La dihydroquercétine améliore la neuroinflammation et le déficit de mémoire induits par le LPSⅠ

ABSTRAIT

La dihydroquercétine (DHQ) est une pentahydroxyflavanone qui a été utilisée comme complément important contre l'inflammation et la neuroinflammation liées au stress oxydatif. La neuroinflammation est l'activation du mécanisme de défense du système nerveux central, lors de l'exposition à des stimuli tels que l'amyloïde, les corps de Lewy, le lipopolysaccharide (LPS) et les espèces réactives de l'oxygène. C'est un médiateur physiopathologique important de plusieurs troubles neurodégénératifs, notamment la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques et autres.

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L'objectif de la présente étude est d'évaluer l'effet neuroprotecteur du DHQ, une puissante molécule antioxydante, contre la neuroinflammation induite par le LPS. Le premier jour de l'expérience (jour -1), la neuroinflammation a été induite par injection intracérébroventriculaire de LPS (5 ug/5 ul) dans chaque ventricule latéral chez les rats. DHQ0.5, 1 et 2 ug/kg ont été injectés dans la veine caudale dans les groupes respectifs de jour-2 à jour-10. Des études comportementales ont montré que le DHQ atténuait la perte de mémoire à long terme et de mémoire de travail induite par le LPS, évaluée respectivement par le test du labyrinthe plus élevé et du labyrinthe en Y.

En outre, les estimations biochimiques ont révélé que le DHQ atténuait de manière dose-dépendante la diminution induite par le LPS du niveau d'acétylcholine et augmentait l'activité de l'acétylcholine-estérase dans la région hippocampique. Le DHQ a également augmenté l'activité de la catalase et diminué la peroxydation de l'oxyde nitrique et des lipides altérée par l'injection de LPS.

Le DHQ a également atténué l'interleukine -6 dans le cerveau, qui s'est élevée lors de l'induction du LPS. La diminution de l'IL-6 est attribuée à son activité antioxydante. Par conséquent, le DHQ pourrait être un candidat thérapeutique potentiel dans la gestion de la neuroinflammation et des troubles neurodégénératifs associés.

1. Introduction

La neuroinflammation est le phénomène d'activation d'un mécanisme de défense du système nerveux central contre une variété de stimuli (Morales et al., 2015). C'est un médiateur physiopathologique important de la plupart des troubles neurodégénératifs, notamment la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques et autres (Lyman et al., 2014 ; Morales et al., 2015). Divers stimuli comprennent l'amyloïde, les corps de Lewy, le lipopolysaccharide (LPS) et les espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui sont des médiateurs cruciaux de la neuroinflammation (Lee et al., 2008 ; Streit et al., 2004).

Le LPS est un modèle établi pour étudier la relation entre la neuroinflammation et le comportement cognitif (Tripathi et al., 2017). Le LPS est également signalé comme induisant un comportement de type anxieux chez les modèles de souris et de rats (Bassi et al., 2012 ; Savignac et al., 2016). Bien que la physiopathologie exacte de la neuroinflammation par le LPS ne soit pas complètement connue, l'un des mécanismes est l'activation médiée par un récepteur de type péage (TLR)- 4 de NFκB, qui est un facteur de transcription pour de nombreuses cytokines pro-inflammatoires (Shih et al., 2015). Un mécanisme important de la neuroinflammation par le LPS est les dommages cellulaires dus à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et à l'activation des cytokines (Hsu et Wen, 2002).

Le LPS induit l'activation des astrocytes et de la microglie dans le SNC et une nouvelle augmentation de l'expression de l'IL-6 (Wang et al., 2015). L'IL-6 est un médiateur soluble ayant un effet pléiotrope sur l'inflammation, la réponse immunitaire et l'hématopoïèse et est considéré comme un marqueur de la neuroinflammation lorsqu'il est présent dans le SNC (Beurel et Jope, 2009). Le LPS provoque une neurodégénérescence et des défauts d'apprentissage et de mémoire (Shaw et al., 2001). Il est prouvé que les récepteurs muscariniques et nicotiniques de l'acétylcholine jouent un rôle dans le comportement d'apprentissage et la consolidation de la mémoire via la potentialisation à long terme (LTP) (Hasselmo, 2006).

Selon l'hypothèse cholinergique, la perte de la fonction cholinergique dans le SNC est significativement liée au déclin de la mémoire et les inhibiteurs de l'acétylcholine estérase sont des médicaments essentiels pour la gestion des symptômes liés à la démence dans la maladie d'Alzheimer (Davies, 1985). La neuroinflammation est impliquée de manière critique dans les troubles neurodégénératifs; cependant, les médicaments anti-inflammatoires conventionnels, tels que les anti-inflammatoires non stéroïdiens, ont produit des résultats mitigés et leurs effets toxiques n'ont pas été résolus (Woodling et Andreasson, 2016). Par conséquent, il est nécessaire d'explorer de nouveaux médicaments pour le traitement potentiel des troubles neuro-inflammatoires.

Divers produits naturels montrent des résultats prometteurs contre le stress oxydatif et la neuroinflammation, notamment la carnosine (Caruso et al., 2019), l'hédéragénine (Wang et al., 2020) et le resvératrol (Zhang et al., 2013). La dihydroquercétine (DHQ) est un puissant flavonoïde antioxydant présent dans les oignons, l'écorce maritime française, le chardon-Marie et l'écorce de sapin de Douglas (Weidmann, 2012).

On a découvert qu'il possédait un effet neuroprotecteur sur les cellules de culture neuronale de rat endommagées par le stress oxydatif (Dok-Go et al., 2003). Il a été rapporté qu'il améliore l'hépatite fulminante expérimentale de souris induite par la concanavaline-A et augmente l'expression de l'hème oxygénase-1 (HO-1) par le biais de la protéine kinase activée par un mitogène/facteur nucléaire érythroïde 2- lié 2 (MAPK/Nrf2) voie antioxydante dans les lignées cellulaires de macrophages RAW264 (Zhao et al., 2015).

Il a également été démontré que le DHQ inhibe les lésions d'ischémie-reperfusion cérébrale chez le rat en supprimant l'infiltration des leucocytes et en inhibant la cyclooxygénase -2 et l'expression de l'oxyde nitrique synthase inductible (Wang et al., 2006). Le DHQ a également atténué l'apoptose induite par l'inhibition du protéasome dans les cellules PC12 en supprimant l'activation de la voie mitochondriale et des voies dépendantes de la caspase-8 et de la bid par l'action antioxydante (Nam et al., 2015). Par conséquent, nous avons pensé qu'il serait prudent d'évaluer l'activité anti-neuro-inflammatoire du DHQ car il possède une puissante activité antioxydante.

Par conséquent, l'objectif de la présente étude est d'évaluer l'effet anti-neuro-inflammatoire potentiel du DHQ (0.5, 1 et 2 ug/kg) dans le modèle LPS chez le rat. L'analyse fonctionnelle du traitement au DHQ a été effectuée en estimant le débit sanguin cérébral et les tests comportementaux pour la mémoire de travail et à long terme, en dehors des effets de type anxiété, en utilisant respectivement le labyrinthe en Y et le test du labyrinthe surélevé plus. Le niveau d'activité de l'acétylcholine (ACh) et de l'acétylcholine estérase (AChE) a été étudié dans la région de l'hippocampe pour évaluer davantage l'apprentissage et la mémoire. L'activité antineuroinflammatoire du DHQ a été évaluée en estimant l'expression de l'IL-6.

2. Matériels et méthodes

2.1. Animaux d'expérimentation

Des rats mâles Wistar albinos consanguins de poids (260 x 20 g) ont été achetés auprès de Central Animal House; Institut des sciences médicales (IMS-BHU). Les expériences ont été réalisées en adoptant des directives (publication NIH numéro 85-23, révisée en 2011) et approuvées par le Comité institutionnel d'éthique animale de l'Université hindoue de Banaras (BHU ; Dean/2015/CAEC/1420). Les animaux ont été acclimatés pendant une semaine dans le laboratoire expérimental avant de commencer les expériences.

2.2. Produits chimiques

La dihydroquercétine (Disto-Pharmaceuticals, Inde), le LPS (E. coli, L3129), l'albumine de sérum bovin et le réactif de Griess ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). l'acide thiobarbiturique (TBA), le NADH, le succinate de sodium, l'azoture de sodium, le méthanesulfonate de phénazine (PMS) et le bleu de nitro tétrazolium (NBT) ont été achetés chez Merck (Darmstadt, Allemagne). Tous les autres produits chimiques et réactifs de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et de qualité analytique ont été achetés auprès de fournisseurs locaux.

2.3. Procédure expérimentale

La représentation schématique du programme expérimental a été représentée sur la Fig. 1. Le LPS a été injecté par voie intracérébroventriculaire (ICV) à l'aide d'un appareil stéréotaxique (Stoelting, USA). Les rats ont été anesthésiés avec du pentobarbital sodique; ip 45 mg/kg (Tripathi et al., 2017). L'animal a été fixé sur le cadre stéréotaxique, le cuir chevelu du rat a été incisé et le bregma a été positionné sur le cuir chevelu du rat. Toutes les coordonnées ont été définies à partir du bregma (0, 0) et percées à 0,8 mm en arrière du bregma, à 1,5 mm latéralement à la suture sagittale et à 3,8 mm sous la surface du cerveau (Hauss-Wegrzyniak et al., 1998).

Le LPS a été administré à tous les groupes, à l'exception de la simulation, à l'aide de l'injecteur stéréotaxique Quintessential. La solution de LPS a été injectée dans chacun des ventricules cérébraux latéraux à des concentrations de 1 ug/ul, à raison de 1 ul/min pendant 5 min avec un temps d'attente de 5 min entre les deux injections. Le groupe Sham a également été exposé à la chirurgie et seule une solution saline (véhicule) a été injectée. Tous les résultats du groupe fictif n'étaient pas significativement différents du groupe témoin, de sorte que le groupe n'a pas été inclus davantage. Pour limiter l'infection locale, après avoir suturer l'incision, nous avons appliqué de la bétadine (solution d'iode) jusqu'au jour -5, et 1 ml de solution saline normale a été injecté par voie intrapéritonéale pour prévenir la déshydratation chez les animaux (Jangra et al., 2021) .

Les rats ont été étroitement surveillés pendant la période de récupération et maintenus dans une pièce à 22-26 C. Cela a été considéré comme un jour -1, et après 24 h, lors de l'apparition de symptômes liés à un dysfonctionnement neuromoteur, les médicaments ont été administrés quotidiennement. pendant neuf jours. Tous les tests comportementaux ont été effectués le jour -10 et enregistrés à l'aide du tracker comportemental ANY-MAZE version 4.72 (USA). Les animaux ont ensuite été immédiatement tués par décapitation et les tissus de l'hippocampe ont été microdisséqués (Paxinos et Charles, 2006). Les tissus cérébraux ont été stockés à 80°C jusqu'à d'autres études mécanistes.

2.4. Administration de médicaments

Le DHQ a d'abord été dissous dans 10 ul d'éthanol, puis le volume a été complété en utilisant une solution saline normale pour obtenir une concentration de 1 mg/ml. La concentration d'éthanol dans la solution injectée était inférieure à 0.001 % (v/v) et la même concentration à l'exclusion du DHQ a été administrée au groupe de contrôle du véhicule. Auparavant, il a été rapporté que le DHQ améliore les lésions d'ischémie-reperfusion cérébrale chez le rat grâce à son effet antioxydant et à la modulation de l'activation du NFκB à la dose de 0,1 et 1,0 ug/kg, par voie intraveineuse (IV) quotidienne (Wang et al., 2006).

Par conséquent, nous avons mené une étude pilote pour évaluer la dose de DHQ IV et finalisé trois doses de DHQ {{0}}.5 ug/kg, 1 ug/kg et 2 ug/kg. En suivant le principe de la randomisation, le regroupement a été effectué en prenant neuf animaux dans chaque groupe comme suit : (a) Contrôle, (b) LPS (c) LPS þ DHQ 0,5 ug/kg, (d) LPS þ DHQ 1 ug/kg, (e) LPS × DHQ 2 ug/kg. Il n'y avait pas de groupe par se dans l'expérience pour vérifier l'effet du DHQ seul sur les rats car les effets toxiques et thérapeutiques du DHQ sont bien connus (Booth et DeEds, 1958 ; Sunil et Xu, 2019).

2.5. Mesure du débit sanguin cortical

Le CBF a été enregistré à l'aide d'un système d'imagerie du flux sanguin par chatoiement laser (zone oméga OZ-2 STD, Tokyo, Japon). Les rats ont été anesthésiés et leurs os du crâne ont été exposés par une incision médiane du cuir chevelu et placés sur la feuille d'éponge noire sous le support de bras. Le support de bras contient la caméra CCD, l'objectif (ZM10–18, MF12) et l'unité laser (780 nm pour la mesure et 650 nm pour le positionnement).

Des images brutes de chatoiement ont été enregistrées à partir de la surface du crâne à l'aide du logiciel LSI (LSI ver.3.3, Omegawave, Inc., Tokyo, Japon), et le débit sanguin cérébral moyen a été déterminé par une analyse plus approfondie des images à l'aide du logiciel LIA (LIA ver.3.3, Omegawave, Inc., Tokyo, Japon). La feuille noire ne reflète pas la lumière laser et l'effet rend l'image du flux sanguin claire (Paliwal et al., 2018).

2.6. Tests comportementaux

2.6.1. un test de labyrinthe en Y

L'appareil Y-maze aide à évaluer la mémoire de travail, le comportement exploratoire général et la mémoire spatiale. L'appareil Y-maze est composé de trois bras identiques ayant des dimensions de 32 cm de hauteur, 50 cm de longueur et 16 cm de largeur, qui sont inclinés à 120⁰ les uns par rapport aux autres. Des balles en plastique de différentes couleurs ont été placées autour des bras, et celles-ci n'ont pas été changées à chaque fois avant le test pour maintenir la nouveauté pour les animaux. De la litière sale pour animaux était étalée sur le sol du labyrinthe pour donner une atmosphère chaleureuse. Dans l'essai 1, le nouveau bras du labyrinthe en Y a été maintenu fermé et les animaux étaient libres de se déplacer dans les deux bras pendant 15 min.

L'essai 2 a été réalisé exactement après 4 h de l'essai 1, dans lequel les animaux avaient libre accès pendant 5 min aux trois bras. Toutes les entrées ont été enregistrées à l'aide du logiciel ANY MAZE. Le comportement de curiosité a été calculé à partir du nombre total d'entrées dans les trois bras. Le pourcentage d'entrées de bras dans les bras nouveaux et connus est considéré comme indicatif de la mémoire de reconnaissance spatiale. Le comportement d'alternance spontanée signifie la mémoire de travail dans laquelle nous observons la fréquence à laquelle un animal répète ses choix initiaux d'entrées de bras. Une entrée de bras est comptée lorsque l'animal a la tête et les pattes avant à l'intérieur d'un bras (Garabadu et al., 2015 ; Joshi et al., 2014).

2.6.2. b test de labyrinthe surélevé plus

Le test EPM (Elevated Plus Maze) a été réalisé pour évaluer l'anxiété et le comportement de la mémoire spatiale à long terme dans un appareil fabriqué. L'EPM fabriqué se composait de deux bras ouverts (50 10 cm) et de deux bras fermés (50 10 40 cm) la hauteur du toit du bras ouvert était de 50 cm du sol. La latence de transfert (TL) a été réalisée pour évaluer la mémoire spatiale à long terme.

TL a été mesuré comme le temps mis par l'animal pour se déplacer dans l'un des bras fermés avec les quatre pattes. L'animal a été doucement poussé dans un bras fermé si l'animal n'entre pas dans le bras fermé dans les 90 s. Dans un tel cas, TL a été compté comme 90 secondes. Le jour -10, l'essai a été réalisé dans lequel les rats ont été autorisés à explorer le labyrinthe pendant 2 min. Cette tâche a été répétée après 24 h pour évaluer la rétention de la mémoire. Les entrées en pourcentage et le temps passé dans le bras ouvert ont été considérés comme une mesure de l'anxiété (Krishnamurthy et al., 2013).

2.7. Estimations biochimiques

2.7.1. une préparation des échantillons

L'homogénat de tissu d'hippocampe a été préparé en prélevant du tissu d'hippocampe dans 1 ml d'acide perchlorique 0.1 M dans un homogénéisateur Potter – Elvehjem avec une trituration unidirectionnelle circulaire fine. L'homogénat ainsi obtenu a été prélevé dans un tube en polypropylène dans lequel 5 0 ul d'acétate de potassium 4 M ont été ajoutés pour atteindre son pH 4,0, puis il a été centrifugé pendant 15 min à 4000 g. Le surnageant ainsi obtenu a été utilisé pour l'estimation de l'activité de l'acétylcholine (Ach) et de l'acétylcholine estérase (AchE) (Muthuraju et al., 2009).

2.7.2. Dosage spectrofluorimétrique de l'acétylcholine

Le kit de dosage amplex rouge a été utilisé pour trouver la quantité d'acétylcholine dans l'homogénat. La réaction a été démarrée en ajoutant un réactif de travail Amplex Red/HRP/choline oxydase/AChE dans le tube d'homogénat. Il a été incubé pendant 30 min et la fluorescence a été enregistrée à l'aide d'un lecteur de microplaques (BioTek, Synergy H1M, USA) à des longueurs d'onde d'excitation de 530 nm et d'émission de 590 nm (Zoukhri et Kublin, 2001).

2.7.3. b estimation de l'activité AChE

Le kit de test Amplex Red AChE (Molecular Probes, Inc., USA) a été utilisé pour mesurer l'activité de l'AChE. L'estimation a été faite selon les instructions du fabricant. Les réactifs ont été ajoutés à l'échantillon et ont été conservés pour incubation. Après incubation, la fluorescence a été déterminée à l'aide d'un lecteur de microplaques (BioTek, Synergy H1M, USA) à une longueur d'onde d'excitation de 530 nm et une longueur d'onde d'émission de 590 nm

2.7.4. c estimation du niveau de nitrite

Le niveau de nitrite a été estimé selon la méthode donnée par Green (Green et al., 1982). 50 ul du surnageant obtenu à partir de l'homogénat de cerveau ont été mélangés avec 5 ul de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH), 10 ul de flavine adénine dinucléotide (FAD) et 5 ul de nitrate réductase. Le mélange a été incubé pendant 1 h à 37 C dans l'obscurité. Du sulfate de zinc a été ajouté pour précipiter les protéines.

Après centrifugation (6000 g), des volumes égaux de surnageant (100 ul) et de réactif de Griess (100 ul) (mélange 1:1 de 1 % de sulfanilamide dans 3 % d'acide orthophosphorique et 0,1 % de naphtyl éthylène diamine) ont été mélangés et incubés pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité. Les plaques ont ensuite été lues à 540 nm par un spectrophotomètre UV et les NOx ont été calculés en utilisant une courbe standard de nitrite de sodium.

2.7.5. d Estimation de la formation mitochondriale de LPO ou de malondialdéhyde (MDA)

La teneur en MDA mitochondrial a été mesurée en suivant le protocole standard (Ohkawa et al., 1979). L'homogénat a été bouilli avec 10 % de SDS, de KCl (1,15 %), d'acide acétique (20 %) et de TBA (0,8 %). Après refroidissement à l'eau courante, il est extrait au n-butanol. La couche organique ainsi obtenue par centrifugation a été mesurée à 532 nm. La concentration de MDA a été exprimée en micromoles de MDA par milligramme de protéine.

2.7.6. e-évaluation de l'activité de la catalase

L'activité catalase a été dosée selon la méthode de Luck (1974). Les homogénats de cerveau ont été centrifugés à 10,000 rpm pendant 10 min dans une microcentrifugeuse Eppendorf. Les aliquotes de surnageant ont été mélangées avec du tampon phosphate et du peroxyde d'hydrogène. L'absorbance a été mesurée à 240 nm pendant 3 min à un intervalle de 30- s. A partir de la diminution de l'absorbance, l'activité enzymatique a été calculée (Correa et al., 2000).

2.7.7. f estimation de IL-6 à l'aide du kit ELISA

La cytokine IL{{0}} a été estimée dans un homogénat de cerveau à l'aide d'un kit ELISA disponible dans le commerce pour l'IL de rat-6 (NOVEX™, Thermo Fischer, USA). Les échantillons de cerveau ont été mis en suspension dans une solution tampon (1 % de Triton X100, aprotinine 200 U/ml, 0,1 mM de PMSF, 0,1 mM de chlorure de benzéthonium, 1 mM de benzamidine et 1 mM d'EDTA), puis centrifugés à 14, 000 g pendant 30 min à 4 C et le surnageant a été séparé pour l'estimation des cytokines. Les niveaux d'interleukine de cytokines pro-inflammatoires -6 (IL-6) dans des échantillons de cerveau entier ont été quantifiés à l'aide de kits ELISA conformément aux instructions du fabricant.

2.8. analyses statistiques

Toutes les valeurs sont exprimées en écart-type moyen (ET). Pour la mémoire spatiale dans la tâche EPM, une ANOVA bidirectionnelle à mesures répétées suivie d'un test post-hoc de Bonferroni a été effectuée pour la latence de transfert entre le jour -9 et le jour -10. De même, une ANOVA bidirectionnelle suivie d'un test post-hoc de Bonferroni a été réalisée pour la mémoire de reconnaissance spatiale et le test de comportement de curiosité des animaux dans le labyrinthe en Y afin d'évaluer l'activité locomotrice lors des sessions de sonde et de test.

Une ANOVA à une voie suivie d'un test post-hoc de Newman-Keuls de Student a été réalisée pour l'analyse de tous les autres paramètres comportementaux et biochimiques. Graph Pad Prism version 5 (San Diego, CA) a été utilisé pour appliquer les statistiques, et les groupes avec p <0.05 ont été considérés comme significativement différents.

Le mécanisme de la neuroprotection Cistancheeffet

Cistanche est une herbe médicinale traditionnelle chinoise qui a des effets neuroprotecteurs. Le mécanisme exact de son action n'est pas entièrement compris, mais il est de plus en plus évident qu'il pourrait être lié à sa capacité à augmenter l'expression de facteurs neurotrophiques et à réguler certaines voies de signalisation dans le cerveau.

L'un des principaux facteurs neurotrophiques que Cistanche augmente est le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Le BDNF est une protéine qui joue un rôle clé dans la croissance, la différenciation et le maintien des neurones dans le cerveau. Des études ont montré que lorsque les niveaux de BDNF sont plus élevés, il y a une plus grande survie et plasticité neuronale, ce qui peut aider à protéger contre la neurodégénérescence.

Cistanche peut également être capable de réguler certaines voies de signalisation dans le cerveau qui sont impliquées dans la survie cellulaire et l'apoptose (mort cellulaire programmée). Par exemple, il a été démontré qu'il inhibe l'activité de la voie de la kinase N-terminale c-Jun (JNK), ce qui peut entraîner la mort des neurones dans certaines conditions. En inhibant JNK, Cistanche peut aider à protéger les neurones contre les dommages et à maintenir leur survie.

De plus, il a été démontré que Cistanche a des effets anti-inflammatoires et antioxydants, qui peuvent en outre aider à protéger les neurones contre les dommages et à maintenir leur fonction. Ces propriétés font de Cistanche un agent thérapeutique prometteur pour le traitement des maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson.

À suivre...

Qadir Alam, Sairam Krishnamurthy *

Laboratoire de neurothérapie, Département d'ingénierie et de technologie pharmaceutiques, Institut indien de technologie (Banaras Hindu University), Varanasi, 221005, UP, Inde