Détection et caractérisation de nanoparticules minéralo-organiques dans les reins humains

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

La calcification ectopique est associée à diverses maladies humaines, dont l'athérosclérose, le cancer,chroniqueun reinmaladie, etDiabètesucré. Bien que des nanoparticules minérales aient été détectées dans des vaisseaux sanguins calcifiés, la nature et le rôle de ces particules dans le corps humain restent flous. Ici, nous montrons pour la première fois que l'hommeun reintissus obtenus à partir du stade terminalchroniqueun reinmaladieou les patients atteints de cancer du rein contiennent des particules minérales multilamellaires rondes de 50 à 1 500 nm, alors qu'aucune particule n'est observée chez les témoins sains. Les particules minérales se trouvent principalement dans la matrice extracellulaire entourant les tubules contournés, les canaux collecteurs et les boucles de Henle ainsi que dans le cytoplasme des cellules délimitant les tubules, et sont constituées de phosphate de calcium polycristallin similaire au minéral trouvé dans les os et les calcifications ectopiques. Laun reinles nanoparticules minérales contiennent plusieurs protéines sériques qui inhibent la calcification ectopique dans les fluides corporels, notamment l'albumine, la fétuine-A et l'apolipoprotéine A1. Étant donné que les nanoparticules minérales-organiques se trouvent non seulement dans les dépôts calcifiés mais également dans des zones dépourvues de calcifications microscopiques, nos observations indiquent que les nanoparticules peuvent représenter des précurseurs de calcification et de calculs rénaux chez l'homme.

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La calcification ectopique est associée à l'athérosclérose, au cancer,chroniqueun reinmaladie, et le diabète sucré1–3. Des études récentes indiquent que l'athérosclérose etchroniqueun reinmaladieles patients présentant des signes de calcification vasculaire présentent des risques accrus de morbidité et de mortalité, ce qui suggère que la calcification ectopique est préjudiciable à la santé humaine1,3. Des calcifications indésirables sont également observées chez les personnes vieillissantes et la plupart des personnes de plus de 60 ans présentent des signes de calcification vasculaire4. Pour ces raisons, décrypter les facteurs qui induisent la calcification ectopique et développer un traitement efficace représentent des objectifs importants.

La calcification ectopique peut être définie comme un déséquilibre entre les inhibiteurs et les inducteurs de calcification dans le corps. Les inhibiteurs de la calcification comprennent des protéines sériques telles que l'albumine, la fétuine-A, l'ostéopontine et la protéine GLA matricielle ainsi que de petits composés comme le pyrophosphate, tandis que l'hyperphosphatémie et l'inflammation représentent les principaux inducteurs de calcification5–7. Des études récentes indiquent que les inducteurs de calcification activent un processus cellulaire similaire à la formation osseuse lors de la calcification vasculaire7,8. Des vésicules matricielles similaires à celles qui induisent la minéralisation dans les os en développement ont également été détectées dans les tissus mous calcifiés7–9. Ces vésicules matricielles sont probablement libérées par les cellules musculaires lisses vasculaires qui se différencient en cellules de type ostéoblaste, qui induisent la calcification7.

Des nanoparticules minérales (NPs) ont été détectées dans des tissus mous montrant des signes de calcification ectopique. Prix ​​et al. ont constaté que le sérum de rats traités soit avec l'étidronate de bisphosphonate soit avec de la vitamine D abritait des complexes minéraux-protéines contenant les inhibiteurs de calcification fétuine-A et la protéine GLA matricielle10,11. De même, Jahnen-Dechent et al. ont observé que des complexes minéraux contenant de la fétuine A, appelés particules de calciprotéine (CPP), pouvaient être détectés dans le liquide d'ascite de patients atteints de péritonite calcifiante12. Une étude récente de Bertazzo et al. ont démontré la présence de NP minérales dans les valves aortiques et les artères coronaires des patients atteints de fièvre athéroscléreuse et rhumatismale13. Alors que les études sur la formation de particules minérales se sont généralement concentrées sur le système cardiovasculaire humain, il reste difficile de savoir si les particules peuvent être trouvées dans d'autres tissus et si ces entités jouent un rôle dans la santé ou la maladie.

Nous avons observé plus tôt que les NPS minéraux-organiques se forment spontanément dans les fluides corporels humains et animaux14–28. Ces NP minérales ont été initialement décrites comme des nanobactéries (NB) et étaient considérées non seulement comme les plus petites cellules sur terre29, mais aussi comme une cause possible de transmission de nombreuses maladies, notamment la maladie d'Alzheimer, l'athérosclérose, le cancer,un reinpierreformation, polykystiqueun reinmaladie, et prostatite30–32. Cependant, nos résultats ont montré que le NB est en fait des NP minérales non vivantes qui imitent les bactéries communes en termes de morphologie, de croissance, de prolifération et de sous-culture15,18,22. La possibilité que des particules minérales similaires au soi-disant NB puissent être trouvées dans les tissus humains et si ces particules jouent un rôle dans la maladie reste à examiner.

Dans la présente étude, nous avons développé une approche nanomatériau pour détecter et analyser les NPs minérales-organiques chez l'homme malade.un reintissus. Nous montrons que les tissus rénaux de patients atteints d'insuffisance rénale chronique en phase terminale et de cancer du rein contiennent des NP minérales multilamellaires similaires aux particules minérales biomimétiques qui précipitent spontanément dans les fluides corporels in vitro. Nos résultats révèlent des informations essentielles concernant la composition biochimique, le mécanisme de formation et la fonction biologique de ces particules minérales et organiques et ils éclairent les mécanismes de la calcification ectopique et de l'initiation de la maladie dans le corps humain.

Résultats

Nous avons examiné des tissus rénaux prélevés chirurgicalement sur des patients humains atteints d'une maladie rénale chronique en phase terminale (n=2) ou d'un cancer du rein (n=18 ; voir le tableau 1 ; pour les échantillons de cancer du rein, nous nous sommes concentrés sur les non -partie cancéreuse du tissu). En tant que témoins sains, nous avons étudié des biopsies rénales obtenues chez des patients présentant un traumatisme ou un hématome mais qui n'avaient pas de fonction rénale anormale antérieure (n=2 ; Tableau 1).

Les tissus rénaux d'individus en bonne santé présentaient des caractéristiques histologiques normales et aucune calcification ectopique n'a été observée après la coloration de von Kossa (Fig. 1A, B). D'autre part, les tissus rénaux obtenus à partir d'individus malades et colorés à l'hématoxyline et à l'éosine (H & E) ont montré des signes de lésions tissulaires (Fig. 2A – C, indiqués par des flèches), et 80% des tissus malades examinés ont montré des dépôts minéralisés comme révélé par coloration de von Kossa (Fig. 1C – T, Fig. 2E, F, la calcification est visible sous forme de matériau noir indiqué par des flèches noires ; voir également le tableau 1). Des dépôts calcifiés ont été remarqués dans le cortex et la moelle, y compris l'espace extracellulaire entourant les tubules contournés distaux, les tubules contournés proximaux, les canaux collecteurs et les boucles de Henle ainsi que le cytoplasme des cellules délimitant les tubules et les canaux (Fig. 1C – T et Fig. .2E, F). Aucune calcification n'a été détectée dans le corpuscule rénal (Fig. 2D).

Pour examiner la nature des précipités minéraux, nous avons préparé des coupes de rein ultra-minces pour observation par microscopie électronique à transmission (MET). Dans les spécimens contenant des dépôts minéraux microscopiques, des particules minérales ou des granules ont été détectés dans le cytoplasme des cellules épithéliales rénales, dans la matrice extracellulaire sous la membrane basale et dans la lumière des tubules contournés proximaux et distaux (Fig. 3A, B, les particules sont agrandies dans les panneaux A1–A4 et B1–B4). Des NP minérales ont également été observées dans les cellules tapissant les boucles de Henle et les conduits collecteurs (Fig. 3C, D, agrandies dans les panneaux C1, C2 et D1). Certaines particules ont été trouvées dans les vésicules intracellulaires des cellules rénales (Fig. 3A, panneaux A1 et A2). L'approche de microscopie électronique utilisée ici nous a également permis de visualiser l'intérieur des particules minérales ; certaines particules abritaient des anneaux denses aux électrons alternant avec des couches claires et transparentes aux électrons (Fig. 3A, panneaux A3 et A4, Fig. 3C, panneau C1). Plusieurs vaisseaux sanguins, tels que les vasa recta rents (les artères droites du rein), nous sommes entourés d'un grand nombre de NP minérales (Fig. 3D, panneau D1). Des NP minérales ont ainsi été trouvées à divers endroits dans tous les tissus rénaux humains montrant des signes de calcification ectopique, alors qu'aucune particule n'a été trouvée chez les témoins sains examinés.

Les particules minérales trouvées dans les tissus rénaux semblent être très similaires aux NP minéralo-organiques décrites se formant spontanément dans les fluides corporels dans nos études précédentes15,17 (et que nous avons appelées des bions24). Pour vérifier cette possibilité, nous avons préparé des NP organiques minérales (ou bions) en utilisant une méthode de précipitation comme nous l'avons décrit précédemment15. Cette méthode consiste à ajouter des ions précipitants comme le calcium et le phosphate dans un milieu de culture cellulaire (milieu d'Eagle modifié de Dulbecco ou DMEM) contenant un fluide corporel comme un sérum humain (HS), suivi d'une incubation dans des conditions de culture cellulaire (voir Méthodes). Les particules produites de cette manière (HS-NPS) étaient soit sphériques soit ellipsoïdes et présentaient une surface minérale lisse ou cristalline (Fig. 4A–E), similaire aux particules décrites précédemment dans les fluides corporels22,23 ainsi que dans l'ascite humaine12 et artères calcifiées13. Les particules minérales étaient très similaires aux NP ou granules minéraux observés dans les tissus rénaux en termes de morphologie globale, de structure multicouche et de caractéristiques de surface (Fig. 4F – J). La taille des particules dérivées de HS et des granules rénaux était également comparable, variant de 50 à 1 500 nm de diamètre (Fig. 4A – E, F – J). Comme indiqué ci-dessus, certains granules rénaux étaient entourés d'une membrane lipidique, représentant peut-être des vésicules de cargaison intracellulaires ou des vésicules de membrane extracellulaire (Fig. 4H, I, les membranes sont désignées par des flèches); ces structures membraneuses étaient absentes des échantillons HS-NP préparés in vitro (Fig. 4A – E). Ces observations suggèrent que les granules rénaux sont similaires aux NP minéralo-organiques assemblées dans le sérum.

À l'aide d'une analyse par diffraction électronique de zone sélectionnée, nous avons observé que la phase minérale des HS-NP préparées in vitro consistait en un nanomatériau polycristallin (Fig. 4E, en médaillon ; remarquez les faibles anneaux concentriques). Des résultats similaires ont été obtenus pour les granules rénaux (Fig. 4J, encart) et pour les os et les calcifications ectopiques comme décrit dans des études précédentes33,35.

Nous avons étudié la composition chimique des HS-NPs et des granules rénaux à l'aide de la spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDX). Les HS-NP ont montré des pics majeurs de carbone (C), de calcium (Ca), d'oxygène (O) et de phosphore (P) (Fig. 4K), compatibles avec la présence d'un minéral de phosphate de calcium. Un faible pic de silicium (Si) a également été noté dans les HS-NP (Fig. 4K), représentant peut-être un constituant mineur des particules. Les granules de rein ont également montré des pics de carbone, de calcium, d'oxygène et de phosphore, indiquant un minéral de phosphate de calcium, ainsi que des pics supplémentaires de silicium et de fer (Fe) (Fig. 4L). Les pics d'uranium (U) ont été attribués à l'acétate d'uranyle utilisé comme réactif de contraste lors de la préparation de l'échantillon (la présence d'uranium dans certains échantillons de particules minérales comme les granules de rein et son absence dans le tissu témoin de la Fig. 4M peuvent être attribuées à la forte affinité de l'uranium pour le phosphate, comme indiqué précédemment35). Les spectres EDX de contrôle du tissu rénal entourant les particules ont montré des pics de carbone et d'oxygène (Fig. 4M), suggérant que le calcium et le phosphore se trouvaient principalement dans les particules minérales.

Les rapports calcium: phosphore (Ca:P) des HS-NPs et des granules rénaux variaient de 0.65 à 1.18. Ces rapports diffèrent de la valeur théorique de 1,67 observée pour l'hydroxyapatite stoechiométrique mais restent dans la fourchette vue précédemment pour les cristaux de phosphate de calcium et d'apatite observés à divers degrés de cristallisation15. Ensemble, ces résultats confirment que les granules rénaux sont constitués de NP de phosphate de calcium.

Diverses protéines se sont avérées inhiber la calcification ectopique de manière systémique dans le corps36,37. De plus, on pense que la couronne protéique trouvée à la surface des NP synthétiques détermine la biodistribution et les effets des particules sur les cellules in vivo38,39. D'autre part, la composition en protéines des NP minéralo-organiques trouvées dans les tissus rénaux humains reste incomplètement comprise. Nous avons découvert précédemment que l'albumine, la fétuine-A et l'apolipoprotéine-A1 (apo-A1) représentent les principales protéines qui interagissent avec les NP minéralo-organiques formées dans les fluides corporels17,20. Ici, nous avons utilisé le marquage immunogold pour examiner la présence et l'emplacement ultrastructural de ces protéines dans les granules rénaux.

Nous avons utilisé des anticorps polyclonaux dirigés contre l'albumine sérique humaine (HSA), la fétuine A sérique humaine (HSF), l'apo-1A humaine et l'HS entière pour examiner la présence de protéines sériques dans les HS-NP et les granules rénaux. La spécificité des anticorps polyclonaux (préparés comme décrit précédemment25) a été vérifiée par Western blot (Fig. 5). Chacun des anticorps polyclonaux a réagi positivement avec les HS-NPs préparés in vitro ainsi qu'avec les granules minérales trouvées dans les tissus rénaux humains (Fig. 6A, B, panneaux A1 – A3 et B1 – B3; points noirs). Les anticorps ont réagi principalement avec les couches denses aux électrons ou le noyau sombre des HS-NP et des granules rénaux (Fig. 6A, B), indiquant que ces zones sombres peuvent contenir des niveaux plus élevés de protéines par rapport aux zones transparentes aux électrons. Les contrôles négatifs effectués sans anticorps primaire n'ont produit aucune réaction (Fig. 6A, B, panneaux A4 et B4, contrôle). Nous avons conclu que les granules rénaux représentent des NP minéralo-organiques similaires aux HS-NP en se basant non seulement sur leur morphologie et leur composition minérale, mais également sur leur liaison aux principaux inhibiteurs de calcification présents dans le sérum.

La microscopie par immunofluorescence a ensuite été utilisée pour confirmer la présence de granules minéraux contenant de la HSA et de la HSF dans les reins humains malades. Grâce à cette technique, des tissus rénaux humains ont montré

coloration positive pour les deux protéines dans diverses zones, y compris l'interstitium entourant les tubules rénaux ainsi que le cytoplasme des cellules délimitant les tubules (Fig. 7A, panneaux A1 et A2). Des agrégats de protéines contenant à la fois de l'albumine et de la fétuine-A ont également été remarqués dans ces zones, bien qu'en quantités inférieures par rapport à la coloration des protéines individuelles (Fig. 7A et panneau A3, coloration fusionnée en jaune). Notamment, nous avons remarqué que la coloration des protéines détectée par immunofluorescence chevauchait étroitement le schéma de calcification ectopique observé à l'aide de la coloration de von Kossa (Fig. 7A, B, la calcification est visible sous forme de matériau noir indiqué par des flèches en B). Ces résultats confirment davantage la présence de particules minéralo-organiques dans les tissus rénaux humains examinés.

Discussion

Alors que des progrès ont été réalisés dans notre compréhension des interactions entre les NP synthétiques et les cellules humaines, nous en savons beaucoup moins sur les effets des NP minéralo-organiques qui se forment spontanément dans les fluides corporels. Nos études précédentes ont montré que ces particules se forment dans les fluides biologiques lorsque les concentrations de calcium et de phosphate dépassent la saturation15,16. Nous avons également observé que ces particules sont internalisées par les cellules immunitaires mais que seules les grosses particules induisent des réactions immunitaires pro-inflammatoires23. Cependant, la distribution de ces particules dans les tissus humains et si elles jouent des rôles physiologiques ou pathologiques dans le corps n'avaient pas été examinées jusqu'à présent.

Dans la présente étude, nous avons détecté pour la première fois des NP minéralo-organiques dans les reins de patients humains souffrant d'insuffisance rénale terminale ou de cancer du rein. Les NP minéralo-organiques détectées contiennent du phosphate de calcium mal cristallisé similaire au minéral osseux, ainsi que de l'albumine, de la fétuine-A et de l'apo-A1 qui agissent comme des inhibiteurs systémiques de la calcification dans les fluides corporels. Nos résultats sont en accord avec les rapports précédents qui décrivaient la présence de complexes minéraux-protéines dans les tissus vasculaires et les fluides corporels12,13,34,40. Étant donné que les particules que nous avons observées ont été trouvées dans des zones ne contenant pas de calcifications microscopiques, nos observations suggèrent que les particules peuvent représenter des précurseurs de calcification ectopique dans les tissus humains. Compte tenu de la possibilité que les NP minéralo-organiques puissent progressivement croître en taille et subir une conversion particule en film dans des conditions favorables comme décrit dans nos études précédentes15,18, les observations présentées ici suggèrent que les précurseurs minéraux peuvent conduire à la formation de particules plus grandes. dépôts minéraux in vivo, tels que la plaque de Randall et les calculs rénaux.

Nos observations selon lesquelles des calcifications ectopiques minérales et des NP minéralo-organiques se retrouvent dans diverses structures anatomiques des reins sont cohérentes avec les découvertes précédentes de calcifications ectopiques dans cet organe41. Les observations d'Evan et al. ont indiqué que la minéralisation dans les reins des patients atteints de néphrolithiase peut commencer et se produire principalement dans le tissu interstitiel des anses de Henle40,42. Ces auteurs ont observé que les dépôts minéraux qui se forment dans cette zone peuvent dépasser de la face basale de l'urothélium et conduire à la formation de calculs rénaux. Nos observations suggèrent qu'en plus des boucles de Henle, d'autres zones rénales peuvent contenir des NP minérales qui peuvent éventuellement évoluer pour former d'importants dépôts minéraux dans les reins humains. Nous étudions également la possibilité que les NP minérales qui se forment dans la circulation sanguine puissent se déplacer dans les tissus rénaux et induire une calcification ectopique et la formation de calculs dans les reins.

Plusieurs granules rénaux détectés dans la présente étude se trouvent dans des vésicules intracellulaires ou extracellulaires (Fig. 4H, I) et ceux-ci sont similaires aux vésicules matricielles qui induisent la calcification des os et des dents7,8. Nous avons récemment observé que des vésicules isolées de sérum humain et animal induisent la formation de NP minérales et de précipités microscopiques in vitro25. Schlieper et al.34 ont également observé que les particules minérales présentes dans les artères sont associées à des structures membranaires et ont proposé que les vésicules matricielles ou les corps apoptotiques puissent représenter des nucléateurs de particules minérales dans ces tissus. De même, Khan et al. ont rapporté que les dépôts de phosphate de calcium trouvés dans les reins de patients humains atteints de calculs rénaux idiopathiques sont associés à des fibres de collagène et à des vésicules matricielles9. Ces résultats suggèrent que les NP minéralo-organiques détectées dans les tissus rénaux pourraient se former via un mécanisme impliquant des vésicules membranaires, une situation analogue à ce que l'on observe dans les artères athérosclérotiques7,8. D'autre part, une étude récente a montré que la calcification ectopique trouvée dans les artères mammaires des femmes n'était pas associée à des marqueurs cellulaires ostéogéniques ou apoptotiques43, suggérant que le mécanisme de calcification peut être spécifique à l'organe ou au contexte biologique impliqué. De plus, des NP minéralo-organiques telles que celles décrites ici peuvent également se former en raison d'un échec à maintenir des concentrations physiologiques d'ions (par exemple, calcium et phosphate) et d'inhibiteurs de calcification (par exemple, albumine, fétuine-A et apo -A1) dans les fluides corporels humains.

Nos résultats suggèrent que la couche dense aux électrons et le noyau des NP organiques minérales peuvent contenir des niveaux plus élevés de protéines et de molécules organiques par rapport aux zones transparentes aux électrons des particules (Fig. 6A, B). Ces couches denses aux électrons semblent être minéralisées comme le montre la nature cristalline de ce matériau sous TEM (voir Fig. 4A – J). D'autres auteurs, dont Ryall41 et Evan et al.44, ont proposé que la couche transparente aux électrons puisse représenter des minéraux tandis que les couches denses aux électrons pourraient correspondre à des molécules organiques. Ces interprétations peuvent être dues au moins en partie à la manière dont les échantillons ont été traités et examinés dans chaque étude ainsi qu'à la nature des tissus de départ utilisés.

En plus de jouer un rôle dans la calcification ectopique, les particules minérales organiques peuvent induire une inflammation des tissus rénaux. Nous avons montré récemment que si les NP minéralo-organiques ne parviennent pas à induire la sécrétion d'interleukine pro-inflammatoire-1 par les macrophages humains, les agrégats minéraux de plus de 1 μm sont capables de le faire23. Il a été démontré que la libération d'interleukine-1 en réponse à des matériaux cristallins repose sur l'activation de complexes moléculaires intracellulaires appelés inflammasomes45–47. De plus, les particules minérales ont été détectées dans les reins abritant des tumeurs et l'association entre cancer et inflammation est maintenant bien reconnue48. La possibilité que des particules minérales agrégées puissent activer un inflammasome et contribuer au développement de l'inflammation et du cancer dans les reins ou d'autres tissus reste à étudier.

En plus de la calcification ectopique, les granules minérales décrites ici peuvent participer à d'autres processus pathologiques. Par exemple, nous avons proposé plus tôt que les NP minérales peuvent se lier à diverses protéines dans les fluides corporels et épuiser ces molécules organiques des fluides corporels20,26. D'autre part, le corps humain peut empêcher la formation et l'accumulation de NP minérales dans des circonstances normales en s'appuyant sur la présence d'inhibiteurs de calcification et du système réticulo-endothélial (c'est-à-dire les macrophages). Les NP minérales ne peuvent donc s'accumuler que lorsque l'homéostasie calcique systémique ou locale est perturbée et lorsque les mécanismes de protection sont défaillants dans le corps humain.

Nous proposons que l'approche nanomatériau développée ici puisse être utilisée pour étudier la formation de NPs minéralo-organiques dans les tissus animaux et humains. Par exemple, les anticorps dirigés contre les protéines inhibitrices de la calcification telles que l'albumine, la fétuine-A et l'apo-A1 peuvent être utilisés en combinaison avec l'analyse minérale pour détecter et caractériser la formation de NP minéralo-organiques dans les tissus des modèles animaux. Les résultats obtenus à l'aide de cette approche peuvent être appliqués à des mesures cliniques effectuées sur des fluides corporels humains afin d'identifier des paramètres biologiques reflétant l'état de formation de particules minérales et de calcification ectopique dans le corps. Nous nous attendons à ce que ces connaissances mènent au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir et traiter les maladies humaines et les affections associées à la calcification ectopique.

Méthodes

Tissus rénaux.L'utilisation de tissus humains et les expériences réalisées dans cette étude ont été approuvées par le comité d'examen institutionnel de l'hôpital Chang Gung Memorial ; les méthodes et les expériences ont été réalisées conformément aux directives approuvées. Un consentement éclairé écrit a été obtenu des patients. Des tissus rénaux sains témoins ont été obtenus à partir de biopsies de patients traumatisés et atteints d'hématome sans antécédent de maladie rénale (n=2) ; des tissus rénaux ont également été obtenus de patients atteints d'un cancer du rein (n=20) et de patients atteints d'insuffisance rénale terminale (n=2) dont les reins ont été prélevés ou biopsiés lors d'une greffe (tableau 1). Pour les tissus cancéreux rénaux, la partie non cancéreuse du tissu a été disséquée et analysée dans la présente étude.

Analyse histologique.Les tissus rénaux ont été montés sur des blocs de paraffine. Les blocs ont été sectionnés et les tranches de tissu ont été chauffées sur une plaque chauffante à 70 degrés pendant 30 minutes pour éliminer la paraffine. Les coupes ont été immergées trois fois dans une solution fraîche de xylène pendant 15 minutes pour éliminer complètement la paraffine restante. Les coupes ont été réhydratées avec de l'éthanol à 95 %, 80 % et 70 % pendant 5 minutes à chaque fois. Les échantillons réhydratés ont été lavés avec de l'eau bidistillée (ddH2O) pendant 5 minutes. Les noyaux cellulaires ont été colorés avec de l'hématoxyline pendant 8 minutes. Le colorant a été retiré des échantillons avec de l'eau chaude pendant 10 minutes. Les échantillons de rein ont été rincés dans du ddH2O et ont été plongés 10 fois dans de l'éthanol à 95 %. Les échantillons traités à l'éthanol ont été contre-colorés avec de l'éosine Y pendant 1 min. Les échantillons ont été déshydratés avec 95 % et 100 % d'éthanol pendant 10 minutes à chaque fois, suivis d'une étape de déshydratation dans du xylène pendant 10 minutes. Les échantillons de rein déshydratés finaux ont été montés sur des lames de verre avec 50 % de glycérol et observés au microscope optique équipé d'une caméra numérique.

Des échantillons déparaffinés et réhydratés ont été préparés comme décrit pour la coloration H&E. Les sections réhydratées ont été colorées avec du nitrate d'argent (5 pour cent), puis exposées à la lumière UV pendant 20 minutes. La solution a été lavée avec ddH2O pendant 15 min. Les sections ont été colorées avec du thiosulfate de sodium (5 pour cent) pendant 5 minutes, puis lavées avec ddH2O pendant 15 minutes. Les sections ont été colorées avec du rouge nucléaire rapide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) pendant 5 minutes. Les échantillons colorés ont été déshydratés successivement avec de l'éthanol à 95 % et à 100 % pendant 10 min chacun, avant la déshydratation dans du xylène pendant 10 min. Les échantillons de rein ont été montés sur des lames de verre et examinés comme décrit ci-dessus.

Microscopie électronique et analyse EDX.Les échantillons de rein ont été coupés en petits morceaux de moins de 1 mm d'épaisseur à l'aide d'un microscope à dissection LGPS (Olympus, Tokyo, Japon). Les tissus ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 2,5 % et du paraformaldéhyde à 1 % dans du tampon cacodylate 0.1 M à 4 degrés pendant la nuit. Les échantillons fixés ont été lavés trois fois avec du tampon cacodylate 0.1 M dans du saccharose à 8 % (pH 7,2) sur de la glace pendant 10 minutes. Les tissus lavés ont été incubés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM) contenant 1% de tétroxyde d'osmium et 1,5% de ferrocyanure de potassium pendant 2 heures sur de la glace. Les tissus ont été lavés avec ddH2O sur de la glace 10min trois fois. Les tissus lavés ont été colorés sur de la glace avec de l'acétate d'uranyle à 1 % dans du ddH2O pendant 1 h, avant d'être lavés trois fois avec du ddH2O sur de la glace. Les tissus rénaux ont été déshydratés avec 30, 50, 70, 80 et 90 % d'éthanol pendant 10 minutes à chaque fois, sauf lorsque l'éthanol a atteint 70 %, auquel cas les échantillons ont été stockés à 4 degrés pendant la nuit. Les tissus ont été colorés avec de l'acide phosphotungstique à 1 % dans de l'éthanol à 95 % pendant 15 minutes, avant la déshydratation avec de l'éthanol à 95 % pendant 5 minutes. Les spécimens ont été immergés dans de l'oxyde de propylène à 40, 57, 67 et 100 % dans de l'éthanol pendant 10 minutes à chaque fois, suivis d'une autre immersion dans de l'oxyde de propylène à 100 % pendant 5 minutes. Les tissus rénaux ont été infiltrés avec 50, 70 et 100 % d'éponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) pendant 1 h à chaque fois. Des échantillons de rein inclus dans l'éponate 812- ont été préparés en incubant deux fois dans de l'éponate à 100 %. Les échantillons inclus ont été incubés dans un four à 60 degrés pendant la nuit pour permettre la polymérisation de la résine.

Les pastilles de HS-NP lavées obtenues comme ci-dessus ont été fixées avec du glutaraldéhyde (2,5 %) et du paraformaldéhyde (1 %) dans du ddH2O pendant 4 h à 4 degrés. Les culots fixés ont été lavés avec ddH2O trois fois pendant 10 min à chaque fois. Les pastilles ont été déshydratées avec des incubations successives dans 30, 50, 70, 80, 90, 95 et 100% d'éthanol, pendant 10 minutes à chaque fois, sauf lorsque l'éthanol a atteint 70%, dans lequel les pastilles ont été stockées à 4 degrés pendant la nuit. Les autres solutions d'éthanol n'ont été mises en contact avec les pastilles que pendant 10 min. Les pastilles déshydratées ont été infiltrées avec un milieu d'enrobage blanc LR (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) en utilisant différents rapports d'éthanol et de milieu LR (3: 1, 1: 1 et 1: 3) pendant 30 minutes chacun. Les culots ont été infiltrés avec du milieu LR frais (100 %) pendant une nuit avant la polymérisation. Les pastilles infiltrées avec le milieu LR ont été incubées dans un four à 60 degrés pendant 2 jours pour permettre la polymérisation de la résine. Des blocs de rein et de HS-NP ont été sectionnés pour produire des tranches d'une épaisseur de 70 à 100 nm à l'aide d'un microtome Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Allemagne). Des coupes de tissu ont été colorées avec de l'acétate d'uranyle à 4 % avant visualisation sous un microscope électronique à transmission JEM 1230 (JEOL, Tokyo, Japon) fonctionnant à 100 kV. Les diagrammes de diffraction électronique ont été obtenus en utilisant le même système. Des grilles en nickel ont servi de support.

Pour l'analyse EDX, des coupes minces de tissus rénaux ont été colorées avec de l'acétate d'uranyle et lavées avec ddH2O comme ci-dessus, puis séchées dans une armoire à dessiccateur électronique. Les spécimens ont été observés sous un microscope électronique à transmission JEM 2100 haute résolution (JEOL) fonctionnant à 120 kV. Les spectres EDX ont été obtenus en triple exemplaire à l'aide d'un système INCA Energy EDS (Oxford Instruments, Abingdon, Royaume-Uni). Des sections minces de HS-NP ont été observées sans coloration.

Préparation de NPs minéralo-organiques.Toutes les solutions de départ ont été ajustées à pH 7,4 et stérilisées par filtration à travers des membranes 0.2μm avant utilisation. HS a été obtenu à partir de volontaires humains en bonne santé en utilisant une technique de ponction veineuse conventionnelle. L'utilisation de fluides biologiques humains dans cette étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel de l'hôpital Linko Chang Gung Memorial et un consentement éclairé écrit a été obtenu des volontaires. Les HS-NP ont été préparés en ajoutant 3 mM de CaCl2 et de Na2HPO4 chacun dans du DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) contenant 10 % de HS, suivi d'une incubation pendant une semaine dans des conditions de culture cellulaire (37 degrés, 5 % de CO2, air humidifié). Les particules ont été sédimentées par centrifugation à 16,000 ×g pendant 15 minutes à 4 degrés et lavées deux fois avec un tampon HEPES (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) en utilisant la même procédure de centrifugation.

SDS-PAGE et Western blot.L'analyse SDS-PAGE et Western blot a été effectuée essentiellement comme avant15. En bref, 0.2 ug (Fig. 5A,D) ou 1,2 ug (Fig. 5B,C) de protéines HS, 47 ug (Fig. 5A,B,D) ou 590ug de protéines HS-NP (Fig. 5C), 0.1ug de HSA (Fig. 5A–D) et 0.6ug (Fig. 5A, C, D) ou {{23} }.15ug de HSF (Fig. 5B) ont été dissous dans 5× "tampon de charge" (0.313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 % SDS, 0,05 % bleu de bromophénol, 50 % glycérol, 12,5 % - mercaptoéthanol) à une concentration finale de 1 × , avant chauffage à 95 degrés pendant 5 minutes et séparation dans des conditions dénaturantes et réductrices sur un SDS-PAGE à 10 % à l'aide d'un système de mini-gel (Hoefer, Holliston, MA). Le contrôle NP (utilisé dans la voie 1 de la Fig. 5A – D) consistait en NP minérales préparées en ajoutant 3 mM de CaCl2 et de Na2HPO4 chacun dans du DMEM (volume final de 1 ml), suivi d'une incubation d'une journée dans des conditions de culture cellulaire ; les particules ont été culottées par centrifugation à 16,000 ×g pendant 15 min, lavées deux fois avec du tampon HEPES et remises en suspension dans 50 ul de tampon HEPES. Une aliquote de 20 ul de particules remises en suspension a été traitée pour SDS-PAGE comme ci-dessus. Les membranes en PVDF ont été bloquées pendant 1 h dans du lait dégraissé à 5 % (p/v) à température ambiante. Les anticorps primaires générés en interne comme décrit précédemment25 ont été utilisés à une dilution de 1:1,000 (-apo-A1 et -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) , ou 1:6,000 ( -HSA). L'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort anti-lapin de chèvre a été utilisé sur la base des instructions fournies par le fabricant (Millipore, Billerica, MA). Les transferts ont été révélés en utilisant une chimiluminescence améliorée (Amersham Biosciences, Amersham, Royaume-Uni) et des films autoradiographiques.

Marquage immunogold.Des échantillons ont été préparés pour l'observation TEM. Les blocs HS-NP ont été sectionnés en tranches de moins de 70 nm d'épaisseur. Les sections d'échantillon sur les grilles ont été bloquées avec 1 % de gélatine de poisson (Sigma) dans du tampon 0.1 M HEPES (pH 8,0) pendant 25 minutes. Les grilles ont été incubées avec les anticorps primaires suivants : -HSA, 1h30 ; -HSF, 1:50 ; -apo-A1, 1h30; -HS-NP, 1:60. Le témoin négatif ne contenait aucun anticorps primaire (1 % de gélatine de poisson dans du tampon HEPES). Les sections incubées ont été rincées avec du tampon HEPES pendant 15 min. Les coupes rincées ont été bloquées avec 1 % de gélatine de poisson dans du tampon HEPES pendant 20 minutes. Les échantillons ont été traités avec l'IgG anti-lapin de chèvre secondaire 5-nm-or-conjugué pendant 1h. Les échantillons ont été lavés avec du tampon HEPES pendant 10 minutes, avant d'être lavés avec ddH2O pendant 10 minutes. Les observations TEM ont été effectuées comme ci-dessus.

Microscopie à fluorescence.Des lames de tissu rénal histologique préparées comme ci-dessus ont été bloquées avec de l'albumine de sérum bovin à 1 % pendant 1 h à température ambiante. Les lames ont été incubées avec des anticorps polyclonaux primaires à une dilution de 1:4,000. Après les étapes de lavage, les échantillons ont été incubés avec les anticorps secondaires chèvre anti-lapin-FITC (492/520nm) et chèvre anti-lapin-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) à 1:100 pour 1h. Les complexes ont été lavés avec du PBST pendant 15 min. Le colorant fluorescent 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) a été utilisé à 10 ug/ml pendant 15 min. Les échantillons colorés au DAPI ont été déshydratés avec 95 et 100 % d'éthanol pendant 10 minutes chacun, suivis d'une déshydratation dans du xylène pendant 10 minutes supplémentaires. Des échantillons de rein déshydratés ont été montés avec un milieu de montage Vectashield fluorescence H -1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) et ont été observés sous un microscope confocal (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Allemagne) équipé d'une caméra Spot Flex.

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Références

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