans le transport de nombreux métabolites endogènes et dérivés de microbes intestinaux, de toxines urémiques, de molécules de signalisation, de nutriments ingérés, de toxines industrielles et de produits naturels (9, 24, 26, 34, 35, 43). Cela semble également être le cas pour d'autres transporteurs de médicaments multispécifiques, ce qui suggère que leur contribution au métabolisme endogène est largement sous-estimée (44).

Ces transporteurs de médicaments multispécifiques sont fortement exprimés dans presque tous les tissus et jouent un rôle particulièrement critique dans la figure 4. Les métabolites du tryptophane étaient élevés chez les souris knock-out d'avoine et les humains traités au probénécide. Un diagramme de Venn des métabolites du tryptophane significativement modifiés chez les souris knock-out et les humains traités avec du probénécide. Sur les 14 métabolites communs aux trois plates-formes, 12 étaient significativement élevés dans au moins une des expériences. Quatre métabolites étaient significativement élevés dans chaque expérience. B, structures chimiques des métabolites élevées dans chaque expérience : 3-sulfate d'indoxyle, indolactate, kynurénine et N-acétylkynurénine. C, boîtes à moustaches pour chaque métabolite chez les humains traités au probénécide (n=20), les souris Oat1 KO (n=5) et les souris Oat3 KO (n=3). Les lignes dans les boîtes à moustaches indiquent la médiane. Rôle de OAT1 et OAT3 dans le métabolisme du tryptophane. Biol. Chim. (2021) 296 100575 7barrières épithéliales et endothéliales entre le sang et les autres liquides/compartiments corporels (par exemple, barrière hémato-encéphalique, barrière hémato-rétinienne, barrière hémato-LCR, barrière nez-cerveau, barrière hémato-urine). En tant que régulateurs du métabolisme systémique, ainsi que du métabolisme local au sein de leur tissu d'expression, le type d'études et d'analyses que nous avons décrites ici, si elles sont effectuées pour tous les transporteurs de "médicaments", peuvent radicalement modifier notre point de vue physiologique sur ces protéines conservées au cours de l'évolution.

L'importance pharmaceutique clinique de ces transporteurs est immense, et les agences de réglementation ont recommandé de cribler de nouvelles entités médicamenteuses contre au moins sept transporteurs de médicaments multispécifiques (OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, P-GP, BCRP) pour limiter la possibilité de interactions médicamenteuses (DDI) - cas où deux médicaments ou plus se disputent l'accès au même transporteur. Les DDI médiés par les transporteurs peuvent modifier la concentration des médicaments dans le sang, entraînant potentiellement des effets cliniques indésirables (45). Compte tenu du nombre de substrats pour OAT1 et OAT3, un phénomène similaire peut se produire entre médicaments et métabolites en circulation. Ces IMD ont également le potentiel d'avoir un impact sur la fonction tissulaire, car les métabolites et les molécules de signalisation peuvent être incapables de pénétrer dans la cellule et d'exercer leurs effets sur la physiologie cellulaire normale. La présente étude soutient cette possibilité.

Dans nos analyses métabolomiques du sérum de souris knock-out Oat1 et Oat3, il y avait des altérations marquées dans les métabolites liés au tryptophane. L'augmentation des taux systémiques de métabolites, due à l'absence de ces transporteurs à l'interface du sang avec leun rein, a soulevé la possibilité d'une diminution de la concentration intracellulaire dansun reincellules du tubule proximal. Comment ces cellules pourraient-elles réagir à leur tour ? Nous avons utilisé une analyse des tâches métaboliques basée sur la transcriptomique pour répondre à cette question. Nous avons identifié plusieurs tâches métaboliques locales (rénales) liées au tryptophane affectées par l'absence des transporteurs. Ces modifications des scores des tâches métaboliques sont causées par des augmentations compensatoires de l'expression des gènes associés aux tâches métaboliques dans le contexte du déficit en OAT1. Alors que de nombreuses voies métaboliques ont été étudiées par l'analyse des tâches métaboliques basée sur la métabolomique et la transcriptomique, l'utilisation des deux approches nous a fourni des informations uniques sur la façon dont certains transporteurs de médicaments participent à la communication entre le tissu et l'environnement extracellulaire. Ainsi, alors que les métabolites du tryptophane étaient régulés par les deux transporteurs au niveau systémique, les tâches métaboliques liées au tryptophane dans le rein dépendaient principalement de l'OAT1.

Les résultats indiquent que le tubule proximal de laun rein, où se trouvent les OAT, n'est pas simplement un conduit pour l'élimination rénale des métabolites du tryptophane ; il détecte les métabolites du tryptophane et répond aux changements de leur abondance intracellulaire. Collectivement, les données ont soutenu l'opinion selon laquelle OAT1 joue un rôle clé non seulement dans l'élimination des métabolites liés au tryptophane de la circulation en favorisant leur absorption par leun reinmais aussi que ce transporteur régule le métabolisme intracellulaire, notamment le métabolisme du tryptophane.

Cela confirme l'idée que le transport de la kynurénine, du kynurénate, de l'anthranilate et du N-pour-mylanthranilate par l'OAT1-est important pourun reinfonction (fig. 8). Ces quatre métabolites appartiennent à la sous-voie de dégradation du tryptophane par la kynurénine et, à l'exception du kynurénate, ils sont impliqués dans la production d'énergie cellulaire par la synthèse de NAD plus (46). Ainsi, il est possible que le manque d'OAT1 entraîne une altération du métabolisme cellulaire qui peut être, au moins en partie, récupéré grâce à la production de ces métabolites.

Presque tout le tryptophane ingéré est métabolisé en trois sous-voies principales : la kynurénine, la sérotonine et l'indole (47, 48). En plus de son rôle dans la production de NAD plus, la sous-voie de la kynurénine produit des métabolites qui ont une variété de fonctions dans les états sains et malades (46, 49). La voie de la sérotonine produit le neurotransmetteur, la sérotonine, qui joue un rôle dans de nombreux processus physiologiques, notamment en tant que régulateur de la fonction du SNC (50). La sous-voie indole, qui est médiée par le microbiome intestinal, produit des molécules de signalisation qui participent à la communication hôte-microbien (51). De manière systémique, OAT1 et OAT3 modulent la biodisponibilité des métabolites du tryptophane de chacune des trois sous-voies, bien que la plupart des métabolites proviennent des sous-voies de la kynurénine et de l'indole.

Compte tenu de la myriade de rôles de signalisation des métabolites élevés, il est possible que OAT1 et OAT3 influencent de nombreux aspects de la physiologie. Par exemple, le kynurénate active le GPR35, une cible médicamenteuse, et un GPCR impliqué dans les réponses inflammatoires et les maladies cardiovasculaires (52). Bon nombre des métabolites du tryptophane significativement modifiés sont également des ligands établis ou putatifs du récepteur d'aryl-hydrocarbure (AhR) (tableau 3), un régulateur transcriptionnel exprimé dans presque tous les tissus qui répondent aux xénobiotiques (53).

Les études métabolomiques des deux souris knock-out ont montré qu'une fonction endogène clé de l'OAT1 et de l'OAT3 est de réguler les niveaux systémiques des métabolites du tryptophane. Ainsi, un médicament ciblant OAT1 et OAT3 devrait avoir un impact similaire sur le métabolome. Comme prévu, le potentiel translationnel de nos souris knock-out en tant que modèles d'IMD a été fortement soutenu par les résultats d'humains traités avec du probénécide, un médicament inhibiteur de l'OAT utilisé dans le monde entier pour traiter la goutte. Plusieurs des métabolites du tryptophane étaient élevés à la fois dans le sérum des humains et des souris knock-out.

Ainsi, il est possible que les composés élevés dans les études sur l'homme et les rongeurs soient utilisés comme biomarqueurs pour de nouvelles entités médicamenteuses susceptibles d'inhiber OAT1 et OAT3. Alors que les modèles de souris knock-out (qui ont une espérance de vie normale) et les humains traités au probénécide étaient en bonne santé, certains des métabolites élevés sont des toxines urémiques connues qui sont augmentées dans le sérum des humains souffrant d'insuffisance rénale chronique et associées à des résultats négatifs (54 , 55). Le chevauchement des métabolites impliqués dans certains aspects de l'IRC et nos études suggèrent que les OAT peuvent jouer un rôle clé dans les manifestations de l'IRC ou dans sa progression, bien qu'il soit également possible que les concentrations de métabolites soient augmentées en raison de la perte de sécrétion résultant de dommages (56, 57). L'IRC peut également entraîner une défaillance multiviscérale, en partie à cause de l'accumulation de toxines urémiques, et cela peut être en partie dû à l'absorption dans d'autres tissus via les transporteurs de médicaments SLC et ABC (12, 58).

La voie du métabolisme du tryptophane nécessite le fonctionnement coordonné de plusieurs organes. Le tryptophane est absorbé par l'intestin, modifié par le foie ou d'autres organes, et les métabolites sont finalement transportés par leun rein, en partie grâce à la fonction de OAT1 et OAT3. Classiquement, cela est considéré simplement comme une voie d'élimination. Nos résultats, qui indiquent que les cellules de laun reinrépondre à l'absence de ces métabolites et molécules de signalisation en se préparant à les produire, suggèrent le contraire. Bien que leur rôle spécifique dans leun reintubule proximal est mal défini, il est clair que bon nombre des intermédiaires produits sont des neurotransmetteurs et jouent un rôle important dans la fonction du SNC (46, 49, 59, 60). En plus de la communication interorganique, le métabolisme du tryptophane reflète également la communication interorganique entre l'hôte et le microbiome intestinal. En effet, le sérum de souris sans germes a des niveaux réduits de 3-sulfate d'indoxyle, d'indolepropionate et de sérotonine (61). De plus, des études antérieures ont montré que dans les cellules rénales OAT 1- positives, le 3- sulfate d'indoxyle fonctionne dans la signalisation cellulaire en activant AhR et en régulant leur propre sécrétion via OAT1 (62). Nos découvertes selon lesquelles les métabolites dérivés de l'intestin étaient augmentés dans le sérum des souris Oat1 KO et Oat3 KO, ainsi que notre démonstration que certains sont des ligands in vitro, apportent un soutien supplémentaire à l'importance de ces transporteurs dans la régulation de la communication entre l'hôte et le commensal. organismes. Dans l'ensemble, nos résultats s'alignent sur la théorie de la télédétection et de la signalisation, qui propose que les transporteurs de médicaments et les enzymes métabolisant les médicaments participent à la communication interorganique et interorganique par le transport et la modification de petites molécules pour maintenir l'homéostasie (63, 64). Ainsi, il est essentiel de comprendre la gamme des fonctions physiologiques endogènes des transporteurs de médicaments de manière systémique et locale.

Avec des données métabolomiques améliorées, nous avons identifié des métabolites impactés par l'absence d'OAT1 et d'OAT3 dans des modèles de rongeurs et des métabolites impactés par l'inhibition d'OAT1 et d'OAT3 chez des humains traités avec des médicaments inhibiteurs d'OAT. Notre groupe a déjà utilisé des réseaux de reconstruction métabolique pour prédire la fonction métabolique et a signalé plusieurs voies partagées et uniques régulées par OAT1 et OAT3 (43, 65). Cependant, ces études étaient limitées par les premières versions des outils de reconstruction et très peu de données métabolomiques. Ici, en utilisant une approche différente, l'analyse des tâches métaboliques a mis beaucoup plus l'accent sur le rôle de l'OAT1 dans le métabolisme intracellulaire du tryptophane duun rein. Notre approche peut être appliquée pour étudier les fonctions endogènes d'autres membres de la famille SLC et ABC et construire des réseaux séparés mais qui se chevauchent pour tous ces transporteurs de médicaments, qui se trouvent non seulement chez les souris, mais aussi chez les souris et les vers (20, 66). De telles représentations faciliteront également la compréhension de toute l'étendue des DMI pour les médicaments interagissant avec OAT1, OAT3 ou les deux, qui vont probablement au-delà de la simple compétition au niveau du transporteur.

Procédures expérimentales

Animaux

Tous les protocoles expérimentaux impliquant l'utilisation d'animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'UCSD (IACUC). Tous les animaux ont été manipulés conformément aux directives institutionnelles sur l'utilisation d'animaux vivants pour la recherche. Les mâles adultes WT, Oat1 KO et Oat3 KO ont été logés séparément sous un cycle lumière-obscurité 12-h et ont eu accès à volonté à la nourriture et à l'eau. Ces animaux ont été décrits dans des publications antérieures (26, 27). Les souris traitées au probénécide ont reçu une injection intrapéritonéale quotidienne de 200 mg/kg de probénécide ou de PBS pendant 3 jours avant le sacrifice. La dernière injection a été administrée 2 h avant le sacrifice. Les ensembles de données utilisés pour cette analyse ont également été partiellement décrits (23, 24). L'ensemble de données Oat1 KO a été en partie étudié d'un point de vue chimioinformatique, mais une analyse détaillée des voies n'a pas été effectuée (23). L'ensemble de données Oat3 KO a été réanalysé et seuls deux groupes ont été comparés (24).

Études humaines avec le probénécide

Tous les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Comité d'examen institutionnel et respectent la Déclaration des principes éthiques d'Helsinki. Des échantillons de sang total ont été prélevés sur 20 individus (14 femmes, six hommes). L'âge moyen était de 30,85 ± 10,98 et l'IMC moyen était de 24,18 ± 3,52. Participants qui ne prenaient aucun médicament et suivaient un régime végétarien pendant toute la durée de l'étude. Une dose orale de 1 gramme de probénécide a été administrée et après 5 h, du sang total a été prélevé à nouveau. Chaque échantillon a été conservé congelé à -80 degrés jusqu'à l'analyse métabolomique.

Métabolomique Des échantillons de sérum humain ont été immédiatement stockés à -80 degrés et expédiés sur de la neige carbonique à Metabolon Inc. Des échantillons de sérum de souris ont été collectés et analysés, comme décrit précédemment (23, 24). Pour récapituler brièvement, pour chaque échantillon, un profilage métabolomique ciblé a été réalisé par Metabolon Inc. Le système MicroLab STAR de Hamilton Company a été utilisé pour préparer chaque échantillon, et plusieurs normes de récupération ont été ajoutées pour le contrôle de la qualité. Le sérum a été précipité avec du méthanol et agité avec Glen Mills GenoGrinder 2000 pour éliminer les protéines du sérum et libérer les molécules liées à ces protéines. La solution résultante a été séparée en quatre échantillons plus petits. Deux ont été analysés par spectrométrie de masse (MS) par chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) en phase inverse (RP) avec ionisation électrospray en mode ion positif (ESI). Un échantillon a été analysé par RP/UPLC-MS/MS avec ESI en mode ion négatif. Un échantillon a été analysé par HILIC/UPLC-MS/MS. Le solvant organique a été éliminé en plaçant chaque échantillon sur un TurboVap (Zymark).

Statistiques

Pour les échantillons humains et de souris, les valeurs brutes ont été normalisées au volume, transformées en log et les valeurs manquantes ont été remplacées par la valeur observée la plus faible pour chaque composé. Dans les échantillons de sérum humain, la signification statistique a été déterminée à l'aide de contrastes ANCOVA qui intègrent l'IMC et l'âge. Pour les échantillons de sérum de souris, la signification a été déterminée à l'aide du test t à deux échantillons de Welch avec des métabolites qui ont atteint une signification statistique (p inférieur ou égal à 0.05), ainsi que ceux approchant la signification ( 0.05 Inférieur ou égal à p Inférieur ou égal à 0,10) inclus dans les analyses ultérieures. L'enrichissement a été déterminé à l'aide de l'équation 1, où k est le nombre de métabolites significativement modifiés dans une sous-voie, m est le nombre de métabolites dans une sous-voie, n est le nombre de métabolites significativement modifiés dans l'ensemble de données total et N est le nombre de métabolites mesurés dans l'ensemble de données total.

Analyse des tâches métaboliques

Nous avons utilisé l'analyse des tâches métaboliques, telle qu'implémentée dans le module CellFie de GenePattern, pour quantifier lareinsles fonctions métaboliques et l'influence des altérations du transporteur OAT à partir des données d'expression génique (41) (c. Cette analyse prédit l'activité d'une collection organisée de centaines de tâches couvrant sept activités métaboliques majeures d'une cellule (génération d'énergie, nucléotide, glucide, acide aminé, lipide, vitamine et cofacteur, et métabolisme des glycanes) directement à partir de données transcriptomiques en utilisant le génome- modèles réduits du métabolisme humain. Plus précisément, le calcul de l'activité relative d'une tâche métabolique (c'est-à-dire le score de la tâche métabolique) repose d'abord sur le prétraitement des données transcriptomiques disponibles et l'attribution d'un score d'activité génique pour chaque gène (67). Le modèle du métabolisme humain à l'échelle du génome est en outre utilisé pour identifier la liste des réactions nécessaires pour accomplir chaque tâche métabolique et, ce faisant, pour identifier la liste des gènes qui peuvent contribuer à l'acquisition d'une fonction métabolique basée sur les règles GPR (c'est-à-dire , règles de réaction génique protéique). Par conséquent, le score de la tâche métabolique est calculé comme le score d'activité moyen de tous les gènes contribuant à une fonction métabolique. Ce faisant, les données transcriptomiques peuvent être directement utilisées pour quantifier l'activité relative de chaque fonction métabolique dans une condition spécifique.

Essais de transport in vitro

Embryonnaire humainun rein(HEK)-293 des cellules qui surexpriment de manière stable l'OAT1 et l'OAT3 humaines (Solvo Biotechnology) ont été cultivées jusqu'à confluence dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (Invitrogen) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine et maintenues dans 5 pourcentage de CO2 à 37 C. Les cellules exprimant l'OAT1- ont été sélectionnées en présence de blasticidine, et les cellules exprimant l'OAT3- ont été sélectionnées en présence de puromycine. Les deux lignées cellulaires ont été testées négatives pour la contamination par Mycoplasma. Avant les tests fonctionnels, les cellules ont été étalées sur des plaques à puits 96-, incubées pendant 24 h et complétées avec du milieu. Des expériences d'absorption compétitive ont été réalisées en incubant des cellules dans une solution tampon avec une concentration fixe de 10 μM6-carboxyfluorescéine et une concentration diluée en série du substrat proposé commençant à 2 mM. Le tampon a été retiré après une incubation de 10- minutes à température ambiante et les cellules ont été rincées trois fois avec du DPBS. La fluorescence FL a ensuite été évaluée à l'aide d'un lecteur de plaques fluorescentes FL. Les valeurs IC50 ont été déterminées à l'aide de GraphPad Prism 8.

Les valeurs d'intensité fluorescente ont été normalisées afin que la valeur la plus basse soit définie sur 0 % et la valeur la plus élevée sur 100 % . Après normalisation, les données ont été ajustées à un modèle non linéaire et l'IC50 a été déterminée à l'aide de l'équation 2.

Ki a ensuite été calculé pour chaque métabolite à l'aide de l'équation de Cheng – Prusoff (équation 3), avec le Km pour les cellules hOAT1 HEK293 dérivé d'expériences précédentes (68).

Disponibilité des données

Toutes les données métabolomiques pertinentes sont contenues dans l'article et le matériel supplémentaire. Les données transcriptomiques sont disponibles sur demande auprès de snigam@health.ucsd.edu. hypothèse, supervisé le projet, conçu les expériences, et rédigé et édité l'article.

Financement et informations supplémentaires—Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (NIH) à SKN de l'Institut national des sciences médicales générales (NIGMS) (R01GM132938). Le soutien de JCG provient de la bourse de formation accordée par l'Institut national d'imagerie biomédicale et de bioingénierie (NIBIB) (T32EB009380) et d'un complément au R01GM132938. Ce travail a été financé en partie par un financement généreux du NIGMS à NEL (R35GM119850), de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses (NIAID) à NEL (UH2AI153029), une bourse LIFA à AR et une bourse à JMG du gouvernement du Mexique ( CONACYT) et l'Institut de l'Université de Californie pour le Mexique et les États-Unis (UC-MEXUS). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles du NIH. Certains chiffres ont été générés à l'aide de Biorender. Cet article est dédié à la mémoire de Vibha Bhatnagar, MD, MPH.

Les conflits d'intérêts—Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêt avec le contenu de cet article.

Abréviations- Les abréviations utilisées sont : AhR, récepteur d'aryle hydrocarbure ; MRC, chroniqueun reinmaladie; DMI, interaction médicament-métabolite ; ESI, ionisation par électrospray ; HEK, embryon humainun rein; ILA, acide indole acétique; KO, KO ; RP/UPLC/MS, chromatographie liquide ultra-performante en phase inverse–spectrométrie de masse.

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Du 1Department of Bioengineering, 2Department of Pediatrics, 3Department of Biology, 4Division of Biostatistics and bioinformatics, Department of Family Medicine and Public Health, 5Department of Family and Preventative Medicine, 6NovoNordisk Foundation Center for Biosustainability at UC San Diego, and 7Department of Medicine, Université de Californie San Diego, La Jolla, Californie, États-Unis

par Mike Shipston

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