Le danegaptide prévient les dommages induits par le TGF 1- dans les cellules épithéliales du tubule proximal humain du rein
Mar 12, 2022
Résumé:Chroniquemaladie du rein(CKD) est un problème de santé mondial associé à un certain nombre de comorbidités. Des preuves récentes impliquent une libération accrue d'adénosine triphosphate (ATP) médiée par l'hémicanal dans la progression de la fibrose tubulo-interstitielle, la principale pathologie sous-jacente de l'IRC. Ici, nous évaluons l'effet du danegaptide sur le blocage des changements médiés par l'hémicanal dans l'expression et la fonction des protéines associées à la progression de la maladie dans l'épithélium tubulaireun reincellules. Les cellules épithéliales primaires du tubule proximal humain (hPTEC) ont été traitées avec l'isoforme beta1 du facteur de croissance transformant la cytokine pro-fibrotique (TGF 1) ± danegaptide. La qRT-PCR et l'immunotransfert ont confirmé l'expression de l'ARNm et des protéines, tandis qu'un réseau d'anticorps anti-cytokines a évalué l'expression/sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et profibrotiques. L'absorption du colorant carboxyflfluorescéine et la biodétection de l'ATP ont mesuré l'activité de l'hémicanal et la libération de l'ATP, tandis que la résistance électrique transépithéliale a été utilisée pour évaluer la perméabilité paracellulaire. Le danegaptide a annulé l'absorption du colorant carboxyfluorescéine et la libération d'ATP et a protégé contre les modifications protéiques associées aux lésions tubulaires. Le blocage de la libération d'ATP médiée par Cx43- s'est accompagné d'une restauration partielle de l'expression des inhibiteurs du cycle cellulaire, des adhérents et des protéines des jonctions serrées et d'une diminution de la perméabilité paracellulaire. De plus, le danegaptide a inhibé les changements induits par le TGF 1- dans l'expression et la sécrétion d'adipokines clés, de cytokines, de chimiokines, de facteurs de croissance et d'interleukines. Les données suggèrent qu'en tant que modulateur de jonction lacunaire et bloqueur d'hémicanal, le danegaptide a un potentiel dans le traitement futur de l'IRC.
Mots clés:danegaptide; connexine; hémicanal ; ATP; maladie rénale chronique; inflammation; fibrose; les hPTEC ; TGF1; rein, rénal
CISTANCHE AMÉLIORERA LES MALADIES RÉNALES/RÉNALES
Introduction
Chroniquemaladie du rein(CKD) est un problème de santé croissant associé à un risque accru de maladies cardiovasculaires et de morbidité [1]. Estimé affecter 10% de la population mondiale [2], les facteurs de risque comprennent l'âge, le diabète, l'hypertension, la dyslipidémie et l'obésité [3]. La maladie se caractérise par une diminution du débit de filtration glomérulaire (DFG), en plus d'une protéinurie, avec une glomérulosclérose, une atrophie tubulaire et une fibrose tubulo-interstitielle (TIF), qui sont des modifications histopathologiques courantes [4]. Culminant dans la perte de stabilité épithéliale, l'inflammation persistante et l'augmentation du dépôt de la matrice extracellulaire [5,6], le traitement du TIF et de l'IRC avancée représente un besoin clinique non satisfait [3]. Par conséquent, des approches thérapeutiques urgentes sont nécessaires. L'expression et la fonction altérées de la connexine (Cx) ont été impliquées dans la pathologie de diverses formes de la maladie (comme revu dans [7]), y compris l'IRC (comme revu dans [8,9]). Les connexines sont une famille de protéines membranaires qui s'oligomérisent en assemblages hexamères appelés connexons [10]. Lorsque les cellules voisines s'alignent, les connexons s'amarrent pour former des jonctions lacunaires, des pores continus à travers lesquels les molécules messagères peuvent être échangées, permettant une voie de communication directe [10]. Lorsqu'ils ne sont pas liés, les connexons forment des hémicanaux à travers lesquels des molécules, par exemple l'adénosine triphosphate (ATP), peuvent être libérées dans l'espace extracellulaire local pour influencer les cellules voisines via l'activation des purinorécepteurs [11]. L'expression du récepteur purinergique P2X7 (P2X7R) est régulée positivement dans lerénaltubules des personnes atteintes de diabètemaladie du rein[12] et a été fortement impliqué dans la progression de la fibrose à la fois dansun rein[13–17] et dans d'autres types de tissus [18–21]. Sans surprise, le ciblage de la signalisation purinergique a reçu une attention considérable. Cependant, à ce jour, les essais cliniques n'ont pas réussi à démontrer les effets bénéfiques de l'antagonisme P2X7R dans de nombreuses conditions inflammatoires, un effet peut-être associé à une variation génétique au sein du récepteur [22]. Le ciblage en amont de la libération d'ATP permettrait de contourner ces problèmes.
Les preuves établissent un lien entre l'expression et/ou l'activité aberrante des connexines et diverses formes d'IRC [12,23-26]. Les premières études d'Abed et al. ont rapporté que des souris hétérogènes (Cx43 plus /-), présentant une obstruction urétérale unilatérale (UUO), présentaient une réduction du dépôt de matrice extracellulaire (ECM) et une diminution de l'inflammation [27], tandis que le mimétique spécifique de Cx43-, GAP{{6} }, était capable d'inhiber l'adhésion des monocytes et atténuait l'expression du collagène I dans le modèle murin de transgène de la rénine (RenTG) de MRC rénine-dépendante [25]. Plus récemment, nous avons identifié que l'isoforme de connexine prédominante exprimée dans le tubule proximal, Cx43, est élevée dans le matériel de biopsie isolé d'individus atteints de néphropathie diabétique, une observation parallèle à une augmentation de la libération d'ATP médiée par l'hémicanal dans le primaire traité au TGFp 1- cellules du tubule proximal [12]. En évaluant l'impact des augmentations locales des concentrations d'ATP extracellulaire, nous avons déterminé qu'une communication aberrante médiée par Cx 43- initie le désassemblage des adhérents (par exemple, la E-cadhérine) et des complexes de jonction serrés (par exemple, la Zona Occludens) via l'activation de P2X7R. Ces effets, qui ont été annulés dans un modèle murin hétérogène Cx43 plus /- d'UUO [12], suggèrent un lien clair entre Cx43 et les lésions tubulaires. Alors que l'ablation partielle de Cx43 confirme le rôle des connexines dans l'initiation des changements phénotypiques de la lésion tubulaire, une intervention pharmacologique avec le peptide bloquant l'hémicanal Cx43 a établi que la nature protectrice de cette activité réduite de Cx43 découle de l'inhibition de la libération d'ATP médiée par l'hémicanal. L'utilisation de peptides mimétiques pour souligner la nature protectrice derrière le blocage de l'activité de l'hémicanal a été rapportée avec succès dans d'autres modèles de maladie, y compris la rétinopathie [28], la neuroinflammation [29], le gliome [30,31] et la dégénérescence maculaire liée à l'âge [32, 33]. En fin de compte, des études établissent un lien entre l'activité altérée de la connexine et l'augmentation de l'inflammation [34-36] et de la fibrose [37-40] et suggèrent que la stabilisation de la communication médiée par l'hémicanal et/ou la jonction lacunaire (GJIC) peut retarder l'apparition des dommages. observé dans divers modèles de blessure. Par conséquent, l'inhibition des hémicanaux des connexines offre un moyen intéressant de réduire l'inflammation et présente un intérêt thérapeutique considérable.
Le danegaptide ((2S, 4R)-1-(2-aminoacyl)-4-benzamidopyrrolidine2-acide carboxylique), également appelé ZP1609 ou GAP-134, est un petit dipeptide dérivé du rotigaptide (AAP10, ZP123). Développé à l'origine comme agent anti-arythmique [41], il interagit avec la Cx43 [42] et agit comme un puissant modificateur de la jonction lacunaire [43]. Le composé a démontré des propriétés protectrices et anti-arythmiques et a déjà montré des effets significatifs dans des modèles précliniques établis de lésions de reperfusion ischémique cardiaque [44,45]. Alors que les essais cliniques humains de phase 2 n'ont malheureusement pas atteint leur objectif [46], des études d'autres groupes ont exploré le potentiel thérapeutique du danegaptide dans d'autres types de tissus et modèles de maladie [41,47-49]. De plus, alors que son rôle dans la modulation de l'activité de l'hémicanal est peu connu, il a été démontré que le danegaptide réduit l'absorption de colorant médiée par l'hémicanal dans les cellules de gliome C6 [43]. Malgré cela, le rôle de ce composé dans le blocage de la libération d'ATP médiée par l'hémicanal dans d'autres types de tissus reste à confirmer.
CISTANCHE AMÉLIORE L'INSUFFISANCE RÉNALE/RÉNALE
L'étude actuelle a examiné l'efficacité du danegaptide pour annuler la libération d'ATP par hémicanal médiée par la connexine dans les cellules épithéliales du tubule proximal humain (hPTEC) traitées par le TGF 1- primaire, avant de définir son rôle protecteur contre l'expression et les changements fonctionnels couramment associés à la progression de la fibrose tubulo-interstitielle. En utilisant des techniques pour déterminer les changements d'expression (qRT-PCR, immunocytochimie, immunotransfert, réseaux d'anticorps) et de fonction (biodétection d'ATP, absorption de colorant, résistance électrique transépithéliale, réseaux d'anticorps), nos résultats démontrent que des concentrations nanomolaires de danegaptide bloquent l'ATP médiée par l'hémicanal Cx libérer et atténuer partiellement les changements induits par le TGF 1- dans l'expression des protéines du cycle cellulaire (par exemple, p16, p21, cycline D1) et des facteurs réno-protecteurs (par exemple, Klotho). De plus, le danegaptide diminue les changements souvent observés dans les lésions tubulaires, y compris le désassemblage des jonctions adhérentes (y compris une perte de E-cadhérine) et des jonctions serrées (y compris une perte de zona occludens 1 (ZO-1) et claudin 2). Il est important de noter que le réseau de profileurs de protéomes a démontré la capacité du danegaptide à restaurer les changements dans l'expression et la sécrétion des protéines clés de la matrice extracellulaire, des adipokines, des chimiokines et des facteurs de croissance induits par le TGF 1. Par conséquent, nos données in vitro suggèrent que le danegaptide (50–100 nM ) peut bloquer avec succès la libération d'ATP médiée par l'hémicanal dans les hPTEC primaires et protéger partiellement contre les changements associés à l'inflammation et à la fibrose, comme observé dans le stade avancé de l'IRC.
2. Résultats
2.1. Le danegaptide n'affecte pas la viabilité des cellules épithéliales tubulairesHumainun rein2 (HK2) ont été cultivées dans un milieu pauvre en glucose (5 mM) pendant 48 h, avant d'être privées de sérum pendant la nuit, puis traitées avec la concentration optimale de TGF 1 (10 ng/mL) [12,24] ± danegaptide (50 nM-1 µM) pendant 48 h (Figure 1A, n=3). Un test de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-bromure de diphényltétrazolium (MTT) a confirmé que ni le TGF 1 (101,9 ± 11,7 %) ni le danegaptide seul n'a altéré la viabilité cellulaire (95,2 ± 7 % (50 nM), 103 ± 5,7 % (100 nM) et 96,6 ± 5,3 % (1 µM)) par rapport aux témoins. Aucun effet n'a été observé lorsque les cellules traitées au TGF 1- ont été co-incubées avec du danegaptide (104,1 ± 2,2 % (50 nM), 93,4 ± 1,6 % (100 nM) et 89,3 ± 3,7 % (1 µM)). Pour corroborer ces données, un dosage du cristal violet (CV) et de la lactate déshydrogénase (LDH) a été réalisé. La libération de LDH dans les cellules traitées au TGF 1- était comparable à celle des témoins (109,3 ± 11,3 %) et la co-incubation avec le danegaptide n'a eu aucun effet supplémentaire (106,4 ± 11,6 % (50 nM), 113,9 ± 15,6 % (100 nM) et 113,2 ± 4,3 % (1 µM)). Comme prévu, le danegaptide seul n'a pas modifié de manière significative la libération de LDH par rapport aux témoins (104,4 ± 4,3 % (50 nM), 95,3 ± 4,7 % (100 nM) et 92,6 ± 3,3 % (1 µM)). La coloration cellulaire à l'aide de cristal violet a récapitulé ces résultats, les données pour TGF 1 (10 ng/mL; 96,9 ± 7,3 pour cent) et TGF 1 plus danegaptide (50 nM – 1 µM) étant comparables aux témoins (98,2 ± 1,9 pour cent (50 nM) , 97,5 ± 1,8 % (100 nM) et 85,8 ± 5,3 % (1 µM). Enfin, le danegaptide seul n'a pas modifié la coloration au cristal violet (98,3 ± 2,5 % (50 nM), 99,6 ± 2,7 % (100 nM) et 98,5 ± 2,2 % (1 µM) des témoins). À la lumière de ces données, une concentration de 50 à 100 nM a été sélectionnée pour les études ultérieures.
Figure 1. Le danegaptide empêche le TGF 1- a évoqué des augmentations de l'absorption de colorant médiée par l'hémicanal. Dans le panneau (A), humainun rein2 (HK2) cellules ont été cultivées dans du glucose faible (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (50, 100 et 1000 nM) pendant 48 h et la viabilité cellulaire a été évalué. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM (n=3). L'incubation avec TGF 1 (10 ng/mL ± danegaptide (50–1000 nM)) n'a pas modifié 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,{{ 19}} absorption de bromure de diphényltétrazolium (MTT), libération de lactate déshydrogénase (LDH) ou coloration au cristal violet (CV). Dans les panneaux (B) et (C), l'absorption de colorant de carboxyfluorescéine a été utilisée pour évaluer l'activité de l'hémicanal dans les cellules HK2 et les cellules épithéliales du tubule proximal humain (hPTEC), le degré de charge de colorant étant directement proportionnel à l'ouverture. Les cellules ont été cultivées dans du glucose faible (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (50 ou 100 nM) pendant 48 h. Le danegaptide a empêché le TGF 1- d'augmenter l'absorption du colorant carboxyflfluorescéine dans les cellules HK2 (panneau (B)) et les hPTEC (panneau (C)). Une charge de colorant minimale s'est produite dans les cellules témoins, tandis que la charge de colorant a augmenté de manière significative dans les cellules traitées avec le TGF 1. L'ajout de danegaptide (50 ou 100 nM) a réduit l'absorption de colorant, ramenant l'intensité de fluorescence FL aux niveaux de contrôle. L'intensité est exprimée en pourcentage par rapport aux témoins à faible teneur en glucose et est représentative de 3 expériences distinctes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (n=3), avec une signification clé indiquée (** p < 0,01,="" ***="" p="">< 0,001 ;="" anova="" unidirectionnelle="" et="" post-test="" de="">
2.2. Le danegaptide bloque le TGF 1-Modifications évoquées dans l'absorption de colorant médiée par l'hémicanal dans les cellules épithéliales tubulairesNous avons précédemment montré que le TGF 1 augmente l'activité de l'hémicanal médiée par Cx43- et la libération d'ATP par les cellules épithéliales des tubules proximaux [24]. Un test d'absorption de colorant carboxyflfluorescéine a été utilisé pour déterminer si le danegaptide peut annuler l'absorption de colorant induite par le TGF 1- à travers les hémicanaux dans les cellules HK2 et les hPTEC primaires. Comme prévu, le TGF 1 (10 ng/mL) a augmenté l'absorption du colorant à 354,9 ± 32,6 % des témoins dans les cellules HK2, tandis que la co-incubation avec le danegaptide (50 nM et 100 nM) a considérablement atténué la réponse à 165,5 ± 17,9 % et 147,6 ± 18,1 %, respectivement (Figure 1B ; p inférieur ou égal à 0,001, n=4). Le danegaptide seul n'a pas modifié l'absorption du colorant. L'absorption du colorant carboxyflfluorescéine a été augmentée par le TGF 1 (10 ng/mL) dans les hPTEC primaires (310,8 ± 38,6 % des témoins), une réponse partiellement annulée par la co-incubation du danegaptide (100 nM ; 145 ± 19,7 %) par rapport aux témoins (Figure 1C ; p inférieur ou égal à 0,01, n=4).
2.3. Le danegaptide annule la libération d'ATP induite par le TGF 1- dans les cellules HK2Déterminer si le danegaptide (5{{10}}–100 nM) pourrait empêcher la libération d'ATP induite par le TGF 1 (10 ng/mL) à partir des hémicanaux dans les cellules HK2, nous avons utilisé la biodétection de l'ATP [24,50]. TGF 1 (10 ng/mL) a augmenté la libération d'ATP de 0.33 ± 0.11 µM à 3.60 ± {{40} }.29 μM (Figure 2A,B,E ; p inférieur ou égal à 0.001), un effet partiellement annulé par le danegaptide à la fois à 50 nM (1,90 ± 0,26 μM ; p inférieur ou égal à 0,01 ) et 100 nM (0,79 ± 0,19 µM ; p inférieur ou égal à 0,001) (Figure 2D,E, n=3, six répétitions/nombre d'échantillons). Le danegaptide seul n'a pas affecté la libération d'ATP (Figure 2C,E), avec des niveaux d'ATP enregistrés à 0,35 ± 0,10 µM (50 nM) et 0,31 ± 0,09 µM (100 nM) par rapport aux témoins (Figure 2E).
2.4. Le danegaptide inverse les modifications induites par le TGF 1- dans les protéines du cycle cellulaire et un marqueur de la réno-protection dans les hPTECPour déterminer si le danegaptide peut annuler la régulation médiée par l'hémicanal du cycle cellulaire commun et des marqueurs réno-protecteurs, les hPTEC ont été incubées avec du TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) pendant 12 h et l'expression de l'ARNm du gène candidat évaluée par analyse qPCR. L'ajout de danegaptide aux hPTEC traitées au TGF 1- a renvoyé l'expression de p16 de 358,8 ± 21,1 % à 193 ± 18,5 % des témoins, l'expression de p21 de 221,8 ± 12,9 % à 142,2 ± 6,2 % et l'expression de la cycline D1 de 253,2 ± 7,7 pour cent à 132,9 ± 15,0 pour cent (Figure 3 ; p Inférieur ou égal à 0,001, n=3). De plus, le danegaptide a partiellement inversé la baisse de Klotho de 43,3 ± 3,8 % à 59,9 ± 11,7 % des témoins (Figure 3, n=3).
2.5. Le danegaptide restaure les modifications médiées par le TGF 1- dans les protéines adhérentes et de jonction serrée et la perméabilité paracellulaire dans les hPTECDans leun reinl'adhésion cellulaire médiée par la E-cadhérine réduite (ECAD) déclenche une série d'événements qui aboutissent à un phénotype intermittent associé à une transformation épithéliale-mésenchymateuse partielle. L'initiation facilite le désassemblage des adhérents et des complexes de jonctions serrées, aboutissant à une perte d'adhérence, une diminution de la communication intercellulaire des jonctions lacunaires et des épithéliums qui fuient [12, 24, 51]. Pour déterminer si le danegaptide peut annuler les changements médiés par le TGF 1- dans les protéines d'adhérence et de jonction serrée, les hPTEC ont été incubés avec du TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (10{{41 }} nM) pendant 48 h et l'expression des protéines candidates a été évaluée. Le danegaptide a partiellement restauré l'expression de la E-cadhérine de 33,3 ± 3,3 % à 89 ± 7,6 % des témoins, l'expression de la N-cadhérine (NCAD) de 224,4 ± 29,6 à 161,9 ± 27,4 % et l'expression de la vimentine de 212,9 ± 13 % à 147,3 ± 8,8 % ( Figure 4A ; p inférieur ou égal à 0.001, p inférieur ou égal à 0,01 et p inférieur ou égal à 0,001, respectivement ; n {{43} }). -l'expression de la caténine est restée inchangée par le bloqueur d'hémicanal de 149,2 ± 11,2 % (TGF 1 seul) à 151,6 ± 16,8 % (TGF 1 plus danegaptide, Figure 4B ; p=NS, n=3). L'évaluation des effets du danegaptide sur les protéines des jonctions serrées a confirmé que le modulateur de la jonction lacunaire restaurait partiellement l'expression de la claudine-2 de 44,5 ± 5 % à 74,6 ± 5 % des témoins et ZO-1 de 27,8 ± 11,3 pour cent à 52,8 ± 5,4 pour cent par rapport aux témoins (figure 4B ; p inférieur ou égal à 0,05, n=3). Des études examinant la résistance électrique transépithéliale ont confirmé que l'expression réduite des protéines des jonctions serrées observée avec le TGF 1 (10 ng/mL) s'accompagne d'une perte de résistance transépithéliale de 57,33 ± 1.86 Ω·cm2 à 10 ± 1,53 Ω· cm2 (p Inférieur ou égal à 0,001, n=3). Cette fuite accrue a été partiellement corrigée par la co-incubation avec le danegaptide (36 ± 2,08 Ω·cm2) (Figure 4C ; p inférieur ou égal à 0,001, n=3).
2.6. Le danegaptide prévient la 1-régulation à la hausse évoquée par le TGF des protéines de la matrice extracellulaire dans les hPTECcausée par un déséquilibre entre la formation et la dégradation, l'accumulation de l'ECM est une caractéristique majeure de l'IRC. Le rôle du TGF 1 dans ce processus est bien établi [52], et comprendre comment annuler ces changements a des implications claires sur la progression de la maladie. Pour examiner l'effet du danegaptide sur le TGF 1- a évoqué des changements dans l'expression des protéines ECM, les hPTEC ont été cultivées dans un milieu à faible teneur en glucose (5 mM) pendant 48 h, privées de sérum pendant la nuit et traitées avec du TGF 1 (1{{ 28}} ng/mL) ± danegaptide (100 nM) pendant 48 h. Par rapport aux témoins, TGF 1 a augmenté l'expression des protéines ECM collagène I (334,6 ± 30,14 pour cent), collagène IV (354,5 ± 16,9 pour cent), fibronectine (301,7 ± 50,4 pour cent) et laminine (324,8 ± 36,4 pour cent) (Figure 5A, B ; p Inférieur ou égal à 0,001, n=3). La co-incubation avec le danegaptide a significativement atténué ces changements, restaurant l'expression à 180,7 ± 27,3 % (collagène I), 164 ± 6,9 % (collagène IV), 161,3 ± 4 % (fibronectine) et 149 ± 20,4 % (laminine) (p Moins supérieur ou égal à 0,001 ; n=3 dans chaque cas). Le danegaptide (100 nM) a également réduit les changements évoqués par le TGF 1 (10 ng/mL) dans la kinase liée à l'intégrine 1 (ILK1) de 378,9 ± 16,8 % à 251,8 ± 33 % (p inférieur ou égal à 0,001) mais a eu un effet minimal sur la métalloprotéinase matricielle 3 (MMP3), réduisant l'expression de 185,3 ± 19,6 % avec la cytokine seule à 147,1 ± 12,2 % lorsqu'elle est co-incubée avec le danegaptide (Figure 5B)
2.7. Le danegaptide réduit les TGF 1-modifications évoquées dans l'expression des adipokines, des chimiokines, des facteurs de croissance et des interleukines des hPTEC
La réponse inflammatoire dans et autour des tubules proximaux implique à la fois l'activation de plusieurs types de cellules et la sécrétion de nombreux marqueurs inflammatoires. Plus précisément, les chimiokines solubles, les cytokines et les facteurs de croissance recrutent et activent les cellules immunitaires infiltrantes et stimulent les fibroblastes résidents. L'activation soutenue de ces cellules médie la fibrose tubulo-interstitielle. Nous avons utilisé le tableau de profilage du protéome pour déterminer si le danegaptide annule les changements induits par le TGF 1- dans l'expression et la sécrétion des principaux médiateurs proin-inflammatoires. Les hôtels primaires ont été cultivés, comme décrit ci-dessus, et traités avec TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) pendant 48 h. Une liste des changements dans le lysat (Figure 6) et le surnageant (Figure 7) est fournie pour 31 protéines candidates regroupées par fonction primaire.
3. Débat
En 2017, l'incidence mondiale de l'IRC était de 697,5 millions de cas, la maladie étant identifiée comme la 12e cause de décès dans le monde [53]. À ce jour, il n'existe pas d'options thérapeutiques curatives pour le stade terminalmaladie rénale(ESRD). De plus, avec de faibles taux de survie à la dialyse et une pénurie mondiale deun reindonneurs, il existe un besoin pressant de développer des thérapies qui pourraient prévenir la progression de la maladie rénale chronique et améliorer la qualité de vie du patient. Dans l'IRC, la sévérité de l'inflammation dans le tubule proximal dicte la rapidité avec laquelle uneun reinéchouera. Contribué à l'activation de plusieurs types de cellules, il semble, en partie, impliquer une communication de cellule à cellule médiée par les connexines [9]. Les connexines facilitent la communication cellulaire directe et locale à médiation paracrine grâce à leur capacité à s'oligomériser en connexons hexamères. Lorsque les cellules voisines s'alignent, les connexons s'amarrent pour former des jonctions lacunaires [10]. Ces canaux continus fournissent une voie directe pour le transfert d'informations, permettant aux cellules de se verrouiller sur une fréquence particulière et de synchroniser l'activité. Contrairement aux jonctions lacunaires, qui s'ouvrent généralement dans des conditions physiologiques, les connexons non ancrés, également appelés hémicanaux, ont une faible probabilité d'ouverture et s'ouvrent en réponse à une blessure [10]. L'activité altérée de l'hémicanal est associée à la physiopathologie de plusieurs états pathologiques, avec des preuves liant une communication intercellulaire altérée à une sénescence accrue [54], une inflammation [34,55,56] et une fibrose [18-21]. Les données de notre propre laboratoire démontrent que l'isoforme prédominante de la connexine dans le tubule proximal (Cx43) est régulée positivement dans l'IRC avancée et est corrélée à des niveaux élevés de TGF 1 et à la sévérité de la fibrose et de l'inflammation [24]. De plus, cette expression altérée se traduit par une perte de communication intercellulaire de la jonction lacunaire, qui s'accompagne d'une augmentation de la libération d'ATP médiée par l'hémicanal et de changements indiquant une lésion tubulaire précoce. Par conséquent, le blocage de la libération d'ATP par hémicanal médiée par Cx43- peut représenter une cible viable pour le traitement des dommages de stade avancé qui se développent chez les personnes atteintes d'IRC.
Le danegaptide est un petit peptide thérapeutique qui, jusqu'à récemment, était utilisé pour sa capacité à restaurer le couplage des jonctions lacunaires dans de multiples modèles de lésions, notamment l'ischémie [43,44] et la rétinopathie [49]. Il a été démontré que le danegaptide bloque l'activité de l'hémicanal et l'absorption du colorant dans les cellules de gliome C6 [43] ; cependant, le rôle du composé dans le blocage de la libération d'ATP médiée par l'hémicanal reste à confirmer, et aucune étude n'a encore évalué les effets du danegaptide sur les blessés.un reintubules. Dans la présente étude, nous avons présenté des preuves convaincantes que le danegaptide bloque la libération d'ATP induite par l'hémicanal induite par le TGF 1- dans les cellules épithéliales primaires des tubules proximaux humains. De plus, le composé restauré TGF 1- a évoqué des changements dans l'expression et la sécrétion de protéines liées à l'inflammation et à la fibrose. Dans l'IRC, la fibrose tubulo-interstitielle se développe en réponse à divers changements morphologiques et phénotypiques, notamment la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), l'infiltration de cellules inflammatoires, l'activation des fibroblastes et le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) [57]. Des preuves récentes suggèrent que la sénescence cellulaire peut jouer un rôle clé dans la progression de la maladie chronique.maladie du rein[58], avec une sénescence liée à l'EMT, un sécrétome pro-inflammatoire et un dépôt de matrice extracellulaire [59–62]. La sénescence dénote un arrêt de croissance prolifératif irréversible avec des changements associés dans l'organisation de la chromatine, la transcription des gènes et la sécrétion des protéines [63,64]. Par conséquent, les cellules sénescentes sont connues pour présenter une expression accrue des inhibiteurs de la kinase dépendante de la cycline (CDK), y compris p21Cip1 (p21) et p16Ink4a (p16), et une expression altérée de Klotho réno-protecteur [65–68]. Dans l'étude actuelle, l'expression de l'ARNm des inhibiteurs de CDK p16, p21 et cycline D1 était significativement élevée dans les cellules épithéliales tubulaires traitées au TGF 1-, tandis que la protéine anti-âge réno-protectrice Klotho a démontré une expression réduite par rapport aux témoins. Fait intéressant, l'expression de p16, p21 et cycline D1 a été améliorée lorsque les cellules ont été co-incubées avec le danegaptide. L'importance de cette observation est étayée par de nombreuses études in vivo [69, 70], y compris des travaux récents sur le modèle de souris à double knock-out p16 INK4a. Lorsqu'elles ont été induites avec UUO pour présenter une inflammation et une fibrose interstitielles avancées, ces souris ont présenté une diminution de l'apoptose, de la sénescence, des niveaux diminués de signalisation TGF 1/Smad et une réduction de l'infiltration des cellules inflammatoires par rapport aux animaux de type sauvage [70]. De plus, les cellules des tubules proximaux isolées du modèle UUO présentaient des niveaux accrus de p21, dont la suppression s'accompagne d'une réduction des marqueurs couramment associés à l'EMT [71, 72]. Un lien direct avec la sénescence cellulaire et l'induction de l'EMT a déjà été établi [73].
La perte d'adhésion cellulaire médiée par la E-cadhérine est un déclencheur initial de l'EMT, avec une augmentation concomitante de la N-cadhérine (le commutateur de cadhérine), accompagnée d'un désassemblage de la jonction adhérente et de l'acquisition de protéines couramment associées à un phénotype de fibroblaste, par exemple , la vimentine et la protéine spécifique des fibroblastes [74]. Dans leun rein, il est bien établi que la lésion tubulaire évoque un certain nombre de changements morphologiques et phénotypiques caractéristiques de l'EMT partiel, voire complet. Nos études récentes ont démontré que le glucose évoquait des changements dans le TGF 1 médiant le désassemblage des adhérents et du complexe de jonction serrée en régulant les changements dans l'expression des protéines d'adhérence (ECAD, NCAD, -caténine) et de jonction serrée (ZO-1). De plus, l'administration in vitro d'ATP non hydrolysable a régulé à la baisse l'expression de la E-cadhérine dans les régions proximales.un reincellules, dont la perte s'est accompagnée d'une réduction des forces de ligature intercellulaire, d'une diminution des événements de rupture d'attache et d'un remodelage du cytosquelette [51]. Médiés par P2X7R, les effets étaient inversés dans le modèle hétérogène Cx43 plus /- UUO [12]. S'appuyant sur ces résultats, l'efficacité du danegaptide souligne un rôle protecteur pour bloquer la libération d'ATP médiée par l'hémicanal dans la prévention de l'expression altérée de l'épithélium clé (ECAD, -caténine, ZO-1, claudine 2) et mésenchymateux (NCAD, vimentine) protéines dont les implications présentent un intérêt thérapeutique.
CISTANCHE AMÉLIORE LA DOULEUR RÉNALE/RÉNALE
La jonction adhérente s'assemble lorsque la queue cytoplasmique de la E-cadhérine se lie à la -caténine, médiant l'attachement au réseau cytosquelettique et garantissant le maintien de la polarité et de l'architecture cellulaires [75]. Malgré son rôle dans le maintien de la polarité cellulaire, le désassemblage de ces jonctions permet la libération de -caténine dans le cytosol, qui, lorsqu'elle est activée par les protéines Wnt ou d'autres régulateurs en amont, par exemple, la kinase liée à l'intégrine (ILK), peut se transloquer dans le noyau et réguler les effets spécifiques aux cellules. La kinase liée à l'intégrine est une sérine/thréonine-protéine kinase intracellulaire qui joue un rôle fondamental dans la régulation de l'adhésion cellulaire, de la survie, de la prolifération et du dépôt de matrice extracellulaire (ECM) [76]. Fait important, l'inhibition de l'ILK atténuerénalfibrose dans plusieurs modèles de MRC [77]. Dans l'étude actuelle, les augmentations induites par le TGF 1- dans l'expression d'ILK1 ont été, en partie, restaurées lorsque les cellules ont été co-incubées avec le danegaptide, un effet parallèle à une diminution de l'expression de la -caténine et des protéines liées à l'ECM. Fait intéressant, alors que le danegaptide n'a pas réussi à modifier de manière significative l'augmentation induite par le TGF 1- de l'expression de la -caténine, il est important de noter que l'absence de changement d'expression ne reflète pas l'absence de sa fonction dans la cellule. La voie canonique Wnt implique la translocation nucléaire de la -caténine et l'activation de gènes cibles via un groupe de facteurs de transcription appelés T cell factor/lymphoid enhancer factor (TCF/LEF) [78]. Normalement, la signalisation Wnt/-caténine est silencieuse, mais elle est réactivée après une blessure dans un certain nombre de modèles différents de maladie chronique.maladie du rein[79,80]. De plus, la signalisation aberrante Wnt/-caténine est fortement associée à l'initiation de la sénescence, un effet parallèle à la perte d'expression de Klotho, une protéine anti-âge qui agit comme un régulateur négatif de la voie canonique Wnt [81], et dans l'étude actuelle a été régulée négativement dans les cellules traitées au TGF 1- (figure 3). Par conséquent, l'activation soutenue de la signalisation Wnt/-caténine est liée à la progression de la fibrose à la fois dansun reinet d'autres types de tissus [79,82,83]. Une fois transloquée dans le noyau, la -caténine est associée à une expression accrue du facteur de transcription SNAIL et de la métalloprotéinase matricielle MMP7. Fait intéressant, ces événements sont associés à la répression transcriptionnelle et à la perte membranaire du domaine extracellulaire de la E-cadhérine, cette dernière entraînant une augmentation du pool cytoplasmique de la caténine libre [84]. En conséquence, la signalisation Wnt est un activateur clé de l'EMT dans des conditions de blessure [85]. De plus, avec la preuve que la signalisation Wnt/-caténine favorise l'expression de nombreux gènes, y compris la fibronectine, FSP1, Snail1, MMP7 et la cycline D1, il n'est pas surprenant que l'atténuation de cette cascade de signalisation soit associée à une améliorationfonction rénale, réduit l'EMT [86] et réduit l'inflammation [87] et la fibrose [80,88]. Par conséquent, il pourrait, en partie, expliquer l'expression et la sécrétion accrues induites par le TGF 1- des protéines de la matrice extracellulaire (Figure 5), des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines observées dans cette étude (Figures 6 et 7). Le dépôt accru d'ECM et la sécrétion de molécules pro-inflammatoires sont les caractéristiques de la fibrose tubulo-interstitielle, avec différents types de cellules, y comprisrénalles cellules épithéliales tubulaires connues pour sécréter un grand nombre de facteurs qui sont collectivement définis comme le phénotype sécrétoire associé à la MRC (CASP). Caractérisé par de nombreuses molécules, dont les interleukines, les protéines de la matrice extracellulaire et les chimiokines, ce CASP présente des similitudes frappantes avec le phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP), les composants du CASP ayant été fortement associés à la pathologie de la fibrose tubulo-interstitielle [89]. Lorsqu'ils sont libérés, ces facteurs pro-inflammatoires agissent sur les cellules saines voisines de manière paracrine, entraînant ainsi la progression de la fibrose dans l'IRC. Comme de nombreux facteurs associés au CASP sont connus pour induire la fibrose dans leun rein(par exemple, TGF, interleukine (IL)-1 et interleukine (IL)-6), le ciblage en amont de ces intermédiaires de signalisation inflammatoires pourrait s'avérer une stratégie alternative efficace pour le traitement de l'IRC. À l'aide d'un réseau de profils protéomiques, le surnageant cellulaire des cellules traitées au TGF 1 ± danegaptide a été incubé sur une membrane cellulaire préabsorbée avec des anticorps dirigés contre des protéines inflammatoires clés. Comme le soulignent les figures 6 et 7, la co-incubation des cellules avec le TGF 1 et le danegaptide a restauré l'expression et la sécrétion d'un certain nombre de protéines candidates dont le rôle dansmaladie du reinest bien établi comme nuisible (facteur de nécrose tumorale-alpha, interleukine 1-alpha, interféron-gamma) ou protecteur (facteur de croissance des hépatocytes). De plus, dans l'IRC, les chimiokines solubles, les molécules d'adhésion et les facteurs de croissance recrutent et activent les cellules immunitaires infiltrantes et les fibroblastes résidents pour médier l'inflammation et la fibrose chez le blessé.un rein. Les données de notre matrice confirment que la modulation de Cx43 et le blocage de la libération d'ATP médiée par les hémicanaux dans les cellules épithéliales tubulaires annulent, en partie ou en totalité, la sécrétion de nombreux médiateurs inflammatoires, y compris les chimiokines, la protéine chimio-attractante des monocytes (MCP1) et la régulation par activation, la T normale Cellule exprimée et sécrétée (RANTES), toutes deux impliquées dans le recrutement des monocytes. Élevé à la fois humain et expérimentalmaladies rénales, la sécrétion de MCP1 est déclenchée par l'interleukine -1, le facteur de nécrose tumorale alpha [90] et l'interféron gamma [91], tous induits dans notre modèle par le TGF 1, mais bloqués lorsqu'ils sont co-appliqués avec le danegaptide. De plus, il a également été observé que le danegaptide prévient la sécrétion induite par le TGF 1- de la molécule d'adhésion cellulaire intercellulaire (ICAM1) [92], du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) [93] et du peptide activateur des neutrophiles épithéliaux. (ENA78) [94]. Collectivement, ceux-ci ont été liés à la progression de l'IRC et à d'autres protéines pathogènes clés, notamment la dipeptidyl peptidase 4 (DPPIV) [95] et le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) [96], et ont été identifiés comme des cibles thérapeutiques potentielles. Malgré ces observations, l'analyse en réseau a identifié un certain nombre de protéines à 48 h, où la régulation induite par le TGF 1- semblait être indépendante de la libération d'ATP médiée par l'hémicanal. Comme en témoigne l'expression du ligand FLT3 dans le lysat cellulaire, le danegaptide n'a pas réussi à modifier de manière significative les changements induits par le TGF 1- dans l'expression de la cellule entière. Le ligand FLT3 est initialement synthétisé sous la forme d'une protéine liée à la membrane, qui doit être clivée pour devenir un facteur de croissance soluble. Dans les cellules traitées au TGF 1-, une augmentation du FLT3L lié à la membrane a été observée par rapport aux témoins dans le lysat cellulaire, une réponse qui n'a pas été affectée lorsque les cellules ont été co-incubées avec le danegaptide. Bien que l'on connaisse peu l'enzyme impliquée dans le clivage protéolytique et la libération de FLT3L, une étude de Horiuchi et al. ont démontré que l'excrétion de FLT3L et la libération de la membrane dépendent de la métalloprotéase et que cet effet dans les fibroblastes dépend de l'enzyme de conversion du TNF (TACE) [97]. Bien que nous ne puissions que spéculer, il est possible que le blocage de la libération d'ATP médiée par Cx 43- puisse atténuer l'activité d'une ou plusieurs protéines nécessaires à la libération de la membrane FLT3 et, par conséquent, en l'absence de libération de FLT3L, les niveaux de FLT3L dans le surnageant sont significativement inférieurs dans les cellules traitées au TGF 1 plus au danegaptide par rapport aux témoins traités au TGF 1-. Fait intéressant, bien que le danegaptide ne semble pas inverser l'augmentation induite par le TGF 1- dans le lysat de cellules FLT3L, il a eu un effet sur la forme sécrétée de la protéine.
Le Receptor for Advanced Glycation end-products (RAGE) soluble est un biomarqueur potentiel de l'inflammation et du stress oxydatif [98]. Il agit comme un récepteur leurre qui empêche les produits finaux de glycation avancée de se lier au RAGE lié à la membrane et aux effets néfastes liés au RAGE. Dans l'étude actuelle, nous avons observé une augmentation de 70 % de la sécrétion de sRAGE avec le TGF 1, un effet restauré pour contrôler le danegaptide. sRAGE est fonctionnel et capable d'induire un effet lorsqu'il est sécrété. Le potentiel du danegaptide à annuler significativement cette sécrétion présente un intérêt thérapeutique évident. Fait intéressant, cependant, nous n'avons pas observé d'augmentation du lysat RAGE à 48 h avec TGF 1 ± danegaptide. Bien que ces expériences aient été réalisées dans des cellules humaines primaires du tubule proximal, les limites de notre modèle peuvent avoir des effets dépendants de la cellule, du temps et de la concentration. Par conséquent, bien qu'une meilleure compréhension du mécanisme d'action du danegaptide soit nécessaire, les résultats de cette étude fournissent des preuves initiales importantes des avantages de l'utilisation du danegaptide pour annuler les changements induits par le TGF 1- dans les marqueurs de l'inflammation et des lésions tubulaires via le blocage de libération d'ATP médiée par l'hémicanal. Nous admettons que nos données in vitro fournissent un modèle minimaliste des événements multifactoriels qui donnent lieu à la fibrose tubulo-interstitielle, et recommandons la prudence dans la traduction de ces nouvelles découvertes à la situation in vivo, en particulier lorsque des études sur d'autres espèces et modèles de blessures ont démontré des effets variables [41,44,46–49]. D'autres études sont maintenant nécessaires pour déterminer la sélectivité de ces hémicanaux et la capacité du médicament dans des modèles précliniques de dommages chroniques, avant de tester l'efficacité dans des essais cliniques humains.
4. Matériels et méthodes
4.1. Matériaux
Humain clonalun rein2 (HK2) et les cellules épithéliales primaires du tubule proximal humain (hPTEC) ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) (normes LGC). Les fournitures de culture tissulaire ont été achetées auprès d'Invitrogen (Paisley, Royaume-Uni). La membrane Immobilon-FL PVDF provenait de Millipore (Watford, Royaume-Uni), et le tampon de blocage Odyssey et les anticorps fluorescents FL secondaires ont été achetés auprès de LI-COR (Cambridge, Royaume-Uni). Les anticorps contre la E-cadhérine, la N-cadhérine, l'ILK1, la MMP-3, la -caténine, la vimentine et la ZO-1 ont été obtenus auprès de Cell Signaling Technologies (Hertfordshire, Royaume-Uni), tandis que la claudine-2, les anticorps contre la laminine, le collagène I et le collagène IV ont été obtenus auprès d'ABCAM (Cambridge, Royaume-Uni). L'anticorps fibronectine a été acheté à Santa Cruz (Santa Cruz, Californie, États-Unis). Le hTGF 1 recombinant a été obtenu auprès de Sigma (Poole, Royaume-Uni), comme tous les autres produits chimiques généraux. Danegaptide a été fourni par Zealand Pharmaceuticals. Les biocapteurs ATP provenaient de Sarissa Biomedical Ltd. (Coventry, Royaume-Uni) et les plats de farine de WPI (Hertfordshire, Royaume-Uni). Les filtres de Transwell ont été achetés chez Corning (Nottinghamshire, Royaume-Uni). Le kit de réseau de cytokines humaines Proteome Profiler provenait de R&D Systems (Oxfordshire, Royaume-Uni).
4.2. Culture tissulaire
Des cellules épithéliales primaires du tube proximal humain (hPTEC) ont été maintenues dans unrénalmilieu basal de cellules épithéliales de l'ATCC, additionné de 0,5 % de sérum de veau fœtal (FCS wt/vol, triiodothyronine (10 nM), rhEGF (10 ng/mL), hémisuccinate d'hydrocortisone (100 ng/mL), rhInsuline (5 µg/mL), épinéphrine (1 µM), transferrine (5 µg/mL) et L-alanyl-glutamine (2,4 mM), dans une atmosphère humidifiée à 37 ◦C avec 5 % de CO2 Les cellules ont été soumises à une nuit privation de sérum avant le traitement.un rein2 (HK2) (passages 18 à 30) ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)/milieu Hams F12, additionné de 10 % de FCS poids/volume, de glutamine (2 mmol/L) et de facteur de croissance épithéliale (EGF) ( 5 ng/mL), dans une atmosphère humidifiée à 37 ◦C avec 5 % de CO2. Les cellules HK2 ont été immortalisées par la transduction des gènes E6/E7 du papillomavirus humain 16 (HPV-16) et étaient exemptes de mycoplasmes. Dans toutes les expériences, les cellules ont été ensemencées dans du DMEM/F12 à faible teneur en glucose (5 mmol/L) pendant 48 h, puis privées de sérum pendant la nuit avant le traitement.
4.3. Dosage MTT Le dosage du 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-bromure de diphényltétrazolium (MTT) a été réalisé, comme décrit précédemment, pour évaluer les effets cytotoxiques du danegaptide sur la prolifération cellulaire [99]. Les cellules HK2 ont été ensemencées dans des plaques 96-puits et cultivées dans du DMEM/F12 à faible teneur en glucose (5 mM) pendant 48 h, avant la privation de sérum pendant la nuit, puis stimulées pendant 48 h avec du TGF 1 (10 ng/mL ) ± danegaptide (50–1000 nM). La mesure colorimétrique de la production de formazan correspondait au nombre de cellules viables.
4.4. Dosage de la lactate déshydrogénaseLa libération de lactate déshydrogénase (LDH) dans les médias à la suite de lésions de la membrane plasmique est couramment utilisée pour évaluer la mort cellulaire ou la cytotoxicité. Les cellules HK2 ont été ensemencées dans des plaques à puits 96- et cultivées dans du DMEM/F12 à faible teneur en glucose (5 mM) pendant 48 h avant la privation de sérum pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été stimulées pendant 48 h avec TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (50–1000 nM). Le kit de test de cytotoxicité LDH II (Abcam) a été utilisé pour quantifier la LDH conformément aux instructions du fabricant.
4.5. Dosage de cristal violetCe test simple est utilisé pour mesurer la densité relative des cellules adhérées aux plats multi-puits. Le cristal violet colore l'ADN et peut être quantifié par colorimétrie après solubilisation. Les cellules HK2 ont été ensemencées dans des plaques 12-puits et cultivées dans du DMEM/F12 à faible teneur en glucose (5 mM) pendant 48 h, avant la privation de sérum pendant la nuit, puis ensuite stimulées pendant 48 h avec du TGF 1 (1{{16 }} ng/mL) ± danegaptide (50–1000 nM). Le test a été décrit précédemment [99]. En bref, les cellules ont été fixées à l'aide de paraformaldéhyde pendant 10 min, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et incubées pendant 10 min à température ambiante (TA) dans une solution de cristal violet à 0, 1%. Après plusieurs lavages supplémentaires, la tache a été solubilisée en utilisant du SDS à 1 % et l'absorbance a été mesurée par un lecteur de plaque.
4.6. Western blotLa préparation de protéines cytosoliques à partir de cellules HK2 et de hPTEC, leur séparation par électrophorèse sur gel SDS et leur transfert sur des membranes Immobilon-FL PVDF ont été décrites précédemment [12]. Les membranes ont été bloquées à l'aide du tampon de blocage Odyssey (LI-COR), puis sondées pendant la nuit avec des anticorps contre la E-cadhérine (1:1000), la N-cadhérine (1:1000), la claudine-2 (1:500), ZO -1 (1:1000), collagène I (1:1000), collagène IV (1:2000), fibronectine (1:2000), laminine (1:500), ILK1 (1:500), -caténine (1:2000), vimentine (1:500) et MMP3 (1:500). Les bandes ont été visualisées à l'aide d'OdysseyFC et semi-quantifiées à l'aide d'ImageStudio (v5.2, LI-COR, Lincoln, NE, USA).
4.7. Résistance transépithélialeLes cellules HK2 ont été ensemencées (6 × 104cellules/mL) sur des filtres Transwell (diamètre 12 mm, taille des pores 0,4 µM ; Corning, NY, États-Unis) et cultivées dans du DMEM/F12 à faible teneur en glucose (5 mM) pour 48 h, privé de sérum pendant une nuit puis stimulé avec TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) pendant 48 h. La résistance électrique transépithéliale (TER) a été mesurée à l'aide de l'appareil EVOM (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA). Une résistance à blanc mesurée à partir d'un puits avec du milieu seul a été soustraite de chaque lecture de résistance.
4.8. Études d'absorption de colorantLes cellules HK2 et les hPTEC ont été ensemencées sur des fluorodishes (22 mm de diamètre) et cultivées dans du DMEM/F12 à faible teneur en glucose (5 mmol/L) pendant 48 h. Après une nuit de jeûne sérique, les cellules ont été incubées avec TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (50–100 nM) pendant 48 h. Pour les étapes suivantes, une solution saline équilibrée (BSS, pH 7,0) comprenant NaCl (137 mM), KCl (5,4 mM), MgSO4 (0,8 mM), Na2HPO4 (0,3 mM), KH2PO4 (0,4 mM), NaHCO3 (4,2 mM ), de l'HEPES (10 mM) et du glucose (5 mM) ont été utilisés. Pour induire l'absorption du colorant, les cellules ont été exposées à du BSS sans Ca2 plus (zéro CaCl2 plus EGTA (1 mM)) plus de la carboxyfluorescéine (200 µM) pendant 10 min, suivi d'une période de 5 min dans du BSS contenant du Ca2 plus (1,3 mM) plus carboxyfluorescéine (200 µM). Les boîtes ont ensuite été lavées avec du BSS contenant du Ca2 plus (12 ml). Les images ont été acquises avec une caméra CCD Cool Snap HQ (Roper Scientific, Gottingen, Allemagne) et le logiciel Metamorph (Universal Imaging Corp., Marlow, Bucks, Royaume-Uni). ImageJ a été utilisé pour quantifier l'absorption de colorant, où une région d'intérêt (ROI) a été dessinée autour de chaque cellule (environ 10 à 15 cellules/boîte) et l'intensité moyenne des pixels a été mesurée. Une valeur de fluorescence de fond a été soustraite de chaque retour sur investissement.
CISTANCHE AMÉLIORERA LA DIALYSE RÉNALE/RÉNALE
4.9. Biodétection ATPDes biocapteurs ATP (Sarissa Biomedical, Coventry, Royaume-Uni) ont été utilisés dans une configuration ampérométrique à double enregistrement simultané, comme décrit précédemment [12]. Un biocapteur nul a été utilisé pour tenir compte des artefacts électroactifs non spécifiques et soustrait de la trace ATP. Le glycérol (2 mM) a été inclus dans toutes les solutions d'enregistrement pour permettre la détection de l'ATP. Les cellules HK2 ont été ensemencées sur des lamelles de verre (10 mm de diamètre) dans du DMEM/F12 à faible teneur en glucose (5 mmol/L) pendant 48 h avant la privation de sérum pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été incubées avec du TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) pendant 48 h. Les lamelles ont été transférées dans une chambre contenant du Ca2 plus contenant du BSS perfusé à 6 mL/min (37 ◦C) et laissées pendant 10 min pour s'acclimater. L'ATP et les biocapteurs nuls ont été pliés et abaissés de sorte que l'électrode soit parallèle à la monocouche cellulaire. Une fois qu'une ligne de base stable s'est produite, la perfusion de Ca2 plus -BSS libre a stimulé l'ouverture de l'hémicanal. Après la libération d'ATP, du BSS contenant du Ca2 plus a été utilisé pour fermer les hémicanaux, suivi d'une solution d'étalonnage d'ATP (10 mM). Les enregistrements ont été acquis à 4 Hz avec une interface Micro CED (Mark2) à l'aide du logiciel Spike (v8.03).
4.10. Réseau d'anticorps contre l'inflammation,Une puce à anticorps contre l'inflammation (RnD Systems) a évalué la régulation induite par le TGF 1- de 31 marqueurs inflammatoires. Le tableau a été réalisé en suivant les instructions du fabricant. En bref, les hPTEC ont été cultivées dans du DMEM/F12 à faible teneur en glucose (5 mM) pendant 48 h, avant la privation de sérum pendant la nuit, puis ensuite stimulées pendant 48 h avec du TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM). Les lysats cellulaires et le surnageant ont été collectés et incubés pendant une nuit avec des membranes pré-bloquées repérées en double avec des anticorps de capture. Un mélange de cocktail streptavidine/biotinylé fluorescent 800 CW FL a été utilisé pour visualiser les complexes d'expression protéine/anticorps en utilisant Odyssey FC et semi-quantifié en utilisant ImageStudio (v5.2, LI-COR).
4.11. PCR quantitative en temps réelL'ARN a été extrait à l'aide d'un mini kit RNeasy (QIAGEN) et rétrotranscrit (Invitrogen). La PCR en temps réel (SYBR GreenER, Invitrogen) a été réalisée à l'aide d'un instrument StepOne Plus (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA). L'expression d'ADNc a été obtenue en comparant à une courbe standard d'ADNc dilué en série. Les amorces suivantes ont été utilisées : p16 (sens : CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA, sens inverse : GGTCG GCGCAGTTGGGCTCC), p21 (sens : AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG, sens inverse : TCCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG), cycline D1 (sens : TCTACACCGACAACTCCATCCG, sens inverse : TTCTGCATTTGGAGAGGAAGGAAGTG), Klotho (sens : CCTCGACTAGCC, sens inverse) et GAPDH (sens : GTCTC CTCTGACTTCAACAGCG, sens inverse : ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA). L'analyse de la courbe de fusion a confirmé la spécificité de l'amorce et vérifié la contamination potentielle.
4.12. Une analysePour toutes les expériences, le contrôle à faible teneur en glucose (5 mM) a été normalisé à 100 %, et toutes les autres conditions ont été comparées à leurs contrôles respectifs. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'un test ANOVA unidirectionnel avec le post-test de comparaison multiple de Tukey. Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± SEM, n désignant le numéro d'échantillon. Une valeur de p inférieure ou égale à 0,05 signifiait une signification statistique.