ABSTRAIT

La mélanine est le pigment principal de la peau humaine, jouant le rôle principal de protection contre les rayons ultraviolets. L'altération de la production de mélanine peut entraîner des maladies d'hyperpigmentation, avec des conséquences à la fois esthétiques et sanitaires. Ainsi, les suppresseurs de la mélanogénèse sont considérés comme des outils utiles pour les traitements médicaux et cosmétiques. Un grand intérêt est porté sur les sources naturelles, visant à trouver des substances dépigmentantes sûres et quantitativement disponibles. On pense que les lichens sont des sources possibles de ce type de composé, car la présence de nombreuses molécules phénoliques suggère des effets possibles sur les enzymes phénolases impliquées dans la synthèse de la mélanine, comme la tyrosinase. Dans ce travail, nous avons utilisé quatre espèces de lichens, Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale et Letharia vulpina (L.) Hue, et Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy, pour obtenir des extraits dans des solvants de polarité croissante, à savoir. chloroforme, chloroforme-méthanol, méthanol et eau. Des expériences d'inhibition de la tyrosinase sans cellule ont montré l'inhibition la plus élevée pour l'extrait de méthanol de L. vulpina, suivi par le chloroforme-méthanol de C. islandica. Des résultats comparables pour les activités dépigmentantes ont été observés en utilisant des systèmes in vitro et in vivo, tels que les cellules de mélanome MeWo et les larves de poisson zèbre. Notre étude fournit la première preuve des effets dépigmentants des extraits de lichen, de l'inhibition de la tyrosinase aux modèles cellulaires et in vivo, suggérant que les extraits de L. vulpina et C. islandica méritent d'être étudiés plus avant pour développer des produits de blanchiment de la peau.

Selon des études pertinentes,cistancheest une herbe commune qui est connue comme "l'herbe miracle qui prolonge la vie". Son composant principal estcistanoside, qui a divers effets tels queantioxydant, anti-inflammatoire, et la promotion de la fonction immunitaire. Le mécanisme entre cistanche etblanchiment de la peauréside dans l'effet antioxydant du cistancheGlycosides. La mélanine de la peau humaine est produite par l'oxydation de la tyrosine catalysée parTyrosinase, et la réaction d'oxydation nécessite la participation d'oxygène, de sorte que les radicaux sans oxygène dans le corps deviennent un facteur important affectant la production de mélanine. Cistanche contient du cistanoside, qui est un antioxydant et peut réduire la génération de radicaux libres dans le corps, ainsiinhibant la production de mélanine.

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SujetsSciences végétales, Dermatologie

Mots clésTyrosinase, métabolites secondaires du lichen, poisson zèbre, mélanogénèse, Letharia vulpina, Cetraria islandica

INTRODUCTION

Chez les vertébrés, la synthèse de la mélanine est réalisée par des cellules spécialisées appelées mélanocytes, au sein d'organelles de type lysosome appelées mélanosomes. La mélanisation est contrôlée par différents processus, notamment des facteurs environnementaux (par exemple, les rayons UV) et endogènes (par exemple, -MSH), la stimulation du récepteur de la mélanocortine -1 (MC1R), la transduction du signal par les voies cAMP et MAPK, l'activation de la microphtalmie- facteur de transcription associé (MITF) et expression de la protéine pré-mélanosome (Pmel), de la tyrosinase (TYR) et des protéines liées à la tyrosinase (TYRP1) (D'Mello et al., 2016 ; Cheli et al., 2010).

La tyrosinase (EC1.14.18.1) est une enzyme clé de la synthèse de la mélanine et a été largement étudiée comme cible d'agents modulateurs de la mélanisation. C'est une enzyme multifonctionnelle contenant du cuivre, largement distribuée dans la nature, responsable de la mélanisation chez les animaux et du brunissement chez les plantes et les micro-organismes (Kondo & Hearing, 2011). L'enzyme catalyse deux réactions distinctes de formation de mélanine : l'hydroxylation de la tyrosine par l'activité mycophénolate et l'oxydation de la 3,4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA) en o-dopaquinone par l'action des diphénols. Ces o-quinones réactives subissent une polymérisation non enzymatique pour former de la mélanine.

Bien que la mélanine dans la peau humaine soit un pigment essentiel pour la protection contre les dommages induits par les UV, une production excessive de mélanine provoque des troubles d'hyperpigmentation, tels que le mélasma, les éphélides et les lentigines (Mukherjee et al., 2018). Ces conditions représentent un problème pour de nombreuses personnes et par conséquent, la recherche d'agents dépigmentants a suscité beaucoup d'intérêt dans les domaines médical et pharmaceutique (Solano, 2014). Par conséquent, des efforts de recherche considérables ont été déployés pour découvrir de nouveaux produits actifs naturels riches en inhibiteurs de pigmentation sûrs et quantitativement disponibles (Li et al., 2013 ; Lo et al., 2013 ; Wang et al., 2011). La principale stratégie est de cibler la tyrosinase, avec un intérêt croissant pour les produits naturels à utiliser comme inhibiteurs de la tyrosinase (Leyden et al., 2011). Dans la littérature, un grand nombre d'inhibiteurs de la tyrosinase provenant de sources naturelles ont été rapportés pour leur utilisation possible pour traiter les troubles cutanés de la pigmentation (Mukherjee et al., 2018 ; Parvez et al., 2007). Pour nombre de ces composés, l'activité inhibitrice a été liée à leur structure phénolique qui leur confère un pouvoir antioxydant élevé. Divers éléments de preuve indiquent que les lichens méritent d'être étudiés en tant que sources possibles de ce type de composé (Brandão et al., 2017 ; Higuchi et al., 1993 ; Honda et al., 2016 ; Lopes, Coelho et Honda, 2018).

Les lichens sont des associations symbiotiques entre un champignon hétérotrophe (le mycobionte) et un ou plusieurs partenaires photosynthétiques (les photobiontes) (Nash III, 2006). À la suite de la symbiose, le mycobionte produit plusieurs métabolites secondaires (appelés substances lichéniques), dont la plupart sont propres à ces organismes (Ranković & Kosanić, 2015). Ces métabolites peuvent aider à protéger contre les facteurs biotiques et abiotiques, tels que les herbivores ou les rayons UV (Phinney, Solhaug & Gauslaa, 2018). La plupart d'entre eux sont des composés phénoliques dérivés principalement de la voie acétate-polymalonate et devraient permettre plusieurs activités biologiques. En conséquence, les lichens sont utilisés dans les médecines traditionnelles à travers le monde à des fins différentes (Crawford, 2015 ; Devkota et al., 2017), tandis que différentes substances de lichen ont été utilisées pour des applications à base de plantes et pharmaceutiques (Einarsdóttir et al., 2010 ; Gül¸ cin et al., 2002 ; Ranković & Kosanić, 2015). Parmi différentes propriétés, la nature phénolique de ces composés suggère des effets sur l'activité des enzymes phénolases comme la tyrosinase (Honda et al., 2016). Les lichens sont de bonnes sources d'antioxydants naturels, dont certains sont reconnus comme inhibiteurs de la tyrosinase (Behera, Adawadkar & Makhija, 2004). Certains brevets revendiquent également des activités contre la tyrosinase liées aux extraits de lichen ou aux composés de lichen (Takayama et al., 2010), mais ils ont été longtemps négligés et négligés principalement en raison des difficultés à obtenir des substances de lichen en quantités et puretés suffisantes pour l'élucidation structurelle et tests pharmacologiques (Boustie, Tomasi & Grube, 2011; Muggia, Schmitt & Grube, 2009).

Cette étude visait à explorer les effets biologiques des substances de lichen sur divers modèles de pigmentation, à la fois acellulaires et cellulaires, y compris également des expériences in vivo sur le poisson zèbre. De plus, nous avons fourni des indications sur la possibilité d'exploiter les lichens pour l'extraction de composés dépigmentants et la préparation de produits dépigmentants pharmaceutiques et cosmétiques. En raison d'une connaissance limitée des effets du lichen sur la mélanisation, nous avons d'abord effectué un dépistage effectué sur différentes espèces connues pour leur large distribution et leur abondance, à savoir. Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale, Letharia vulpina (L.) Hue et Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy. De chaque espèce, nous avons obtenu une série de quatre extraits en utilisant des solvants de polarité croissante, du chloroforme pur à l'eau. Dans une première enquête, tous les extraits ont été testés dans des expériences d'inhibition de la tyrosinase sans cellules. Les extraits présentant une activité inhibitrice dose-dépendante marquée ont été utilisés sur des modèles de mélanisation in vitro et in vivo, en utilisant respectivement des cultures de cellules de mélanome productrices de mélanine (MeWo) et des embryons de poisson zèbre en développement. Nous avons utilisé le poisson zèbre car il a été récemment établi comme modèle in vivo pour le criblage basé sur le phénotype des composés régulateurs mélanogènes (Lin et al., 2011). En particulier, le poisson zèbre est devenu un modèle vertébré important pour évaluer les effets des médicaments car il présente des caractéristiques uniques, notamment la facilité d'entretien et d'administration des médicaments, un cycle de reproduction court, la fécondation externe et le développement, permettant la manipulation de l'environnement de développement et des mesures optiques à travers le transparent. paroi corporelle.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Produits chimiques

Tous les réactifs ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Milan, Italie) sauf indication contraire.

Espèces de lichens et préparation d'extraits

Les thalles de F. caperata et P. perlatum ont été collectés dans une zone boisée de l'est de la Ligurie (nord-ouest de l'Italie), L. vulpina dans une zone forestière de Valtournenche (nord-est de la Vallée d'Aoste, Italie) et C. islandica a été acheté à Kubja Ürditalu (Tallinn, Estonie). Selon la législation italienne, aucune autorisation de collecte de lichen n'est requise. Les matériaux de lichen ont été identifiés par l'un d'entre nous (PG) à l'aide d'une analyse au microscope à l'aide de clés d'identification et de tests ponctuels. Ensuite, le matériau de lichen a été nettoyé des débris, laissé sécher à température ambiante pendant une nuit et stocké dans des sacs en papier à température ambiante jusqu'à son utilisation.

Les thalles de lichen séchés ont été extraits à température ambiante (environ 23 ◦C) avec quatre polarités de solvant allant du chloroforme à l'eau : chloroforme, chloroforme-méthanol (9:1), méthanol et eau (14,4 g de F. caperata dans 70 mL de chaque solvant, 10,4 g de P. perlatum dans 60 mL, 13,3 g de L. vulpina dans 75 mL et 100,6 g de C. islandica dans 500 mL). Les extractions ont été réalisées pendant 5 jours et 3 fois pour chaque solvant, avec une agitation fréquente. Le liquide surnageant a ensuite été filtré et évaporé à sec sous pression réduite dans un système rotatif (Rotavapor Heidolph, Schwabach, Allemagne) pour obtenir des extraits secs (Souza et al., 2016). Les rendements en extrait de lichen sont indiqués dans le tableau 1.

Test d'inhibition de la tyrosinase

Le profil chromatographique TLC conventionnel a été réalisé sur des plaques de 20 × 20 cm (gel de silice Merck 60 F254) en suivant les protocoles de la littérature (Culberson & Kristinsson, 1970; White & James, 1985). En bref, des échantillons d'extrait méthanolique de L. vulpina et d'extrait de chloroforme-méthanol de C. islandica ont été resolubilisés dans leurs solvants d'extraction, puis déposés sur une plaque TLC à l'aide d'un tube capillaire. Le profil TLC a été réalisé en utilisant du toluène : acide acétique (200 : 30 ml) comme phase mobile (solvant C). Une fois le front de solvant atteint, la plaque a été laissée sécher à température ambiante. Les plaques séchées ont été examinées et photographiées initialement en lumière visible (lumière du jour) pour détecter les pigments sous forme de taches colorées, puis en lumière de fluorescence, en utilisant des excitations à 254 et 350 nm.

Pour visualiser la présence d'une activité d'inhibition de la tyrosinase dans chaque spot, des plaques de CCM ont été pulvérisées avec une solution de L-tyrosine (environ 2,5 × 10-5 mmol/cm2) puis avec une solution de tyrosinase (environ 3,6 U/cm2). Les taches ayant une activité inhibitrice de la tyrosinase sont apparues blanches sur un fond sombre (Wangthong et al., 2007).

Culture cellulaire, viabilité cellulaire et dosages de mélanine

La lignée cellulaire de mélanome humain MeWo (cat. HTB-65, ATCC, Manassas, VA, USA, a été utilisée pour le test de viabilité cellulaire, comme rapporté par Pastorino et al. (2017), et pour le dosage de la mélanine, comme décrit par Cornara et al (2018).

Essai de dépigmentation du poisson zèbre

Des poissons zèbres adultes (Danio rerio) ont été obtenus auprès d'un revendeur commercial et conservés dans un système de circulation avec une conductivité de l'eau de 500–530/cm à 27 ◦C, pH 7,0–7,5 sous une lumière constante de 14/10/ photopériode sombre. Les soins vétérinaires des animaux ont été effectués conformément à la loi italienne (D.to L.Vo 26/2014) et les expériences ont été approuvées par l'Institutional Ethics Review Body (Université de Gênes) et le ministère italien de la Santé (autorisation 720/ 2015-RP). Le frai des poissons zèbres adultes a été effectué selon les méthodes standard. En particulier, des embryons synchronisés ont été obtenus à partir de pontes naturelles induites le matin en allumant la lumière. Les embryons ont été disposés dans des plaques à puits 6- contenant 2 ml de milieu embryonnaire et 15 embryons par puits. Les solutions mères d'extraits ont été diluées aux concentrations souhaitées avec du milieu embryonnaire juste avant utilisation (extrait de méthanol de L. vulpina : 6–45 µg/ml ; extrait de chloroforme-méthanol de C. islandica : 5–65 µg/ml). Des extraits dilués ont été ajoutés à chaque puits et incubés de 8 à 56 hpf (heures post-fécondation), ce qui a entraîné une exposition de 48 h. L'arbutine 10 mM a été utilisée comme témoin positif. Le remplacement du milieu a été effectué toutes les 24 h pour assurer une répartition homogène des composés à tester. Les embryons à 56 hpf ont été déchorionés par une pince, anesthésiés dans une solution de méthanesulfonate de tricaïne (Sigma Aldrich), puis photographiés sous un stéréomicroscope (Leica M205C). Les effets sur la pigmentation ont été évalués à l'aide du logiciel ImageJ v. 1.74. La fonction d'analyseur de mesure de pixel a été utilisée pour évaluer la zone de pigmentation du poisson zèbre.

analyses statistiques

Les courbes dose-réponse obtenues par l'inhibition de la tyrosinase, le MTT et les données de pigmentation du poisson zèbre ont été analysées par un modèle de régression logistique, produisant des valeurs IC50 et IC05 qui ont été supposées comme niveaux médian et seuil, respectivement. Des comparaisons statistiques ont été effectuées avec l'environnement R 3.0.1 (R Core Team, 2013), en utilisant le test ANOVA, t Student avec la correction de Bonferroni et les tests de Dunnett pour les comparaisons multiples.

RÉSULTATS

Effets sur l'activité de la tyrosinase

Des extraits de lichen ont montré un complexe d'effets modulateurs sur l'activité de la tyrosinase de champignon, évalués in vitro dans un essai sans cellule. Certains extraits ont induit une activation de la tyrosinase, notamment les extraits au méthanol, au chloroforme et à l'eau de L. caperata de F. caperata, d'autres ont montré un comportement biphasique, tandis que certains étaient inhibiteurs (Fig. 1 et Tableau 2). En particulier, les extraits au chloroforme-méthanol (Fig. 1B) et au méthanol (Fig. 1C) ont montré dans l'ensemble une inhibition de la tyrosinase plus forte, avec des effets dose-dépendants. L'activité d'inhibition la plus forte a été enregistrée pour l'extrait au méthanol de L. vulpina (Fig. 1C), suivi de l'extrait au chloroforme-méthanol de C. islandica (Fig. 1B). Les activités inhibitrices de ces extraits étaient les seules qui permettaient d'estimer les valeurs d'IC50 avec un IC à 95 % (tableau 2). En tant que témoin positif, dans ces expériences, l'inhibition de la tyrosinase induite par l'acide kojique avec une CI50 de 13,9 µg/ml (intervalle de confiance à 95 % : 12,4–15,7).

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