Les flavanols de cacao alimentaires améliorent la fonction mitochondriale dans le muscle squelettique et modifient le métabolisme du corps entier chez des souris en bonne santé

pour plus d'informations, contactez:tina.xiang@wecistanche.com

Résumé: Le dysfonctionnement mitochondrial est largement rapporté dans diverses maladies et contribue à leur pathogenèse. Nous avons évalué l'effet deflavanols de cacaosupplémentation sur la fonction mitochondriale et l'ensemble du métabolisme, et nous avons exploré si la désacétylase mitochondriale sirtuine-3 (Sirt3) est impliquée ou non. Nous avons exploré les effets de 15 jours de supplémentation en mucoviscidose chez des souris de type sauvage et Sirt3-/. Le métabolisme du corps entier a été évalué par calorimétrie indirecte, et un test oral de tolérance au glucose a été effectué pour évaluermétabolisme du glucose. La fonction respiratoire mitochondriale a été évaluée dans des fibres perméabilisées et la teneur en nucléotides pyridiniques (NAD plus et NADH) a été quantifiée. Chez le type sauvage, la supplémentation en mucoviscidose a considérablement modifié le métabolisme du corps entier en favorisant l'utilisation des glucides et en améliorant la tolérance au glucose. La supplémentation en FC a induit une augmentation significative de la masse mitochondriale, tandis qu'une adaptation qualitative significative s'est produite pour maintenir la production de H2O2 et le stress oxydatif cellulaire. La supplémentation en CF a induit une augmentation significative de la teneur en NAD plus et en NADH. Tous les effets mentionnés ci-dessus ont été atténués chez les souris Sirt3-7. Collectivement, la supplémentation en FC a stimulé le métabolisme du NAD qui stimule le métabolisme des sirtuines et amélioré la fonction mitochondriale, ce qui a probablement contribué à l'adaptation observée du métabolisme du corps entier, avec une plus grande capacité à utiliser les glucides, au moins partiellement via Sirt3.

Mots clés: flavanols de cacao; Métabolisme du NAD ; masse mitochondriale; métabolisme du glucose; Muscle squelettique

cliquez pour obtenir plus d'informations

1. Introduction

Les mitochondries sont des organites subcellulaires impliquées dans de multiples fonctions cellulaires, telles que la transduction d'énergie par phosphorylation oxydative mitochondriale et dans la production de peroxyde d'hydrogène mitochondrial ou l'activation de la mort cellulaire médiée par les mitochondries [1-3]. De nouvelles preuves suggèrent que le dysfonctionnement mitochondrial est impliqué dans de nombreuses pathologies et joue un rôle central dans leur pathogenèse [4]. Notre groupe a rapporté une atteinte mitochondriale chez des patients diabétiques de type 1 bien avant les complications cliniques [5]. De plus, une diminution de la capacité oxydative mitochondriale se produit avec le vieillissement, même chez les personnes en bonne santé [6]. Dès lors, l'identification de stratégies pour atténuer ces dysfonctionnements ou augmenter la masse mitochondriale sont des opportunités pour prévenir, ou du moins réduire, l'incidence de nombreux troubles ou augmenter la capacité aérobie des sujets sains.

Dans ce contexte, l'identification de composés sûrs et naturels qui améliorent la fonction mitochondriale et le métabolisme du corps entier avec ou sans effets secondaires limités est intéressante. Parmi les composés naturels,flavanols de cacao(CF) sont considérées comme des molécules prometteuses car il a été démontré que leur consommation affecte positivement la santé cardiovasculaire, la résistance à l'insuline ou la fonction immunitaire [7]. En effet, il a été démontré que le CF améliore le métabolisme du glucose, et une administration à court terme de CF est suivie d'une augmentation de la sensibilité à l'insuline, même chez les patients hypertendus intolérants au glucose [8,9].

Parmi les flavanols, la (-)-épicatéchine (EPI) est le monomère le plus couramment trouvé dans la mucoviscidose, et l'EPI est considérée comme la principale molécule biodisponible et bioactive de la mucoviscidose [10]. Un ensemble cohérent de preuves indique que la supplémentation en EPI améliore la fonction mitochondriale et/ou le contenu dans le muscle squelettique [11]. La supplémentation en EPI stimule plusieurs voies convergeant vers le coactivateur gamma du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes 1- alpha (PGCl) et les principaux complexes transcriptionnels nucléaires. L'EPI améliore directement la génération d'oxyde nitrique, qui stimule la biogenèse mitochondriale [11]. Parallèlement, les sirtuines 1 et 3 sont également stimulées par la supplémentation en EPI [11]. L'utilisation de proanthocyanidines, oligomèresflavonoïdesqui contiennent de l'EPI, il a été démontré qu'ils augmentent les niveaux intracellulaires de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD plus) grâce à l'augmentation de plusieurs précurseurs de la biosynthèse du NAD et à la régulation positive des niveaux d'ARNm de sirtuine -1 dans le foie de rat [12]. La famille des sirtuines (Sirt), une désacétylase dépendante du NAD, comprend sept membres qui diffèrent par leur distribution subcellulaire, leur spécificité de substrat et leurs fonctions cellulaires [13]. Sirt1, un membre largement étudié de cette famille, stimule la biogenèse mitochondriale en favorisant la désacétylation du PGCl , améliorant ainsi son activité transcriptionnelle [14]. Syrte, un capteur métabolique clé, a été stimulé après l'administration d'EPI [12,15-17]. Cependant, l'influence de l'EPI sur d'autres sirtuines n'a pas été explorée. L'évaluation de l'effet EPI sera particulièrement intéressante sur les sirtuines situées au sein des mitochondries (Sirt3, Sirt 4 et Sirt5), connues pour moduler l'activité du cycle de Krebs et des enzymes de la chaîne respiratoire [18]. Sirt3, qui est fortement exprimé dans les tissus à fort renouvellement métabolique et à contenu mitochondrial élevé, présente un intérêt particulier en ce qui concerne son rôle essentiel dans le maintien de la fonction mitochondriale normale grâce à la désacétylation réversible de la protéine lysine [19-21] De plus, Sirt3 joue un rôle important dans la régulation du métabolisme du corps entier [20. Il a été démontré que Sirt3 était altéré dans le muscle squelettique de modèles de diabète de type 1 et de type 2 et de maladies cardiovasculaires [22,23]. De plus, il a été suggéré que l'activation de Sirt3 pourrait représenter une stratégie thérapeutique prometteuse pour améliorer la fonction et le métabolisme des mitochondries [23,24]. Par conséquent, il est intéressant de déterminer si Sirt3 sous-tend une partie des effets bénéfiques de la supplémentation en mucoviscidose sur le métabolisme du corps entier et la fonction mitochondriale.

Dans cette étude, nous avons utilisé une approche intégrative pour étudier, chez la souris, l'effet d'une supplémentation en FC de 15- jours. Nous avons émis l'hypothèse que la supplémentation en FC : (i) modifierait le métabolisme du corps entier etmétabolisme du glucose, (ii) augmentent la fonction mitochondriale dans le muscle oxydatif et glycolytique dans les fibres perméabilisées, et (ii) stimulent le métabolisme du NAD. Nous avons également exploré l'implication putative de Sirt3 dans la biogenèse mitochondriale induite par la FK et le métabolisme du corps entier. Nos hypothèses étaient que les effets de la mucoviscidose sur le métabolisme du corps entier et la masse mitochondriale seraient atténués chez les souris Sirt3-7.

2. Méthodes

2.1. Animaux et alimentation

Pour cette étude, des souris mâles 129S1/SvlmJ 10-semaines ont été achetées chez Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Pour déterminer si les sirtuines sont impliquées dans l'adaptation de la masse et de la fonction mitochondriale induite par l'administration de CF, nous avons également utilisé des souris mâles knock-out Sirt3 âgées de 10- semaines sur la même souche que le type sauvage [25]. Les Sirt3/souris ont été utilisés pour explorer l'implication de Sirt3 dans la biogenèse mitochondriale induite par la mucoviscidose et les adaptations du métabolisme du corps entier. Les souris ont été maintenues dans une pièce à une température régulée de 23-25 degrés et un éclairage contrôlé (12-h cycles de lumière et d'obscurité). Les animaux avaient accès à de la nourriture pour rongeurs et à de l'eau du robinet à volonté.

Après au moins une semaine d'accoutumance dans l'animalerie, les animaux de laboratoire ont reçu une supplémentation en mucoviscidose par gavage oral d'un extrait naturel (302,1 mg/kg de poids corporel deux fois par jour pendant 15 jours) remis en suspension dans une carboxyméthylcellulose (Sigma-Aldrich, St. Louis , Mo, États-Unis). La composition de la poudre de cacao est décrite dans le tableau 1 et a été obtenue auprès de Naturex (Quart de Poblet, Espagne). La composition a été établie par la méthode de chromatographie liquide à haute performance et 100 mg de l'extrait équivaut à une moyenne de 475 mg de graines sèches de cacao. Les souris témoins ont reçu un véhicule composé d'un contenu similaire de théobromine et de caféine dissous dans de la carboxyméthylcellulose par gavage oral. La dose quotidienne a été déterminée selon les directives de l'industrie qui convertit la dose humaine en doses équivalentes animales en fonction de la surface corporelle, et nous avons multiplié la dose humaine par 12,3 [26]. Le gavage oral a été effectué par un technicien expérimenté.

2.2. Collection de tissus1

Vingt-quatre heures après le dernier gavage oral, les animaux non à jeun ont été anesthésiés à l'aide de kétamine et de xylazine (respectivement : 100 et 10 mg/kg). Le prélèvement de tissus a été effectué immédiatement après l'anesthésie. Le soléaire et la partie blanche du gastrocnémien ont été excisés. Les échantillons ont été soit immédiatement congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80 degré pour une analyse ultérieure, soit utilisés pour préparer des fibres musculaires dénudées.

2.3. Évaluations de l'activité métabolique et physique

La calorimétrie indirecte et l'activité physique spontanée ont été mesurées à l'aide du système complet de surveillance des animaux de laboratoire (CLAMS ; Columbus Instruments, Columbus, OH, États-Unis). Les souris ont été logées individuellement dans les chambres à 28 degrés, avec de la lumière de 07h00 à 19h00 et un accès ad libitum à la nourriture des rongeurs et à l'eau du robinet. Les souris ont été acclimatées aux cages métaboliques pendant trois jours avant le premier jour de la collecte de données. La collecte des données a été effectuée le quinzième jour de la supplémentation. La consommation d'oxygène (VO2), la production de dioxyde de carbone (VCO2) et le taux d'échange respiratoire (RER) ont été mesurés avec un débit d'air de 0.5 L/min et un échantillon d'air de 0.4 L/ min. Le pourcentage de fréquence cumulative relative (PCRF) de RER a été déterminé sur une période de 24- h, comme décrit précédemment par Riachi et al. (2004). En bref, le PCRF a été déterminé en ajoutant la fréquence de chaque point de données à la séquence d'incréments précédente (de 0,65 à 1,20 avec un incrément de 0,01) [27]. La flexibilité métabolique a été déterminée par la pente de Hill (valeur H) et le 50e centile (EC50) de la courbe PRCF et en mesurant l'amplitude du RER sur 24 h (Riachi et al.2004). L'activité physique générale a été surveillée à l'aide d'un système de capteur à faisceau infrarouge qui a détecté l'activité sur les axes x et z. Les comptages totaux (chaque fois qu'un faisceau est rompu) et les comptages ambulatoires (chaque fois qu'un nouveau faisceau est rompu) ont été évalués. Un compte X-total (X-TOT) est enregistré lorsque l'animal se déplace horizontalement de plus de 0,5 pouce et est représentatif d'activités répétitives à petite échelle, telles que le grattage et le toilettage. Le comptage X-ambulatoire (X-AMB) mesure la locomotion réelle en enregistrant un comptage uniquement lorsque l'animal brise un nouveau faisceau. Un comptage Z-total (Z-TOT) est enregistré lorsqu'un mouvement vertical de 1,5 po se produit, c'est-à-dire un élevage (Abreu-Vieira 2016). Pour estimer les glucides et les lipidesoxydationà partir de VO2 et VCO2, nous avons utilisé la table de quotient respiratoire non protéique de Péronnet et Massicotte précédemment utilisée chez la souris [28,29].

2.4. Corps total et masse grasse

La masse grasse totale et la masse maigre totale ont été déterminées chez des souris non anesthésiées par une analyse quantitative des interférences de résonance à l'aide de l'analyseur de résonance magnétique corps entier EchoMRI (Echo Medical System, Houston, TX, USA). La masse grasse totale représentait la somme de toutes les graisses du corps. La masse maigre totale comprenait principalement les muscles et les organes internes. La masse musculaire squelettique est connue pour représenter la plus grande partie de la masse maigre totale.

2.5.Test oral de tolérance au glucose (OGTT)

La glycémie a été mesurée à l'aide d'une goutte de sang prélevée de la queue avec un glucomètre (Accu-Chek Performa, Roche, Argentine). L'OGTT a été réalisé sur des souris à jeun depuis 5 à 6 h. La mesure a été effectuée le dernier jour de la supplémentation en FC. Après mesure de la glycémie basale (temps O), les souris ont ensuite reçu une injection per os d'une solution de glucose à 20 % dans de l'eau stérile à une dose de 1,5 g de glucose·kg de poids corporel-1. La glycémie a été mesurée à 15, 30, 60, 90 et 120 min après l'injection de la solution de glucose. L'aire incrémentale de la courbe de glucose a ensuite été calculée comme mesure de la tolérance au glucose.

2.6. Analyse qRT-PCR

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. L'ADNc a été synthétisé à partir d'ARN total (2 μL) à l'aide du supermix de transcription inverse iScript pour RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, USA). Les produits totaux de RT ont été analysés par réaction en chaîne par polymérase quantitative (PCR) à l'aide du 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG conformément aux spécifications du fabricant (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Canada). Le cycle a été réalisé dans un cycleur CFX96 (Biorad, Hercules, Californie ; conditions : 95 degrés C pendant 10 min et 40 cycles de 95 degrés pendant 30 s, 55 degrés pendant 45 s et 72 degrés pendant 45 s). A la fin de chaque cycle, l'absence de formation d'amorce-dimère et la présence d'un amplicon unique ont été confirmées à l'aide de la courbe de fusion. Les valeurs seuils du cycle (Ct) ont été utilisées selon la méthode 2-A△Ct pour analyser les données qPCR, avec la ß-Actine ou HPRT1 comme gène domestique【30】. Les valeurs quantitatives de RT-PCR étaient liées à celles du groupe témoin, qui étaient fixées à 1.

2.7. Activités enzymatiques

La mesure de l'activité spécifique des complexes de la chaîne de transport d'électrons et de la citrate synthase a été effectuée par spectrophotométrie comme décrit précédemment [31]. Des muscles gastrocnémiens blancs congelés pulvérisés (~ 30 mg) ont été homogénéisés avec un homogénéisateur vibrant à microbilles dans 500 uL de tampon d'homogénéisation (120 mM KCl, 20 mM d'HEPES, 2 mM de MgCl2, 1 mM d'EGTA et 5 mg·mL-I de BSA , pH 7,4) suivi de l'ajout de 500 μL de milieu hypotonique (phosphate de potassium 25 mM et MgCl 5 mM, pH 7,2). Les échantillons ont ensuite été soumis à trois cycles de cycles de congélation-décongélation dans de l'azote liquide. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 min à 600 x g à 4 degrés et le surnageant a été conservé sur de la glace jusqu'à l'analyse. La teneur en protéines a été déterminée dans le surnageant en triple exemplaire à l'aide d'un kit d'analyse de protéines Pierce BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

L'activité de la citrate synthase (CS) a été déterminée par spectrophotométrie à 412 nm après la réduction de 2 mM de 5,5'-dithio-bis(2-acide nitrobenzoïque) en présence de 0.1 mM d'acétyle -CoA et 12 mM d'acide oxaloacétique dans un tampon Tris 200 mM (pH 7,4). Le dosage de la NADH-décylubiquinone oxydoréductase (complexe I) sensible à la roténone a été réalisé à 340 nm à l'aide de l'accepteur 2,3-diméthoxy-5-méthyl-6-n-décyl-14-benzoquinone （ 80 μM) et NADH comme donneur d'électrons (200 μM) dans un tampon Tris 10 mM (pH 8,0). L'ajout de 4μM de roténone a été utilisé pour quantifier l'activité sensible à la roténone. L'activité de la cytochrome oxydase (complexe IV) a été réalisée à 550 nm en utilisant 10 μM de cytochrome c réduit comme donneur et 2,5 mM de n-dodécyl-ß-maltoside pour perméabiliser les deux membranes mitochondriales dans un tampon phosphate de potassium 100 mM (pH 7,0).

Tous les dosages enzymatiques ont été déterminés en triple, et les résultats ont été mis en relation avec ceux du groupe témoin, qui ont été fixés à 100.

2.8. Évaluation mitochondriale

La respiration mitochondriale et la production mitochondriale de H2O2 ont été étudiées in situ dans des fibres perméabilisées à la saponine en utilisant les muscles gastrocnémiens et soléaires blancs|1]. Brièvement, les fibres ont été séparées au microscope binoculaire dans la solution A à 4 degrés (en mM : 2,77 CaK2 EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl2, 20 taurines,0.5 DTT, 5{ {50}} K-méthane sulfonates, 20 imidazoles, 5,7 Na2 ATP et 15 créatine-phosphate, pH 7,1) et perméabilisé dans la solution A avec 50 ug·mL-I de saponine pendant 30 min à 4 degrés. La fonction respiratoire mitochondriale a été déterminée dans un oxymètre équipé d'une électrode de type Clark (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). La chambre a été remplie avec 1 mL de solution B (en mM : 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl, 20 taurine, 0,5 DTT, 50 K-méthane sulfonates et 20 imidazoles, pH 7,1) et après enregistrement teneur de base en oxygène dans la chambre, un paquet de 1-2 mg de poids sec de myofibres perméabilisées a été placé dans la chambre, qui a ensuite été scellée. Après les lectures de base, les ajouts suivants ont été effectués séquentiellement : palmitoyl carnitine et malate (160 μM∶5 mM), glutamate (10 mM), succinate (25 mM), roténone (0,5 μm), le découpleur CCCP (1 μM), antimycine -A (8 uM) et dichlorhydrate et ascorbate de N, N', N'-tétraméthyl-p-phénylènediamine (0,9:9 mM). La respiration a été mesurée à 23 degrés sous agitation continue. À la fin de chaque test, les fibres ont été soigneusement retirées de la cellule xylographique, buvardées et séchées au moins 24 h à ~ 80 ° C pour la détermination du poids des fibres. Les taux de consommation d'O2 (JO2) ont été exprimés en nmol O2 min-1.(mg poids sec)-I. Toutes les mesures ont été effectuées au moins en double.

La libération nette de H2O2 par les mitochondries respiratoires a été mesurée dans des faisceaux de fibres perméabilisées avec la sonde fluorescente Amplex Red（20 μM∶excitation-emission∶563-587 nm）, comme décrit précédemment [32]. Après préparation des fibres perméabilisées, des échantillons

destinés aux mesures de H2O2 ont été rincés trois fois dans du tampon Z (en mM : 110 K-Mes, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3MgCl, 6H2O et 0,5 mg : mL{ {14}} BSA, pH7,3 à 4 degrés). Des faisceaux de fibres ({{20}}.3-1.0 mg de poids sec) ont été incubés à 37 degrés dans une microcuvette en quartz avec agitation magnétique continue dans 600 uL de tampon Z (pH 7,3 à 37C) additionné de 1,2 U·mL-I de peroxydase de raifort. Les lectures de fluorescence de base ont été prises en l'absence de tout substrat respiratoire exogène. Les ajouts suivants ont ensuite été effectués séquentiellement : glutamate (5 mM), succinate (5 mM), roténone (0,5 uM), ADP (10 mM) et antimycine-A (8 μM). À la fin de chaque test, les fibres ont été soigneusement retiré de la cuvette, buvardé et séché pour déterminer le poids des fibres. Les taux de production de H2O2 ont été exprimés en AU·min-1.(mg poids sec)-I et par capacité oxphos qui correspondait à la respiration mitochondriale maximale en état de phosphorylation. Toutes les mesures ont été effectuées au moins en double.

La capacité de rétention du calcium mitochondrial (CRC) a été évaluée dans les fibres fantômes du muscle gastrocnémien blanc comme décrit précédemment [33]. En bref, les fibres ont été incubées dans une microcuvette en quartz sous agitation continue dans 600 μL de tampon CRC (en mM∶250 saccharose, 10 MOPS, 0,005 EGTA et 10P;-Tris, pH 7,3). Les fibres ont ensuite été exposées à une seule impulsion de 20 nM de Ca2 plus. Les modifications de la concentration de calcium extramitochondrial ont été surveillées par fluorimétrie à l'aide de vert de calcium 5N (1 mM : excitation-émission : 505-535 nm). La sensibilité des pores de transition de perméabilité (PTP) a été évaluée en mesurant le temps nécessaire à l'ouverture du PTP, et le CRC a été pris comme la quantité totale de Ca' accumulée par les mitochondries avant sa libération. À la fin de chaque test, les fibres ont été soigneusement retirées de la cuvette, buvardées et séchées pour déterminer le poids des fibres. Les valeurs de CRC ont été exprimées en nM de Ca2 plus par mg de poids sec.

2.9. Analyse Western Blot

Les protéines des muscles gastrocnémiens et soléaires blancs ont été diluées dans du tampon Laemmli et séparées sur des gels de polyacrylamide prémoulés Mini-PROTEAN TGX à 10 % (Biorad) ; un standard interne a été chargé sur chaque gel. La séparation électrophorétique a été effectuée à 200 V pendant 35 min dans un tampon de migration (TrisBase 25 mM, 0.2 M de glycine et 1 % de SDS (p/v)). La technologie Stain-Free (SF) contient un composé tri halo exclusif qui réagit avec les protéines, les rendant détectables par exposition aux UV. L'imagerie SF a été réalisée à l'aide du logiciel ChemiDoc MP Imager et Image Lab4.0.1 (Biorad, Hercules, Californie, États-Unis) avec un temps d'activation de la tache 5-min, et les modèles de protéines totales ont donc été visualisés. Les protéines ont ensuite été transférées sur une feuille de nitrocellulose de 0,2 um en utilisant le Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). La qualité du transfert a été contrôlée par des membranes d'imagerie utilisant la technologie SF. Après l'étape de transfert, les protéines carbonyle ont été dérivées avec de la dinitrophénylhydrazine diluée dans HCL 2N et ont finalement été lavées abondamment avec du méthanol. Les membranes ont été bloquées avec du lait en poudre écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tris contenant du Tween-20 (TBST : Tris/HCl 15 mM, pH 7,6, NaCl 140 mM et 0,05 % de Tween-20) pour 1h à température ambiante. Les membranes ont ensuite été incubées à 4 degrés pendant une nuit ou 2 h à température ambiante avec les anticorps primaires suivants : anticorps primaire de protéine carbonyle (Anti-DNP ; #STA-308, Cell Biolabs) et SOD2 (#Ab13533, Abcam). Après trois lavages de 10 min dans du TBST, les membranes ont été sondées avec des anticorps secondaires pour la protéine carbonyle (HRP-conjugué ;#STA-308, Cell Biolabs) et SOD2 (anti-lapin IgG-HRP lié ;#7074, Cell Signalling) dans une solution de blocage pendant 2 h à température ambiante et ont finalement été lavés abondamment avec du TBST. La dilution des anticorps primaires et secondaires a été optimisée pour chaque anticorps. La détection par chimioluminescence a été réalisée à l'aide d'ECL Clarity (Biorad) et la capture d'images a été effectuée avec ChemiDocMP. Toutes les images ont été analysées à l'aide du logiciel Image Lab 4.0.1. La normalisation des intensités des signaux protéiques a été effectuée après la quantification des niveaux respectifs de protéines totales sur les images SF, le contrôle de l'échantillon et les normes internes.

2.10. Mesure NAD

Les niveaux totaux de NAD et de NADH ont été mesurés dans des gastrocnémiens blancs homogénéisés à l'aide d'un kit commercial (#K337-100, Biovision, USA) et en suivant les instructions du fabricant. En bref, le pool total de NAD (NADt= NADt et NADH) a été extrait. Pour chacun des échantillons extraits, la moitié de l'échantillon a été chauffée à 60 degrés pendant 30 minutes pour décomposer le NADt tout en gardant le NADH intact. Les échantillons de NADt et de NADH ont été mélangés avec l'enzyme de cycle NAD et l'absorbance a été mesurée à 450 nm. NADt et NADH ont été quantifiés en comparant avec la courbe standard de NADH et en normalisant en mg de protéine. Enfin, le rapport du NAD plus (NADt-NADH) au NADH a été calculé. Tous les dosages ont été réalisés en triplicat.

2.11. Statistiques

Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± écart type (SD). La normalité des données a été évaluée à l'aide du test de normalité D'Agostino-Pearson. L'analyse des données a été effectuée à l'aide du test t de Student et de l'ANOVA bidirectionnelle (groupe et temps) pour des mesures répétées, suivies du test post hoc de Bonferroni à l'aide de Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis). Un niveau bilatéral de 5 % pour l'erreur de type I a été appliqué.

3. Résultats

3.1. Composition corporelle et métabolisme du corps entier

Quinze jours de supplémentation en FC, chez des souris de type sauvage (WT), n'ont pas modifié le poids corporel (p=0.091), la masse maigre (p=0.{{24} }73) et la masse grasse évaluée par EchoMRI (p=0.89 ; Figure 1A). Les taux de consommation d'O2 exprimés par masse maigre étaient significativement plus élevés dans le cycle d'obscurité (8±8 %, p=0.042), alors qu'ils restaient similaires dans le cycle de lumière (p =0 .392 ; Figure 1B.). Il n'y a eu aucun changement dans l'activité locomotrice (données non présentées). Les souris CF ont montré une augmentation significative de la dépense énergétique du corps entier de 15 ± 15 % (p =0.042 ; Figure 1C) et dans apport alimentaire (0,08 ± 0,01 vs 0,11 ± 0,01 g par poids corporel maigre, respectivement groupe CF et WT, p=0 0,013, figure 1D).

La supplémentation en mucoviscidose a modifié de manière significative le métabolisme du corps entier : l'effet principal d'un RER plus élevé dans le groupe mucoviscidose a été observé sur 24 h (p=0.023, figure 2A) et le RER moyen sur 12 h était plus élevé dans le groupe CF dans les cycles de lumière et d'obscurité( plus 5±3 %, p=0.035 et plus 9±4 %, respectivement, p=0.026). De plus, la supplémentation en CF a favorisé l'utilisation des glucides (CHO) (51 ± 13 % de la consommation d'énergie dépendait de l'oxydation des CHO dans le groupe CF contre 37 ± 12 % dans le groupe témoin pendant le cycle de lumière, p=0.108 et 71 ± 21 % dans le groupe CF contre 47 ± 24 % dans le groupe témoin pendant le cycle d'obscurité, p=0.004 ; Figure 2B.). Cependant, lorsqu'il est exprimé en kJ, il n'y avait aucune différence dans l'oxydation de CHO ni dans l'oxydation des acides gras (CHOoxydation : 3,7 ± 1,4 kcal·d-1 chez le témoin contre 4,4 ± 1,7 kcal.masse corporelle maigre-1). d-1 dans CF,p=0.33 et oxydation des acides gras : 2,3± 1,0 kcal·d-Iin contrôle vs.2,6±0,87 kcal.masse corporelle maigre-1.d{{ 50}}dans CF,p=0.608). L'analyse du PRCF de RER a révélé une augmentation des valeurs EC50 dans le groupe CF (p=0,009 ; Figure 2D) ce qui signifie que CF induit un changement vers une plus grande utilisation des glucides. Une diminution de la pente de Hill a été observée dans le groupe CF (valeurs H : 25,16 ± 4,44 chez les témoins contre 12,79 ± 3,96 dans le groupe CF,p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Bioénergétique mitochondriale

Nous avons testé l'effet de la supplémentation en CF sur l'énergétique des mitochondries dans le muscle gastrocnémien blanc et le muscle soléaire chez des souris WT. Une respiration mitochondriale supérieure utilisant des substrats IV complexes dans les muscles gastrocnémiens et soléaires blancs a été observée (p=0.004 et p=0.028, respectivement ; Figure 3A, B). Aucune modification des rapports respiratoires CII/CI et CIV/CI n'a été observée (p =0.899 et p =0.701 pour le gastrocnémien blanc et p=0.693 et ​​p{{ 11}}.912 pour les muscles soléaires, respectivement, données non présentées). De plus, les activités complexe, I, IV et citrate synthase ont été significativement augmentées dans le muscle gastrocnémien blanc (respectivement : plus 31 ± 27 %, p=0.004 ; plus 28 ± 38 %, p=0 0,027 ; plus 35±38 %, p= 0.009 ; plus 14±13 %, p=0.040;Figure 3C).La capacité des mitochondries à oxyder la palmitoyl-carnitine a tendance à augmenter dans le gastrocnémien blanc (plus 24 ± 12 %, p =0.096 ; figure 3D), alors qu'aucune différence n'a été observée dans le soléaire (p =0.363). Les taux relatifs de respiration stimulée par la palmitoyl-carnitine étaient inchangés lorsqu'ils étaient exprimés en fonction de la respiration du complexe I (62 ± 11 dans le groupe témoin contre 64 ± 20 dans le groupe CF chez le gastrocnémien blanc et 70 ± 18 contre 72 ± 16 dans le soléaire). Ensuite, nous avons exploré la sensibilité à l'ouverture PTP induite par Ca plus dans le gastrocnémien blanc. Comme le montre la figure 3E, ni le temps d'ouverture du PTP ni la capacité de rétention de Ca² n'ont été modifiés après la supplémentation en CF (p=0.608 et p=0.943, respectivement).

L'évaluation de l'ARNm des gènes impliqués dans la biogenèse mitochondriale a montré une régulation à la hausse de 70 % de l'ARNm de NRF1, alors qu'aucune différence n'a été signalée pour PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa et Cox2 (tableau 3). Nous avons exploré, sur quelques échantillons, l'effet de la supplémentation en FC sur les supercomplexes mitochondriaux (Figure S1, Matériel supplémentaire). L'analyse densitométrique suggère que la supplémentation en FC a augmenté la teneur globale en supercomplexes sans adaptation qualitative ni réarrangements. En effet, la densité respiratoire a été améliorée de 58 % en utilisant les sondes complexe I et complexe Ⅱ et de 93 % en utilisant la sonde complexe I. De même, le contenu complexe I et complexe III intégré dans les supercomplexes était plus élevé dans le groupe CF.

La supplémentation en CF réduit l'émission de ROS mitochondriale. Alors que l'émission de H2O2 est restée inchangée à la fois dans le gastrocnémien blanc et le soléaire lorsqu'il est exprimé par poids sec (figure 4A, B, respectivement), les taux ont diminué lorsqu'ils sont exprimés par contenu mitochondrial (figure 4C). Un effet positif principal de la supplémentation en mucoviscidose a été observé dans diverses conditions dans le gastrocnémien blanc (p<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Marqueurs de stress oxydatif dans le muscle squelettique

Le niveau de stress oxydatif des protéines cellulaires chez les souris WT n'a pas été affecté par la supplémentation en CF car le contenu cellulaire de SOD2 était similaire dans les groupes expérimentaux et témoins dans le gastrocnémien blanc et le soléaire (figure 4E). De plus, aucune différence n'a été observée dans la carbonylation des protéines dans le gastrocnémien blanc et le soléaire (figure 4F). De plus, aucune différence dans l'expression de l'ARNm de la catalase et de MnSod n'a été observée après la supplémentation en CF (tableau 3).

3.4. Métabolisme du NAD

Le pool total de nucléotides pyridiniques a augmenté de 36 ± 33 % (p=0.012) après la supplémentation en FC (p=0.012). }}.026 et 29± 42 %, p=0.017 ; Figure 5A, B) et le rapport NAD plus /NADH avait tendance à augmenter dans le groupe CF (p =0.084). Non un effet significatif a été observé pour l'ARNm de Sirt3 (p=0.096), l'ARNm de NMNAT (p=0.094) et l'ARNm de Sirt1 (p =0.869 ; Tableau 3 ).

3.5.Réponse du corps entier et du métabolisme cellulaire après une supplémentation en FC chez Sirt3-/souris

Nous avons examiné l'effet de la supplémentation en FC chez des souris Sirt{{0}}. La composition corporelle en poids, masse maigre et masse grasse n'était pas différente entre les groupes FC et témoin (p= 0.52,p=0.66,p=0.45, respectivement ; Figure 6A). De même, la dépense énergétique quotidienne n'a pas été affectée par la supplémentation en FC ({{10}}.38±0.{{40}}1 Kcal. corps maigre masse-1.day-1 chez les témoins vs. 0.39 ± 0.01 Kcal·masse corporelle maigre-1.day-1 dans CF, p=0.502 ; Figure 6B). Le RER était similaire entre les deux groupes dans les cycles clair et sombre (p=0.301 ; figure 6C), et l'oxydation du substrat n'a pas été affectée par la supplémentation en CF (44 ± 17 % de la consommation d'énergie dépendait de l'oxydation de CHO dans le groupe témoin contre 50 ± 11 % dans le groupe CF pendant la phase lumineuse, p=0.209 et 65 ± 19 % dans le groupe témoin contre 77 ± 21 % dans le groupe CF pendant la phase sombre, p=0.395 ; Figure 6D). La flexibilité métabolique évaluée par l'amplitude du RER sur 24 h est restée similaire entre les deux groupes (0,19 ± 0,05 dans le contrôle contre 0,20 ± 0,03 dans le CF, p=0.604), alors que la pente du PRCF a diminué dans le groupe CF (Valeurs H : 17,77 ± 4,38 dans le contrôle contre 12,79 ± 3,93 dans CF, p =0 0,039).

Ensuite, nous avons comparé l'effet de la supplémentation en FC sur les activités enzymatiques mitochondriales. La supplémentation en CF n'a pas réussi à augmenter l'activité enzymatique des complexes I, I, IV et CS chez Sirt3-/souris comme observé précédemment chez WT (respectivement : p=0.623,p=0 .629,p=0.283 et p=0.791, figure 6E). Une plus grande activité enzymatique du complexe et de l'IV a été observée chez les souris WT par rapport aux souris Sirt3-7après la supplémentation en FC ( respectivement : p=0.027 et P=0.045)

4. Discussion

Dans cette étude, nous fournissons une analyse intégrative de l'effet de l'ingestion de FC. Nous avons observé que l'ingestion chronique de CF améliorait la respiration mitochondriale et réduisait la production de H2O2, évaluée dans leur environnement de myofibres, alors que la susceptibilité à l'ouverture des PTP était inchangée. L'ingestion de FC a amélioré le métabolisme du NAD, soutenant l'implication des voies de la sirtuine dans les adaptations mitochondriales observées. Nous avons également observé des modifications du métabolisme du corps entier vers une plus grande capacité à utiliser les glucides comme substrat principal, ce qui suggère que les adaptations mitochondriales ont probablement contribué à l'adaptation observée du métabolisme du corps entier.

4.1.Métabolisme

L'administration alimentaire de flavanols de cacao a été identifiée comme une stratégie efficace pour soulager l'intolérance au glucose, offrant des opportunités d'améliorer les maladies métaboliques [34]. Nos résultats sont conformes aux études précédentes qui ont rapporté une augmentation de la tolérance au glucose suite à la prise de flavanols [35,36]. Les mécanismes proposés pour cet effet impliquent une augmentation de la translocation de GLUT4 vers la membrane cellulaire, une augmentation de la phosphorylation de l'AMPK et la régulation à la hausse de l'expression du gène UCP-2 dans le muscle squelettique [8,37] . De plus, l'ingestion de FC était associée à une amélioration de la sensibilité à l'insuline chez l'homme [8]. Après 15 jours de consommation de chocolat noir, une diminution de l'évaluation du modèle d'homéostasie de l'indice de résistance à l'insuline a été observée chez des sujets sains de manière concomitante à une augmentation de l'indice quantitatif de contrôle de la sensibilité à l'insuline et de l'indice de sensibilité à l'insuline [8]. Nous avons également observé une augmentation concomitante de la tolérance au glucose et de la flexibilité métabolique chez les souris WT, qui fait référence à la capacité d'un organisme à adapter l'oxydation du carburant à la disponibilité du carburant [38]. Fait intéressant, alors que la capacité oxydative mitochondriale altérée et l'oxydation du substrat associée étaient associées à la résistance à l'insuline 39, l'entraînement physique d'endurance augmentait le contenu mitochondrial, la sensibilité à l'insuline et la flexibilité métabolique [38]. Par conséquent, les présents résultats sont spécifiques à la supplémentation en mucoviscidose et ne sont pas influencés par l'activité spontanée.

L'effet positif du CF sur la flexibilité métabolique, ainsi que l'augmentation de l'activité des complexes mitochondriaux, ont été atténués chez les souris Sirt3-7, ce qui indique que les effets positifs du CF se produisent au moins partiellement via Sirt3. Ces résultats confirment les découvertes précédentes et le rôle central de Sirt3 sur la régulation de la flexibilité métabolique [24]. Nos résultats suggèrent qu'une augmentation de la fonction mitochondriale peut améliorer la flexibilité métabolique. Cependant, outre la fonction mitochondriale, le quotient respiratoire basal, le taux d'élimination du glucose, la capacité de stockage des lipides dans le tissu adipeux et la concentration plasmatique en acides gras libres ont également été identifiés comme des facteurs déterminants de la flexibilité métabolique et doivent être pris en compte [40]. Les études futures devraient évaluer plus en profondeur les déterminants cellulaires de la flexibilité métabolique afin d'approfondir notre compréhension des causes sous-jacentes de l'amélioration de la flexibilité métabolique après la supplémentation en FC.

L'évaluation du métabolisme du corps entier a révélé une augmentation de l'oxydation relative de CHO suite à la supplémentation en FC. Ce résultat contraste avec une étude précédente qui avait rapporté une augmentation de la lipolyse suite à une ingestion aiguë de flavanols ou à une supplémentation de deux semaines en flavan-3-ols chez la souris [36]. Outre les différences de composition de l'extrait, ces résultats contradictoires peuvent résulter des effets pléiotropiques du NO. Il est bien admis que l'ingestion de FC stimule la production ou la biodisponibilité du métabolisme du NO [7]. D'un côté, le NO stimule le transport et l'absorption du glucose dans le muscle squelettique. La stimulation de la production de NO dans les myotubes dérivés de lignées cellulaires par l'insuline ou le peroxyde d'hydrogène a entraîné une augmentation de la translocation de GLUT4, qui a été réduite avec l'inhibition de la nNOS [41]. De plus, le NO peut augmenter le transport du glucose dans une voie indépendante de l'insuline, entraînant une augmentation des niveaux de GMP cyclique et d'AMPK [42], ce qui favorise l'oxydation du glucose dans le muscle squelettique du rat indépendamment de la disponibilité et de l'oxydation des acides gras [43]. D'autre part, le NO favorise l'oxydation des acides gras en réduisant le niveau de malonyl-CoA via l'inhibition de l'acétyl-CoA carboxylase et l'activation de la malonyl-CoA décarboxylase dans le muscle squelettique [44]. Alors que nous avons observé un glissement vers une proportion relative plus faible d'utilisation d'acide gras comme substrat avec CF, il n'y avait pas de différence concernant les valeurs absolues exprimées en kJ. Cela suggère que l'augmentation de la dépense énergétique observée avec la supplémentation en FC repose sur une augmentation de l'oxydation du glucose. Par conséquent, ces résultats soutiennent l'idée que la consommation de FC augmente la sensibilité à l'insuline et favorise l'oxydation du glucose sans effet concomitant sur la capacité d'oxydation des acides gras. Ces résultats posent la question de la pertinence d'utiliser les flavanols de cacao dans le cadre d'un régime hyperlipidique. Des études futures devraient évaluer un éventuel effet nocif d'une association de supplémentation en mucoviscidose et d'un régime riche en graisses.

4.2.Fonction mitochondriale

Il a été démontré que l'administration alimentaire de flavanols de cacao améliore la fonction mitochondriale, y compris (i) la respiration mitochondriale et les activités enzymatiques de la chaîne de transport d'électrons ; (i) la libération mitochondriale de H2O2, qui reflète la production d'espèces réactives de l'oxygène mitochondrial (ROS) ; et (i) la capacité de rétention du calcium mitochondrial qui reflète la sensibilité à l'ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) (pour examen, voir [11]. Nos résultats sont conformes aux études précédentes ; néanmoins, notre étude a été la première à évaluer l'effet de Supplémentation en FC sur la fonction mitochondriale évaluée in situ dans des fibres perméabilisées et dans différents types musculaires Contrairement aux études précédentes sur des mitochondries isolées, l'évaluation de la fonction mitochondriale dans des fibres perméabilisées préserve la morphologie mitochondriale, les interactions fonctionnelles avec d'autres composants intracellulaires [1] et évite la structure mitochondriale perturbation au cours du processus d'isolement mitochondrial [32].Il est donc important d'étudier la fonction mitochondriale dans des préparations tissulaires où la structure mitochondriale est préservée et où l'ensemble du pool mitochondrial est représenté pour mieux évaluer la réponse au traitement.

Des études antérieures réalisées en culture cellulaire ou in vivo chez la souris ont montré que la supplémentation en EPI, qui est considérée comme la principale molécule bioactive dans la mucoviscidose, augmente la respiration maximale stimulée par l'ADP (par exemple, la respiration d'état 3) lorsque les mitochondries sont dynamisées avec une combinaison d'énergie substrats alimentant divers sites le long de la chaîne respiratoire [45-49]. Conformément à ces résultats, nous avons observé un effet principal de la supplémentation en FC sur la respiration mitochondriale dans les muscles oxydatifs et glycolytiques. Pour déterminer si cette augmentation est liée à une augmentation de la masse mitochondriale ou au remodelage des complexes respiratoires mitochondriaux, nous avons évalué les supercomplexes mitochondriaux du muscle quadriceps. On pense que ces structures supramoléculaires diminuent la production de ROS, stabilisent ou aident à l'assemblage de complexes individuels, régulent l'activité de la chaîne respiratoire et empêchent l'agrégation des protéines dans la membrane mitochondriale interne riche en protéines [50-52]. Malgré un nombre limité de mesures, l'analyse visuelle des résultats (matériel supplémentaire) suggère que la supplémentation en FC induit une augmentation de la masse mitochondriale, comme en témoigne une augmentation de toutes les espèces supercomplexes, plutôt que des réorganisations complexes spécifiques de la chaîne respiratoire. Collectivement, ces résultats suggèrent que la CF favorise une augmentation de la masse mitochondriale sans adaptation qualitative des arrangements complexes de la chaîne respiratoire.

Au cours de la respiration mitochondriale, des quantités variables de superoxyde sont formées et peuvent être métabolisées pour former d'autres types de ROS [53]. Bien que la production excessive de ROS par les mitochondries soit impliquée dans un large éventail de pathologies, de faibles concentrations physiologiques de ROS peuvent avoir des effets bénéfiques, tels que la protection contre les agents infectieux et la participation à la signalisation cellulaire [2,54]. Des études antérieures réalisées in vivo chez des rongeurs et des humains et des modèles de culture cellulaire ont rapporté des effets bénéfiques de la supplémentation en CF sur la production de ROS et divers systèmes antioxydants [11]. Par exemple, le gavage oral avec EPI pendant 15 jours augmente l'activité de la SOD2 et de la catalase dans les muscles quadriceps de la souris [17]. Bien que la production de ROS mitochondriales n'ait pas été largement évaluée, nous avons observé que les niveaux de production de ROS étaient similaires lorsque les valeurs étaient exprimées par poids musculaire, alors que la production était réduite lorsqu'elle était exprimée par masse mitochondriale, ce qui suggère que des adaptations qualitatives se produisent pour maintenir les concentrations physiologiques de ROS. De plus, nous n'avons observé aucun effet du CF sur la SOD2 ni les dommages induits par les ROS évalués par la carbonylation des protéines. Alors que la FC améliore les pools de protéines antioxydantes, y compris les niveaux de SOD2 et de catalase largement rapportés [16,17,55], cette adaptation n'était pas toujours associée à une diminution des dommages induits par les ROS [56-59]. Ces données soutiennent la théorie selon laquelle de faibles niveaux de production de ROS sont nécessaires pour l'homéostasie cellulaire normale [2]. Ensemble, ces résultats suggèrent que, parallèlement à une augmentation de la masse mitochondriale, la CF favorise des adaptations mitochondriales qualitatives pour améliorer sa capacité antioxydante et maintenir de faibles niveaux de production de ROS.

4.3. Biogenèse mitochondriale

La masse mitochondriale est le résultat de l'interaction entre la biogenèse mitochondriale et la mitophagie. Notre étude a porté sur la biogenèse mitochondriale activée par la consommation de polyphénols [60]. La biogenèse mitochondriale est le processus cellulaire qui améliore la masse mitochondriale. Ce processus complexe et hautement régulé implique plusieurs facteurs de transcription, des récepteurs hormonaux nucléaires et des coactivateurs de transcription qui agissent collectivement pour coordonner les changements dans l'expression des gènes codés par l'ADN nucléaire et mitochondrial [61]. Des études antérieures ont tenté d'identifier la ou les voies pouvant sous-tendre la biogenèse mitochondriale induite par la supplémentation en FK. La stimulation de la signalisation dépendante du NO est apparue comme une voie centrale impliquée dans la biogenèse mitochondriale. La supplémentation en CF améliore la génération de NO en inhibant l'arginase, une enzyme de dégradation de l'arginine, qui augmente la disponibilité de la L-arginine pour la biosynthèse du NO [62,63]. De plus, en utilisant un inhibiteur d'eNOS, l'effet stimulant de l'épicatéchine sur la biogenèse mitochondriale a été partiellement atténué [17]. Ces résultats suggèrent l'implication d'autres voies de signalisation pour stimuler la biogenèse mitochondriale.

Récemment, Aragones et al. (2016) ont rapporté que les proanthocyanidines alimentaires, membres de la famille des polyphénols, stimulent le métabolisme hépatique du NAD plus en améliorant la voie de biosynthèse de now o NAD plus et l'activité de Syrte de manière dose-dépendante chez le rat [12]. De plus, le foie exporte des précurseurs de NADt vers d'autres organes, tels que le muscle squelettique, qui ont une capacité plus faible à synthétiser le NAD, ouvrant la possibilité d'étendre les effets observés dans le foie à l'ensemble de l'organisme [64]. Alors que certaines études ont rapporté un effet de la supplémentation en mucoviscidose sur le contenu, l'activité ou l'ARNm de la protéine Sirt1 [12,15-17,65,66], l'implication du métabolisme du NAD dans la biogenèse mitochondriale après une supplémentation en mucoviscidose en utilisant la perte ou le gain de fonction n'a jamais été testée. Alors qu'un knock-out spécifique au muscle aurait été préférable aux souris Sirt3 KO du corps entier utilisées dans notre étude, nos résultats suggèrent que la FK améliore le métabolisme du NAD et que Sirt3 est impliqué dans cette amélioration de l'activité de la chaîne de transport d'électrons mitochondriale induite par la supplémentation. Les effets positifs observés sur l'activité des complexes mitochondriaux après la supplémentation en CF n'ont pas été observés avec des souris Sirt3-7 et une plus grande activité des activités des complexes I et IV a été observée après la supplémentation en CF uniquement chez WT. Ces observations prolongent les travaux antérieurs montrant que Sirt3 joue un rôle central dans la fonction mitochondriale ]67. Collectivement, ces résultats suggèrent que les sirtuines, par la modulation du métabolisme du NAD, sont impliquées dans l'amélioration de la masse mitochondriale observée après la supplémentation en CF. 4.4.Limites

Les fèves de cacao sont composées d'un mélange de flavanols monomères, oligomères et polymères. Parmi les flavanols, l'EPI semble être le monomère polyphénolique le plus abondant trouvé dans les produits à base de cacao, représentant jusqu'à 35 % de la teneur en polyphénols [68]. L'IPE a été établi comme la principale molécule bioactive sous-jacente aux avantages associés à la supplémentation en cacao et en chocolat [47,69]. Cependant, les métabolites de l'EPI (EPIm) peuvent être impliqués dans les effets biologiques induits par l'EPI observés dans les études in vivo. L'EPIm peut atteindre des concentrations plasmatiques plus élevées que l'EPI[70]. De plus, des différences majeures d'EPIm ont été observées entre les espèces. En effet, 80 % de l'EPIm présent chez l'homme n'a pas été détecté chez le rat, tandis que la similitude entre la souris et l'homme s'est avérée légèrement plus favorable car les deux principaux métabolites humains ont été détectés [70]. Nous avons utilisé un extrait CF enrichi contenant jusqu'à cinq fois plus d'EPI que les fèves de cacao non fermentées[71]. De plus, la teneur en EPI a été réduite de 10-20 % par fermentation et a diminué de manière dépendante de la température pendant la torréfaction [71,72]. Collectivement, ces données suggèrent que l'attention ne devrait être portée qu'au contenu du PEV lors de l'évaluation des avantages de la supplémentation en PEV sur la santé humaine, et les présents résultats doivent être considérés avec prudence avant d'extrapoler les mécanismes sous-jacents observés chez l'homme.

5. Conclusions

La supplémentation quotidienne en FC pendant 15 jours entraîne des améliorations de la fonction mitochondriale dans les muscles oxydatifs et glycolytiques. Les présents résultats suggèrent que l'augmentation de la respiration mitochondriale entraîne une augmentation de la masse mitochondriale alors que le niveau cellulaire de production de ROS est maintenu, suggérant des adaptations qualitatives au sein des mitochondries. Concomitant à l'effet cellulaire sur le métabolisme du NO décrit précédemment [73], le CF module le métabolisme du NAD, ce qui stimule l'activité des sirtuines. Sirt3 joue un rôle central dans les adaptations mitochondriales et la flexibilité métabolique après la supplémentation en FC. Comme les sirtuines sont des cibles récentes dans la pathogenèse de diverses maladies, telles que le diabète ou l'asthme [74,75l, d'autres études exploreront l'intérêt potentiel de l'utilisation de la FK comme activateur naturel des sirtuines.

Références

1. Kouznetsov, AV ; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Analyse de la fonction mitochondriale in situ dans les fibres musculaires perméabilisées, les tissus et les cellules. Nat. Protocole 2008, 3, 965–976. [Référence croisée]

2. Sena, LA ; Chandel, NS Rôles physiologiques des espèces d'oxygène réactif mitochondrial. Mol. Cellule 2012, 48, 158–167. [Référence croisée]

3. Wacquier, B. ; Combettes, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Interaction entre les oscillations intracellulaires de Ca2 plus et le métabolisme mitochondrial stimulé par Ca2 plus. Sci. 2016, 6, srep19316. [Référence croisée]

4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Maladies mitochondriales : contribution des réponses au stress des organites à la pathologie. Nat. Rév. Mol. Cell Biol. 2018, 19, 77–92. [Référence croisée]

5. Heyman, E.; Daussin, F. ; Wieczorek, V.; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; et coll. Apport et utilisation de l'oxygène musculaire dans le diabète de type 1, de l'air ambiant à la chaîne respiratoire mitochondriale : y a-t-il une étape limitante ? Soins du diabète 2020, 43, 209–218. [Référence croisée]

6. Daussin, FN ; Boulanger, E.; Lancel, S. Des mitochondries à la sarcopénie : Rôle de l'inflammation et de l'implication de l'axe RAGE-ligand. Exp. Gérontol. 2021, 146, 111247. [Référence croisée] [PubMed]

7. Katz, DL ; Doughty, K.; Ali, A. Cocoa et Chocolate in Human Health and Disease. Antioxydant. Signal redox. 2011, 15, 2779-2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. L'administration à court terme de chocolat noir est suivie d'une augmentation significative de la sensibilité à l'insuline et d'une diminution de la pression artérielle chez les personnes en bonne santé. Un m. J.Clin. Nutr. 2005, 81, 611–614. [Référence croisée] [PubMed]

9. Grassi, D. ; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumberg, JB; Ferri, C. La tension artérielle est réduite et la sensibilité à l'insuline est augmentée chez les sujets hypertendus intolérants au glucose après 15 jours de consommation de chocolat noir à haute teneur en polyphénols. J. Nutr. 2008, 138, 1671–1676. [Référence croisée]

10. Ottaviani, JI ; Maman, TY ; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL La configuration stéréochimique des flavanols influence le niveau et le métabolisme des flavanols chez l'homme et leur activité biologique in vivo. Radic libre. Biol. Méd. 2011, 50, 237-244. [Référence croisée] [PubMed]