Contrôle réglable médié par CRISPRi du niveau d'expression génique avec un ARN à guide unique modifié chez Escherichia Coli

ABSTRAIT

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-plier). Ces sgRNA ont également permis une régulation modulaire avec diverses séquences d’ADN cibles. Nous avons appliqué ce système pour redistribuer le flux métabolique afin de produire des dérivés de violacéine dans un rapport prévisible et d'optimiser la production de lycopène. Ce système contribuerait à accélérer les processus d’optimisation des flux en ingénierie métabolique et en biologie synthétique.

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INTRODUCTION

Le système CRISPR (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) de type II est un système de clivage de l'ADN guidé par l'ARN composé d'ARN CRISPR (ARNc), d'ARN CRISPR transactivant (tracrRNA) et d'une protéine Cas9 (1 ,2). Cas9 de Streptococcus pyogenes a été largement utilisé en ingénierie du génome en raison de ses propriétés bien caractérisées (3,4). Le complexe de la protéine spCas9, du tracrRNA et du crRNA se lie et clive le protospacer d'ADN cible complémentaire à la séquence d'espacement de 20 nucléotides (nt) du crRNA en présence du motif adjacent au protospacer 5'-NGG-3' (PAM ) séquence (5,6). Pour simplifier le système, un ARN guide unique chimérique (sgRNA) dans lequel le crRNA et le tracrRNA sont reliés par un lieur artificiel appelé tetraloop peut être utilisé (5). Il permet de remplacer deux ARN distincts par une seule molécule d’ARN, ce qui rend le système plus gérable. L'un des systèmes basés sur CRISPR, l'interférence CRISPR (CRISPRi), utilise un Cas9 catalytiquement inactif (dCas9) en remplaçant certains acides aminés de chaque domaine endonucléase (7). Cette modification crée un complexe ribonucléoprotéique (RNP) qui peut se diriger et se lier à l'ADN cible et interférer avec l'ARN polymérase (RNAP) pour inhiber l'initiation ou l'élongation de la transcription (7). Contrairement à un knock-out par le système CRISPR/Cas9, CRISPR permet l'inactivation réversible de gènes en exprimant dCas9 ou sgRNA sous un promoteur inductible, permettant plus de flexibilité dans la régulation des gènes (7). Le système CRISPRi a effectivement réduit au silence les gènes cibles des centaines de fois (7,8). La répression génique spécifique à une cible permet un phénotypage à haut débit à l'aide d'un pool d'ARNsg à l'échelle du génome (9) ou redirige le flux de carbone des bactéries modifiées vers le produit chimique cible (10-12). De plus, le multiplexage CRISPRi a été démontré chez divers hôtes en utilisant diverses méthodes pour exprimer de manière stable plusieurs sgARN, notamment de longues matrices d'ARNcr, l'intégration de commutateurs de maintien et des matrices de sgARN extralongues non répétitives (13-16). Ces techniques d'inhibition simultanée de plusieurs gènes ont été utilisées pour effectuer des tâches plus complexes, telles que la réduction des intermédiaires toxiques ou le blocage de voies concurrentes dans la fermentation bactérienne (13, 16-19). Cependant, une répression complète n’est pas toujours souhaitable pour l’ingénierie métabolique. Les niveaux d’expression des gènes doivent être contrôlés avec précision pour obtenir une activité enzymatique optimale entre les voies de croissance et de production, en équilibrant les concentrations de précurseurs intracellulaires et en évitant l’accumulation d’intermédiaires toxiques (20-22). Diverses techniques ont été développées pour concevoir l’efficacité de la répression de CRISPRi. Plusieurs facteurs ont été manipulés, comme la quantité de sgRNA et de protéine dCas9 ou le choix du sgRNA. Contrôler l'expression de dCas9 ou l'expression à la fois de dCas9 et de sgRNA à l'aide d'un promoteur inductible régulait l'expression du gène cible de plus de 30- fois ou 300- fois, respectivement (23,24). Cependant, il a été observé que la modulation de la concentration de dCas9 peut conduire à des efficacités de répression incohérentes sur différents protospaceurs (23). Le nombre limité de promoteurs inductibles disponibles rend également la conception difficile malgré de nombreux efforts (25). Une autre stratégie consiste à insérer un aptamère d’ARN spécifique du ligand dans le sgARN, où une petite molécule apparentée peut exposer l’espaceur, permettant ainsi un contrôle dépendant de la dose de CRISPRi (26). Le sgRNA spécifique du ligand est utile si une paire ligand-aptamère appropriée est disponible. La distance du site d'initiation de la transcription et l'orientation de la liaison de dCas9 affectent également l'efficacité de CRISPRi (7). L'ajustement de la distance entre le site de liaison du sgARN et le site d'initiation de la transcription peut optimiser la voie de l'ingénierie métabolique (17,27,28). L'efficacité de l'hybridation entre les séquences espaceur et protospaceur modifie également l'efficacité de liaison du complexe RNP (29-31). Par conséquent, des mésappariements conçus en dehors de la région de départ pour modifier l’énergie libre ont été introduits afin de diversifier l’efficacité de CRISPRi (31,32). Cependant, la conception du sgRNA est nécessaire pour chaque nouvelle séquence cible, et il peut être difficile d’obtenir une différence significative en énergie libre grâce à un seul décalage. De plus, il existe une possibilité de liaison hors cible accrue (33). Néanmoins, elle se limite encore à réprimer avec précision plusieurs expressions géniques de manière modulaire, quelle que soit la séquence cible. Dans cette étude, nous avons développé un système CRISPRi réglable qui régule l’expression des gènes avec une grande précision et prévisibilité. Grâce au tri cellulaire itératif basé sur la fluorescence de la bibliothèque de sgRNA ciblant le tétraloop et sa région adjacente, nous avons atteint des efficacités de répression transcriptionnelle jusqu'à 45- fois même lorsque l'ADN cible est modifié. Ce système permet une redistribution prévisible des flux métaboliques sans manipuler le génome de l’hôte ni les voies de synthèse, constituant ainsi un outil prometteur pour optimiser les voies métaboliques.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Souches bactériennes, plasmides et réactifs

Les souches d'Escherichia coli et les plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau supplémentaire S1. Les amorces utilisées dans cette étude sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S2. Les procédures de clonage sont décrites dans les méthodes supplémentaires. Les gènes cibles et leurs séquences d'ADN cibles pour le système CRISPR sont présentés dans le tableau supplémentaire S3. Mach1-T1R a été utilisé pour le clonage général. La bibliothèque a été construite en utilisant NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB). Les cultures de routine pour la construction de plasmides et de souches ont été réalisées à 37°C dans un bouillon Luria-Bertani (LB) ou sur une plaque de gélose LB contenant des antibiotiques appropriés (34 g/ml de chloramphénicol, 50 g/ml de spectinomycine). La PCR a été réalisée à l'aide de l'ADN polymérase haute fidélité (NEB) Q5®. Les plasmides et les produits de PCR ont été purifiés à l'aide du kit GeneAll® Exprep™ Plasmid SV et du kit Gel SV (GeneAll Biotechnology). Efficacité de la répression des mutants sgRNA Le milieu de culture nocturne a été rafraîchi à une DO600 de 0,05 et incubé jusqu'à ce qu'il atteigne une valeur comprise entre 0,6 et 0,8. Le milieu de culture a ensuite été dilué à une DO600 de 0,05 avec 20 ng/ml d'aTc et incubé pendant 4 h. La fluorescence d'une seule colonie a été mesurée à 575 nm/616 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques Hidex Sense (Hidex) et la valeur OD600 a été déterminée à l'aide du spectrophotomètre Jenway 7300 (Jenway). La fluorescence relative a été calculée en unités de fluorescence par valeur OD600, la valeur pour PC étant fixée à 100 %.

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Criblage de bibliothèques d'ARNsg

La même méthode culturelle que celle décrite ci-dessus a été utilisée. Le milieu de culture a été dilué à [cellule]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

Extraction d'ARN

L'ARN total a été extrait à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen) uniquement lorsque le kit miRNeasy Mini (Qiagen) pour la quantification du sgARN, après traitement avec le réactif bactérien RNAprotect (Qiagen) et stockage à –80 °C. La digestion de l'ADN sur colonne à l'aide de RNase-Free DNase Set (Qiagen) a été réalisée pendant le processus d'extraction. La contamination de l'ADN a été vérifiée par PCR sans transcription inverse. La concentration et la pureté de chaque échantillon ont été déterminées à l'aide d'un NanoDrop One (Thermo Scientific) et la qualité a été évaluée à l'aide d'un LabChip DNA 5K/RNA/CZE 24 (PerkinElmer) sur un LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).

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Analyse RT-qPCR

Les amorces pour RT-qPCR provenaient soit du stock de laboratoire, soit conçues à l'aide de l'outil Primer3Plus (34) et répertoriées dans le tableau supplémentaire S4. Le gène CysG a été utilisé comme gène de référence (35) pour toutes les expériences RT-qPCR. Une courbe standard a été générée en diluant 10-fois un modèle de 107 copies/l à 10−1 copies/l. La limite de quantification a été déterminée en ajustant le nombre de copies et le taux d'amplification positif à une fonction sigmoïde et en calculant la valeur du nombre de copies positives à 95 %. La plage dynamique linéaire a été définie comme le nombre de copies le plus bas auquel la variation Cq rétro-calculée est inférieure à 35 %. Les valeurs Cq supérieures à 30 ou celles non amplifiées dans le contrôle sans modèle ont été validées. Les données de courbe standard sont disponibles dans le tableau supplémentaire S5 et la figure supplémentaire S1. Un total de 2,5 ng d'ARN total a été utilisé dans une réaction RT-qPCR de 10 litres avec le kit Luna® Universal One-Step RT-qPCR (NEB). La RT-PCR a été réalisée en triple sur le système StepOnePlus ™ RealTime PCR (Applied Biosystems) avec les étapes suivantes: (i) transcription inverse à 55 ° C pendant 10 min, suivie d'une dénaturation à 95 ° C pendant 1 min; (ii) 40 cycles thermiques à 95◦C pendant 10 s et 60◦C pendant 1 min ; (iii) analyse de la courbe de fusion à 95◦C pendant 15 s et 60◦C pendant 1 min, suivie d'une rampe de 60◦C à 95◦C à une vitesse de 0,3◦C/min. La quantification relative de l'ARN a été déterminée à l'aide de la méthode delta-deltaCt (36) et analysée avec le logiciel StepOnePlus™ (Applied Biosystems).

Séquençage d'ARN (RNA-seq) et analyse de données

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 basé sur FPKM (Fragments par kilobase de transcriptions par million de lectures mappées). Des gènes différentiellement exprimés ont été obtenus à partir du seuil de 1,5 (basé sur le log2-) et de 0,01 (valeur q).

Production et échantillonnage de proviolacéine et de prodéoxyviolacéine

Pour la production de violacéine et de prodésoxyviolacéine, la composition de milieu suivante a été utilisée : 10,7 g/l K2HPO4, 5,2 g/l KH2PO4, 1 g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}},2 g/l d'extrait de levure et 1{{20}} g/l de glucose. Un milieu de culture pendant la nuit a été rafraîchi à une OD600 de 0,1 et cultivé jusqu'à ce que la OD600 atteigne entre 0,6 et 0,8. Le milieu de culture a ensuite été dilué à une DO600 de 0,1 et complété avec 500 ng/ml d'atc, 0,05 mM d'IPTG et 0,1 g/l de L-tryptophane jusqu'à un volume final de 5 ml. 300 l de milieu de culture ont été échantillonnés et centrifugés à 14 000 tr/min pendant 5 min pour obtenir un culot cellulaire pour l'analyse HPLC, et 300 l de milieu de culture ont été échantillonnés pour l'extraction de l'ARN.

Analyse HPLC

Pour l'analyse de la voie biosynthétique de la violacéine, le culot cellulaire a été remis en suspension dans un volume de méthanol de {{0}}, soniqué pendant 5 min, centrifugé et filtré à travers un filtre en nylon de 0, 22- m. L'analyse HPLC a suivi la méthode (42) avec une colonne Poroshell 120 EC-C18, 4,6 × 150 mm, 4 m (Agilent). Deux phases mobiles, A avec 0,1 % d'acide formique dans du DDW et B avec 0,1 % d'acide formique dans de l'acétonitrile, ont été utilisées à un débit de 0,6 ml/min avec le profil de gradient suivant : 95 % A pendant 1,5 min, rampe A à partir de 95. % à 2 % pendant 4 min, en maintenant 2 % A pendant 2 min, en augmentant A de 2 % à 95 % pendant 30 s et en maintenant 95 % A pendant 10 min. Les échantillons ont été détectés à l'aide d'un détecteur PDA et la zone HPLC a été déterminée à 600 nm pour la violacéine et à 610 nm pour la prodésoxyviolacéine.

Production et échantillonnage de lycopène

Pour la production de lycopène, la composition de milieu suivante a été utilisée : 13,56 g/l de Na2HPO4, 6 g/l de KH2PO4, 2 g de NH4Cl, 1 g de NaCl, 2 ml de MgSO4 1 M, 0, 1 ml de CaCl2 1 M et 4 g/l de glucose (22). 27 g/ml de chloramphénicol et 50 g/ml de spectinomycine ont été utilisés. Un milieu de culture d'une nuit a été rafraîchi à une DO600 de 0,1 pour un volume final de 5 ml. Lorsque la OD600 atteignait entre 0,5 et 0,6, de l'aTc était ajouté à la concentration finale de 500 ng/ml, et lorsque la OD600 atteignait entre 0,9 et 1, de l'IPTG était ajouté à la concentration finale de 0,02 mM. Le lycopène a été extrait à l'aide d'acétone, comme décrit dans la référence (22). La concentration de lycopène a été obtenue à partir de l'absorbance à 475 nm en utilisant un spectrophotomètre Jenway 7300 en utilisant une courbe standard. 300 l de milieu de culture ont été échantillonnés pour l'extraction de l'ARN.

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RÉSULTATS ET DISCUSSION

Les effets des mutations du sgRNA sur l’efficacité de la répression du système CRISPR

Le système CRISPRi peut réprimer l’expression des gènes lorsque le complexe ternaire dCas9 – sgRNA – ADN se lie fortement. Nous avons émis l'hypothèse que l'efficacité de la répression du système CRISPRi pourrait être modifiée jusqu'à un certain niveau en modulant la formation du complexe RNP. Pour quantifier l'efficacité de la répression du système CRISPR, nous avons conçu un système de rapport de fluorescence basé sur le circuit génétique dans lequel le dCas9 de S. pyogenes est induit par l'anhydrotétracycline (aTc), et les variantes du gène rapporteur (mCherry) et du sgRNA sont exprimées de manière constitutive (Figure 1A). Une fois l'aTc ajouté dans le milieu, le complexe ternaire dCas9 – sgRNA – ADN bloque la transcription du gène rapporteur et le niveau de fluorescence indique inversement l'efficacité de la répression du système CRISPR. Le sgRNA contient 96 nucléotides (nts) au total. La région espaceur (les 20 premiers nts) se lie à la séquence d’ADN cible et les 76 autres nts contribuent à la formation et à la stabilité du complexe. Étant donné que les mésappariements dans la région d'espacement peuvent perdre leur spécificité et augmenter les effets hors cible dans le système basé sur CRISPR (33, 43), la longueur maximale du sgARN pouvant être modifié est de 76 nts. Dans ce cas, une taille de bibliothèque de 476 (environ 1 045) devrait être obtenue, mais elle est trop grande pour être construite. Ainsi, il est nécessaire de réduire la taille de la bibliothèque en déterminant des positions spécifiques sur le sgRNA. Nous avons d’abord étudié comment les mutations du sgRNA dans chaque région affectent la répression dans le système CRISPR. Une étude précédente a rapporté que des mutations dans la tige-boucle 1 (sg mut01 et sg mut02) entraînaient une diminution significative de l'activité nucléase de Cas9, tandis que les mutations dans la tige-boucle 2 (sg mut03) ou la tige-boucle 3 (sg mut04) n’a pas affecté son activité (44). Un sgRNA reconstruit (sg mut05) contenant des mutations dans la région tige-boucle 1 et les régions répétition, tétraboucle, anti-répétition et tige-boucle 2 ont également diminué l'activité nucléase (44). Cependant, dans le système CRISPRi, les cinq variantes de sgRNA ont eu peu d'effet sur l'efficacité de la répression par rapport au sgRNA de type sauvage (sg WT), chaque variante présentant un niveau de fluorescence de 2 à 4 % par rapport au contrôle positif sans région d'espacement ( sg PC) (figure 1B). Ces résultats suggèrent que la formation du complexe dCas9 – sgRNA est moins sensible à la modification de séquence dans la région tige-boucle 1 du système CRISPRi, contrairement au système CRISPR/Cas9. Nous avons émis l’hypothèse que la suppression des régions liées à la stabilité du complexe peut être un point de départ pour contrôler davantage l’expression à plusieurs niveaux. À cette fin, nous avons construit un sgRNA tronqué (sg trcSL1) dépourvu du lieur, de la tige-boucle 2 et de la tige-boucle 3. Ce sgRNA tronqué a un nombre minimal de composants et il a été démontré qu'il réduisait considérablement l'activité nucléase dans le CRISPR/ Système Cas9 (5,44). Lorsqu'il a été testé dans le système CRISPRi, ce mutant défectueux a présenté un niveau de fluorescence de 8 % par rapport au sg PC, ce qui suggère qu'il pourrait toujours se lier à dCas9 et réprimer le gène d'intérêt à un certain niveau même avec une stabilité complexe ternaire réduite (Figure 1B). L'analyse structurelle du complexe RNP suggère que les régions de liaison, tige-boucle 2 et tige-boucle 3 du sgRNA sont responsables de la stabilisation du complexe grâce à leurs interactions avec le domaine nucléase de dCas9, ce qui conduit à une diminution significative de l'indel. efficacité dans le système CRISPR/Cas9 (44). En revanche, la région répétition : anti-répétition et la tige-boucle 1 du sgARN interagissent principalement avec le domaine de reconnaissance et le domaine d'interaction PAM de dCas9 et n'affectent pas de manière significative l'efficacité indel dans le système CRISPR/Cas9 (44). Ce résultat conforte l'observation selon laquelle sg trcSL1 présentait une réduction significative de l'activité nucléase dans le système CRISPR/Cas9 tout en n'affectant que légèrement l'affinité de liaison dans le système CRISPRi.

Figure 1. Construction du système et effet sur l’efficacité de la répression par mutation du sgRNA. (A) Système à deux plasmides pour la quantification de l’efficacité de la répression. Un plasmide d'origine p15A contient le gène dCas9 sous un promoteur inductible par aTc et le gène mCherry sous un promoteur constitutif. L'autre plasmide d'origine cloDF13 contient un sgARN de type sauvage ou mutant sous un promoteur constitutif. (B) Fluorescence relative de chaque mutant sgRNA (sg mut01 ∼ sg mut05 et sg trcSL1) et sg WT par rapport à sg PC. +1 à + 20 sont la séquence d'espacement qui se lie au gène mCherry. sg PC : sgARN sans espaceur comme contrôle positif, sg WT : sgARN de type sauvage. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (n=3). Les valeurs P ont été déterminées par un test t non apparié. ns : non significatif, **P< 0.01

Variation de l'efficacité de la formation complexe pour un contrôle d'expression à plusieurs niveaux

Tetraloop est un lieur artificiel qui relie le crRNA et le tracrRNA dans le système CRISPR-Cas9 (5). La structure cristalline du complexe ternaire, composé de dCas9, crRNA et tracrRNA, a montré que le tétraloop et ses régions flanquantes 5 et 3 ont peu de contact avec dCas9 (44). Dans le même temps, les régions répéter: anti-répétition et tige-boucle 1 sont critiques pour le complexe fonctionnel (44). Comme il n'interagit pas directement avec dCas9, le tétraloop et ses régions adjacentes ont été explorés comme sites potentiels pour l'ingénierie du sgARN avec des composants supplémentaires, tels que l'incorporation de séquences d'aptamère pour recruter des protéines supplémentaires dans le sgARN (45, 46). Il est plausible que des mutations dans cette région puissent diversifier l'affinité de liaison entre le sgRNA et le dCas9 sans perturber complètement le complexe. Une bibliothèque aléatoire 12- mer (4 nt de la région tétraboucle et 4 nt de 5 et 3 régions flanquantes, respectivement) a été construite en utilisant sg trcSL1 comme modèle pour réduire encore l'efficacité de la formation complexe entre sgRNA et dCas9 (Figure 2A). ). Nous avons appliqué une stratégie de tri en deux étapes pour obtenir divers mutants sgRNA couvrant l'efficacité de la répression entre sg WT (état entièrement répressif) et sg PC (état non répressif). Nous avons divisé la bibliothèque originale en bibliothèques plus petites avec différentes plages d'intensité de fluorescence, puis avons identifié individuellement la fluorescence de chaque variant de sgRNA de la plus petite bibliothèque. La distribution de fluorescence de la bibliothèque originale obtenue par cytométrie en flux était presque identique à celle de sg PC (Figure 2B). Cependant, après trois étapes de tri consécutives, chaque bibliothèque (élevé, moyen et faible) présentait respectivement des niveaux de fluorescence médians de 63 %, 24 % et 14 % par rapport au sg PC (Figure 2B). Quatre-vingt-deux colonies ont été isolées de ces bibliothèques plus petites, avec des niveaux de fluorescence allant de 8 % à 104 % (Figure 2C). Ces résultats suggèrent que la mutation du tétraloop et de sa région flanquante du sgARN peut moduler l'affinité de liaison entre dCas9 et le sgARN pour diverses efficacités de répression. L'analyse par PCR quantitative par transcription inverse (RT-qPCR) de 10 mutants de sgARN (sg trcSL1c1 – sg trcSL1c10, tableau supplémentaire S6) avec divers signaux de fluorescence entre sg WT et sg PC parmi 82 colonies de sgARN a montré que les niveaux de fluorescence augmentaient linéairement avec l'augmentation des transcriptions de mCherry , indiquant que notre système CRISPRi contrôle l'expression des gènes au niveau transcriptionnel (Figure supplémentaire S2). Notre système CRISPRi réglable utilise des sgRNA modifiés, qui peuvent atteindre un contrôle de répression jusqu'à 45- fois supérieur, permettant un réglage fin de l'efficacité de la répression sans modifier les quantités de dCas9 ou de sgRNA. Un avantage notable de notre système est qu’il peut affiner l’efficacité de la répression grâce à des variantes spécifiques de sgRNA sans risque de conséquences inattendues, même si un clonage supplémentaire est nécessaire. De plus, la courbe de croissance suggère que notre système n'impose pas de charge cellulaire significative (Figure supplémentaire S3). En outre, l'ARN-Seq sur trois variantes de sg trcSL1 avec différents niveaux d'efficacité de répression a montré que l'expression de 51 à 83 gènes était modifiée, contrairement aux 262 gènes modifiés dans le sg WT (Figure supplémentaire S4). Ces résultats suggèrent que les variantes sg trcSL1 avaient des effets hors cible encore plus faibles que le système CRISPRi conventionnel. Cela est particulièrement pertinent dans les applications d’ingénierie métabolique, où l’optimisation des voies métaboliques implique souvent la manipulation de plusieurs gènes. La capacité d’affiner l’expression des gènes sans provoquer d’effets secondaires négatifs peut accélérer considérablement le processus d’optimisation et améliorer l’efficacité et la productivité globales du système.

Figure 2. Structure de la bibliothèque sgRNA et criblage de la bibliothèque. (A) échafaudage sgRNA utilisé dans cette étude. 12-mer contenant tetraloop et sa séquence flanquante est muté de manière aléatoire à partir de sg trcSL1 pour obtenir une bibliothèque de sgRNA. (B) Distribution de fluorescence obtenue par cytométrie en flux avant (à gauche) et après (à droite) le tri. Chaque distribution contient 100 000 cellules. (C) Fluorescence de colonies uniques obtenues à partir de (B). Les barres d'erreur indiquent l'écart type (n=2).

Effets de la quantité de dCas9 et de sgRNA sur l'efficacité de la répression

Étant donné que la modulation de la quantité de dCas9 ou de sgRNA pourrait modifier l’efficacité de la répression du système CRISPRi (23, 24), il est essentiel d’examiner l’impact de la quantité de dCas9 et de sgRNA sur l’efficacité de la répression. Nous avons testé les performances de notre système dans différentes conditions en modifiant les quantités de dCas9 et de sgRNA à l'aide de dix mutants de sgRNA (sg trcSL1c1 – sg trcSL1c10). Trois concentrations différentes (20, 100 et 500 ng/ml) de l'inducteur ont été utilisées pour l'expression de dCas9. Comparé au niveau d'ARNm dCas9 lorsque 20 ng/ml d'inducteur ont été utilisés, il a encore été augmenté de 15- fois (100 ng/ml) et de 22- fois (500 ng/ml) (Figure supplémentaire S5A). ). La surexpression de dCas9 suscite des inquiétudes, car un niveau élevé de dCas9 pourrait être toxique pour les cellules (47, 48) ou parfois non (49). Cependant, le taux de croissance a été réduit de moins de 10 % lorsque jusqu'à 500 ng/ml d'aTc ont été utilisés, selon les courbes de croissance à différentes concentrations d'inducteur (Figure supplémentaire S6). Cela suggère que la quantité de dCas9 n’a pas eu d’effet toxique sur E. coli dans les conditions testées. L'efficacité de la répression était légèrement modifiée lorsque la quantité différente de dCas9 était exprimée (Figure 3A). Il était cohérent avec une étude précédente que le système CRISPRi atteignait une efficacité de répression maximale à [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Figure 3. Caractérisation et modularité du système accordable CRISPRi. (A) Fluorescence relative sous différentes concentrations d’aTc (20, 100 et 500 ng/ml). (B) Fluorescence relative sous différents promoteurs (J23100 et UPJ23119). (C) Fluorescence relative sous différents protospaceurs. L'axe des x indique la fluorescence relative de mCherry et l'axe des y indique la fluorescence relative de lacI33-mCherry (rouge) et araC33-mCherry (bleu). 33 pb de séquences supplémentaires de lacI et araC ont été ajoutées à la 5-extrémité de mCherry (56). (D) Énergie libre de 12-mer et fluorescence relative. Les lignes pointillées indiquent un intervalle de prédiction de 95 % et les lignes pleines indiquent une ligne de régression. La valeur dG de sg trcSL1c2 n'a pas pu être obtenue à l'aide de mFold et a donc été exclue de l'analyse. (A – D) Toutes les barres d'erreur indiquent l'écart type (n=3).

Modularité du système accordable CRISPRi

Notre approche utilisant des variantes spécifiques de sgRNA pour maintenir un certain niveau d’expression pour un ADN cible a le potentiel d’être utilisée comme système modulaire. Pour démontrer la faisabilité du système CRISPRi réglable pour cibler différents protospacers, nous avons construit deux gènes de fusion (lacI{{0}}mCherry et araC33-mCherry) en ajoutant 33 pb de séquences de lacI et araC. à la 5 -fin de mCherry (56). Le génome d'E. coli BL21(DE3) (GenBank : CP001509.3) contient deux copies de la séquence protospacer pour lacI33- mCherry et une copie pour araC33-mCherry. Cependant, ces séquences chromosomiques n'ont pas de séquences PAM et ne peuvent donc pas être ciblées par le complexe dCas9-sgRNA (43). Lorsque les siARN ont été conçus pour cibler chaque protospacer, l’efficacité de la répression a été systématiquement maintenue pour tous les protospacers de lacI33, araC33 et mCherry (Figure 3C). Ces résultats suggèrent que notre système CRISPRi réglable peut réguler efficacement l'expression des gènes à un certain niveau, quelle que soit la séquence des protospaceurs. Une explication potentielle de la relation observée entre la formation du complexe RNP et l’efficacité de la répression est le changement d’énergie libre lors de la formation du complexe. Le lieur tétraloop artificiel et sa région flanquante contiennent deux paires de bases A: U et G: C Watson-Crick et une paire de bases A: G non Watson – Crick (44). Comme la liaison du crRNA et du tracrRNA est cruciale pour la formation du complexe, les mutations ciblant le tétraloop affecteraient l’affinité de liaison entre dCas9 et sgRNA. Cette affinité peut être calculée à partir de la différence d’énergie libre entre les états limités et non limités. Cependant, calculer l’énergie libre des états limités est un défi (57). Nous avons supposé que la structure globale et la stabilité de l'état limité ne changeaient pas puisque les sgRNA triés à partir de la bibliothèque ne perturbaient pas entièrement sa fonction. De plus, le tétraloop et sa région adjacente ont peu de contact avec dCas9 (44). Par conséquent, l’affinité de liaison entre dCas9 et sgRNA serait principalement affectée par la stabilité de la structure secondaire du tétraloop et de sa séquence flanquante. Sur la base de cette idée, nous avons calculé l'énergie libre du tétraboucle et de ses séquences flanquantes à l'aide du moule (58). La différence d'énergie libre de repliement due aux mutations est définie comme la différence entre l'énergie libre des séquences mutées et de type sauvage. Elle pourrait être directement calculée à partir de l'énergie libre de repliement des mutants puisque l'énergie de repliement de la séquence de type sauvage est constante à –4,3 kcal/mol. À mesure que l’énergie libre de repliement augmentait, le signal de fluorescence augmentait (Figure 3D). L'efficacité de la répression était la plus élevée lorsque l'énergie de repliement de la région contenant le tétraboucle était proche ou inférieure à 0 kcal/mol et diminuait linéairement à mesure que l'énergie de repliement dépassait 0 kcal/mol. Cette observation suggère que l'efficacité de la formation de complexes entre dCas9 et sgRNA est déterminée par la structure secondaire de la région tétraboucle, ce qui contribue à expliquer la modularité de notre système. L'efficacité de la répression de 85 sgRNA supplémentaires avec différentes séquences 12-mer de la bibliothèque a été mesurée pour valider davantage cette relation. Il a également montré la corrélation observée à partir des variantes sg trcSL1 (Figure 3D et tableau supplémentaire S7), suggérant que le lieur tetraloop joue un rôle crucial dans la formation du complexe RNP et que les mutations dans cette région peuvent avoir un impact sur l'efficacité du système CRISPR. De plus, cette relation montre la possibilité de concevoir par ordinateur des variantes de sgRNA avec l’efficacité de répression souhaitée.

Application d'un système CRISPRi accordable pour la redistribution des flux dans la voie biosynthétique de la violacéine chez E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-fold) par rapport à d'autres gènes lorsqu'il est calculé à partir des courbes standard. En revanche, l’expression d’autres enzymes non régulées dans la voie de la violacéine (vioA, vioB et vioE) est restée inchangée. Ces résultats suggèrent que notre système peut cibler et moduler spécifiquement l'expression de gènes individuels sans affecter les autres gènes de la voie. La quantification directe du PV et du PDV n’a pas été possible en raison du manque de normes disponibles dans le commerce pour l’analyse HPLC. Nous avons donc mesuré les titres en unités arbitraires en utilisant la surface du pic HPLC. Le titre du produit a atteint un maximum 8 heures après l'induction, puis a progressivement diminué (Figure supplémentaire S8), probablement en raison de la conversion du produit en d'autres produits secondaires, tels que les chromoviridans, par un mécanisme inconnu (42,64). Les pics mineurs observés sur le spectre HPLC indiquent la présence de produits secondaires mineurs supplémentaires. Des recherches antérieures ont démontré que le logarithme du titre de chaque produit en unités arbitraires pouvait être prédit par des combinaisons linéaires de la force du promoteur de chaque gène impliqué dans la voie de biosynthèse de la violacéine (42). Ce modèle de régression log-linéaire était également valide dans notre système, et une augmentation des transcriptions vioD était associée à une production accrue de PV (Figure 4B). On sait que l'ingénierie du promoteur ou 5 -UTR de chaque gène impliqué dans la voie de biosynthèse de la violacéine a permis la redistribution des flux et l'optimisation de la voie (65,66). Notre système pourrait fonctionner comme une méthode alternative illustrant le contrôle de la transcription sans manipuler les promoteurs impliqués dans la voie à l'aide de sgARN synthétiques, qui sont courts et peuvent être assemblés avec des méthodes en une seule étape. Le criblage via le système accordable CRISPRi permet de rediriger la voie avec un flux prévisible avant de manipuler directement les souches hôtes ou les cassettes de gènes, accélérant potentiellement le processus.

Application du système CRISPRi accordable pour équilibrer le flux de carbone chez E. coli producteur de lycopène

La production efficace de composés précieux en ingénierie métabolique nécessite d’équilibrer le flux de carbone. La voie du méthylérythritol 4-phosphate (MEP) est une voie métabolique qui utilise des précurseurs simples tels que le pyruvate et le glycéraldéhyde 3-phosphate (GAP) pour produire des éléments constitutifs des isoprénoïdes, du diméthylallyl pyrophosphate et du isopentényle pyrophosphate (67,68). . Ces molécules synthétisent le pyrophosphate de géranyle, qui est converti en pyrophosphate de farnésyle (FPP) (67,68). Le lycopène, un caroténoïde très apprécié doté de puissantes propriétés antioxydantes et de diverses applications dans diverses industries (69), est synthétisé à partir du FPP via une série de réactions enzymatiques à partir du crtE, du crtB et du crtI (Figure 4C) (22,70). Le précurseur GAP est essentiel non seulement pour la voie MEP mais également pour la voie de la glycolyse (22). Il a été démontré qu'une diminution de l'expression du gène gapA, qui code pour la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) dans la voie de la glycolyse, améliore la production de lycopène en augmentant le pool de GAP (22). Par conséquent, nous avons ciblé gapA avec cinq variantes, dont trois variantes de sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 et sg trcSL1c6) qui présentaient diverses efficacités de répression, sg PC et sg WT. Cependant, gapA est un gène essentiel qui ne peut pas être complètement détruit (71,72). Les tentatives visant à réprimer gapA avec CRISPRi conventionnel en utilisant sg WT ont échoué, même avec la faible fuite de dcas9 sous le promoteur tet (73). D'autre part, la répression à plusieurs niveaux de l'expression du gène gapA à l'aide du système accordable CRISPRi a été obtenue sans défaut de croissance et a entraîné une multiplication par 2,7- de la production de lycopène avec sg trcSL1c6 par rapport à une souche exprimant pleinement le gène gapA. après 15 h de culture (Figure 4D et Figure supplémentaire S9). Il a été rapporté que seulement 10 % de l'expression naturelle du gène gapA conduit à une augmentation du pool de GAP sans changement significatif des métabolites en aval dans la voie de la glycolyse, tels que le 2-phosphoglycérate et le 3-phosphoglycérate ( 22). Collectivement, ces résultats démontrent que CRISPRi réglable peut réprimer avec précision l’expression des gènes à plusieurs niveaux sans ingénierie chromosomique.

Figure 4. Application du système CRISPRi accordable pour la voie biosynthétique de la violacéine. (A) Voie de biosynthèse de la violaceine et construction du plasmide. Cinq gènes (vioA, vioB, vioC, vioD et vioE) responsables de la production de violacéine ont été clonés dans un plasmide exprimant dCas9-. Quatre produits principaux (violacéine, proviolacéine, désoxyviolacéine et prodésoxyviolacéine) sont fabriqués. sg WT pour vioC et cinq variantes de sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 et sg trcSL1c9) pour vioD, montrant différentes efficacités de répression, ont été clonées dans l'autre plasmide. Trp : L-tryptophane, V : violacéine, PV : proviolacéine, PDV : prodésoxyviolacéine, DV : désoxyviolacéine, PDVA : acide protodésoxyviolacéinique, PVA : acide protoviolacéinique. (B) Relation entre les transcriptions vioD, la fluorescence mCherry et le titre de PDV et PV. L’axe des x indique l’ARN vioD relatif obtenu à partir de RT-qPCR, l’axe des y à gauche indique la fluorescence relative de mCherry de la figure 3 et l’axe des y à droite indique le rapport de la zone HPLC. Les échantillons avec la valeur d'ARN vioD la plus élevée ont été réglés à 100 % pour la normalisation. (C) Voie de biosynthèse du lycopène et construction du plasmide. Trois gènes (crtE, crtB, crtI) responsables de la production de lycopène ont été clonés dans un plasmide exprimant dCas9-. gapA a été ciblé avec des variants sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) et sg PC a été cloné dans l'autre plasmide. Glc : Glucose, GAP : glycéraldéhyde 3-phosphate, 1,3-BPG : 1,3-bisphosphoglycérate, DMAPP : pyrophosphate de diméthylallyle, IPP : pyrophosphate d'isopentényle, FPP : pyrophosphate de farnésyle. (D) Relation entre les transcrits gapA, la fluorescence mCherry et la production de lycopène. L’axe des x indique l’ARN relatif obtenu à partir de RT-qPCR, l’axe des y à gauche indique la fluorescence relative de mCherry de la figure 3 et l’axe des y à droite indique le titre de lycopène. (B, D) Toutes les barres d’erreur indiquent l’écart type (n=3).

CONCLUSION

Nous avons conçu un système CRISPRi réglable capable de contrôler avec précision l'expression des gènes au niveau souhaité. En mutant le tétraloop et sa région flanquante, des sgARN synthétiques ciblant diverses séquences de protospaceurs pourraient réguler le gène à un certain niveau. Nous avons appliqué avec succès ce système pour rediriger le flux métabolique d’intérêt dans la voie de biosynthèse de la violacéine afin de produire des dérivés indole dans un rapport prévisible. De plus, nous avons montré que l'utilisation du CRISPRi réglable entraînait une multiplication par 2 de la production de lycopène, soulignant la polyvalence de notre système pour améliorer la production d'autres composés précieux. Ce système accélérerait les processus d'optimisation des flux avant de manipuler de manière permanente les informations génétiques de l'hôte, comme le remplacement du promoteur ou des séquences 5-UTR.

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