Détermination de l'échinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche Herba par HPLC

Abstrait:

Objectif Une méthode HPLC a été établie pour ledétermination de l'échinacosidedans leextrait aqueux de Cistancheherbe.

Méthodes L'échinacoside a été déterminé par HPLC. La séparation a été réalisée sur la colonne Inertsil ODS-SP C18 avec une phase mobile constituée d'acétonitrile (A) et de 0,4 % de solution d'acide phosphorique (B), par élution en gradient. La longueur d'onde de détection a été réglée à 333 nm et la température de la colonne était de 30 degrés. Le débit était de 1,0 mL·min-1 et le volume d'injection était de 10 μL. Résultats La relation linéaire de l'échinacoside dans la plage de concentrations de 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 était bonne (r=0.999 8). Les récupérations étaient de 94,59 % -105,31 % (RSD= 2,93 %,n=9). La teneur en échinacoside des extraits aqueux de Cistanche herba était de 15,527,7,347,12,267 mg·g-1. Conclusion La méthode HPLC établie avec une bonne répétabilité est précise, simple et réalisable. Il convient au dosage de l'échinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche herba.

Mots-clés :HPLC;extrait aqueux de Cistanche herba; échinacoside; détermination du contenu

La Cistanche deserticola est un tonique de la médecine traditionnelle chinoise couramment utilisé en pratique clinique et est connue sous le nom de « ginseng du désert » [1]. La Cistanche deserticola enregistrée dans l'édition 2015 de la Pharmacopée chinoise est la tige charnue séchée aux feuilles écailleuses de Cistanche deserticola YC Ma ou Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Il est chaud, sucré et salé et retourne vers les méridiens des reins et du gros intestin. Il a pour effet de nourrir le yang des reins, de reconstituer l'essence et le sang, et d'hydrater les intestins et les laxatifs [2]. "La Materia Medica de Shen Nong", dit-elle, peut "tonifier le milieu, nourrir les cinq organes internes, renforcer le yin et nourrir l'essence". Cistanche deserticola contient principalement des glycosides phényléthanoïdes, des iridoïdes et leurs glycosides, des lignanes et leurs glycosides, des polysaccharides, des composés esters et des alcaloïdes [3]. Les glycosides de phényléthanol sont les principaux ingrédients actifs de Cistanche deserticola. Parmi eux, l'échinacoside et le verbascoside sont répertoriés dans Cistanche deserticola dans la Pharmacopée chinoise.

Composants indicatifs pour l'identification et la détermination du contenu. Des études pharmacologiques [4] montrent que Cistanche deserticola a divers effets pharmacologiques tels que laxatif, protection du foie, anti-ostéoporose, antioxydant, anti-âge et anti-fatigue. L'extrait aqueux de Cistanche deserticola peut favoriser l'expression du gène de la protéine morphogénétique osseuse 2 dans les ostéoblastes de rat, de la phosphatase acide résistante au tartrate, de l'ostéocalcine dans le sérum de souris ovariectomisées et des gènes Smad1, mad5, du facteur de croissance transformant, etc. , a des effets anti-ostéoporose [5-6].

L'échinacée peut favoriser la prolifération des ostéoblastes et favoriser la différenciation des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse cultivées in vitro en ostéoblastes [7-9]. Ces dernières années, il y a eu de nombreux rapports de recherche sur la détermination de la teneur en échinacoside et en verbascoside dans l'extrait éthanolique de Cistanche deserticola et ses préparations composées [10-12], mais il existe peu de rapports sur la détermination de la teneur en composants index dans Cistanche deserticola. extrait aqueux. Dans cette étude, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) a été utilisée pour déterminer la teneur en échinacéaside dans l'extrait aqueux de Cistanche deserticola.

1 matériel

1.1 Instruments

LC-20Chromatographie liquide haute performance AT, SPD-20Un détecteur, SIL-20Un échantillonneur automatique, CTO-10Four à colonne ASvp, poste de travail de chromatographie liquide en solution LC, Shimadzu Corporation de Japon; Balance d'analyse électronique MES125P-OCE-DU, société Sartorius, Allemagne ; Pompe à vide polyvalente à circulation d'eau SHZ-D (Ⅲ), Henan Yuhua Instrument Co., Ltd. ; Système de circulation de refroidissement de l'évaporateur rotatif RC2B SO25, évaporateur rotatif RV 10 D S96, société IKA, Allemagne ; DK-S26

Bain-marie électrique à température constante, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Machine à eau ultrapure série UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Matériels médicinaux et réactifs

Le matériel médicinal Cistanche deserticola a été acheté auprès de Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., numéro de lot : 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, le pharmacien traditionnel chinois en chef du troisième hôpital affilié de l'Université de médecine chinoise de Guangzhou, l'a identifié. comme la tige charnue séchée aux feuilles écailleuses de Cistanche deserticola YCMa. L'échantillon est conservé dans la salle de dépistage des drogues du troisième hôpital affilié de l'Université de médecine chinoise de Guangzhou ; Substance de référence Echinacea Glycoside, teneur 89,7 %, China Institute of Food and Drug Control, numéro de lot : 111670-

201706 ; l'acétonitrile est chromatographiquement pur (Merck, Allemagne) ; le méthanol et l'acide phosphorique sont analytiquement purs (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.) ; l'eau est de l'eau ultra pure.

2 Méthodes et résultats

2.1 Préparation de l'extrait aqueux de Cistanche deserticola

Prenez la poudre grossière de matière médicinale Cistanche deserticola, ajoutez 10 fois la quantité d'eau distillée, chauffez et refluez pour l'extraction deux fois, 1 heure à chaque fois, filtrez, combinez le filtrat et concentrez le filtrat avec un évaporateur rotatif. à une teneur en médicament brut de 0,100 g·mL-1, et stockez-le à 4 degrés pour une utilisation ultérieure.

2.2 Conditions chromatographiques et adéquation du système

Colonne chromatographique : colonne Inertsil ODS SP C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm) ; phase mobile : acétonitrile (A)-0, solution d'acide phosphorique à 4 % (B), élution en gradient : 0 ~ 5 min, 17 %

UN; 5 ~ 25 minutes, 20 % A ; 25 ~ 30 minutes, 17 % A ; longueur d'onde de détection : 333 nm ; température de la colonne : 30 degrés ; débit : 1,0 mL·min-1 ;

Volume d'injection : 10 µL. Dans ces conditions chromatographiques, la séparation entre l'échinacoside et les pics des composants adjacents est supérieure à 1,5, et le nombre de plaques théoriques basées sur le pic de l'échinacoside ne doit pas être inférieur à 4,000. Le chromatogramme est présenté sur la figure 1.

2.3 Préparation de la solution

2.3.1 Solution de substance de référence Pesez une quantité appropriée de substance de référence d'échinacoside, pesez-la avec précision, placez-la dans une fiole jaugée de 10 ml, ajoutez du méthanol pour la dissoudre et préparez une solution de substance de référence contenant 898,794 ug d'échinacéaside par ml, 4 degrés. Enregistrez pour une utilisation ultérieure.

2.3.2 Solution d'essai

Mesurer avec précision 2,0 mL d'extrait aqueux de Cistanche deserticola, évaporer à sec au bain-marie, ajouter du méthanol pour dissoudre, diluer au volume dans une fiole jaugée de 10 mL, bien agiter et filtrer avec une membrane microporeuse de 0,22 µm à obtenir.

2.4 Enquête sur la relation linéaire

Mesurez avec précision {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, 3.00 mL de la solution de référence au point 2.3.1, placez-la dans une fiole jaugée de 5 mL, ajoutez du méthanol pour compléter le volume et agitez bien pour obtenir un gradient de concentration de 44.{{17} }, 89.879 4. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 solution de référence, filtrée sur membrane microporeuse de 0,22 μm. Mesurer selon les conditions chromatographiques sous 2.2 et enregistrer la zone du pic. Effectuez une régression linéaire avec la concentration massique de la substance de référence en abscisse (X, ug·mL-1) et la zone du pic en ordonnée (Y), et l'équation de régression est obtenue : Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Les résultats montrent que l'échinacée a une bonne relation linéaire dans la plage de concentrations de 44,939 7 ~ 539,276 4 ug·mL-1.

2.5 Test de précision

Prendre 539,276 4 ug ·mL- 1 de solution de référence, injecter et mesurer 6 fois en continu selon les conditions chromatographiques indiquées en 2.2, et enregistrer la surface du pic. Les résultats ont montré que le RSD de la surface du pic de l'échinacoside était de 1,81 %, ce qui indique une bonne précision de l'instrument.

2.6 Essai de stabilité

Mesurer précisément 2,0 mL d'extrait aqueux de Cistanche deserticola, évaporer à sec au bain-marie, ajouter du méthanol pour dissoudre, diluer dans une fiole jaugée de 10 mL, bien agiter, filtrer avec un {{ 7}}.22 μm de membrane microporeuse, suivre les conditions chromatographiques du point 2.2 et placer à 0 et 2 respectivement. , Mesure d'injection sur 4, 8, 12, 24 h, enregistrez la zone du pic. Les résultats ont montré que la RSD de la surface du pic de l'échinacoside était de 1,16 %, ce qui indique que la solution d'essai présentait une bonne stabilité dans les 24 heures.

2.7 Test de répétabilité

Mesurer précisément 2,0 mL d’extrait aqueux de Cistanche deserticola et préparer 6 solutions d’essai en parallèle selon la méthode décrite en 2.3.2. Injecter des échantillons pour la mesure selon les conditions chromatographiques indiquées en 2.2 et enregistrer la surface du pic. Les résultats ont montré que le RSD duéchinacosidela concentration massique était de 1,28 %, indiquant une bonne répétabilité de la méthode.

2.8 Test de récupération d'échantillon

Mesurez avec précision 9 portions de 1,0 mL d'extrait aqueux de Cistanche deserticola, ajoutez 0,8, 1.0 et 1,2 mL de solution de référence (1,552 mg·mL{{11 }}) respectivement, évaporer à sec dans un bain-marie, ajouter du méthanol pour dissoudre et ajuster à une fiole jaugée de 10 mL ; Bien agiter et filtrer sur une membrane microporeuse de 0,22 μm pour préparer des solutions de test à haute, moyenne et faible concentration. Préparez 3 copies de chaque concentration en parallèle. Mesurer selon les conditions chromatographiques indiquées en 2.2. Enregistrez la zone du pic et calculez la récupération de l’échantillon. Taux. Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

2.9 Détermination du contenu de l'échantillon

Mesurer précisément 3 portions de 2,0 mL d'extrait aqueux de Cistanche deserticola, évaporer à sec au bain-marie, ajouter du méthanol pour dissoudre, diluer dans une fiole jaugée de 10 mL, bien agiter, filtrer avec une membrane microporeuse de 0,22 µm, et mesurer selon les conditions chromatographiques de 2.2. Enregistrez la surface du pic et calculez la teneur en échinacée. Les résultats sont présentés dans le tableau 2.

Tableau 1 Résultats des tests de récupération de l'échinacoside

Tableau 2 Résultats de la détermination de la teneur en échinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche herba