L'échinacoside module la voie CGAS-STING pour atténuer les lésions inflammatoires induites par le LPS dans les cellules épithéliales alvéolaires (A549)

 

Auteurs :Jianfeng Luo ; Tao Baï
Affiliation :Service 1, Département des maladies infectieuses, hôpital Wuhan Jinyintan, Wuhan 430000, Hubei, Chine

 

Points clés à retenir (pour les lecteurs de R&D sur les ingrédients naturels et les suppléments)

L'exposition au LPS a blessé les cellules épithéliales alvéolaires A549, réduisant les marqueurs de prolifération et augmentant l'apoptose et les cytokines inflammatoires.

L'échinacoside (ECH) a montré une protection dose-dépendante: amélioration de la viabilité/prolifération cellulaire et réduction de l'apoptose et des médiateurs inflammatoires.

Mécaniquement, les avantages étaient associés àrégulation négative de l'axe de signalisation cGAS – STING – TBK1 – IRF3aux niveaux de l’ARNm et des protéines.

Un activateur de la voie cGAS-STING (RocA) effets protecteurs de l'ECH affaiblis / contrariés, favorisant l’implication dans le parcours.

Pertinence pour le développement botanique : Cistanche(肉苁蓉) est largement reconnu comme une plante botanique riche en échinacoside, ce qui en fait un matériau pratique en amont à considérer pour la R&D de produits, tout en gardant à l'esprit que cette étude estin vitroet utilise de l'ECH purifié.

Tableau 1. Effets de différentes concentrations d'ECH et de RocA sur les cellules A549 (OD570_{570}570​, xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Concentration (µmol/L)	ECH (OD570_{570}570​)	RocA (OD570_{570}570​)
0	0.45 ± 0.03	0.43 ± 0.04
3	0.42 ± 0.05	0.45 ± 0.06
6	0.43 ± 0.04	0.42 ± 0.05
9	0.46 ± 0.06	0.46 ± 0.07
12	0.44 ± 0.05	0.44 ± 0.05
24	0.47 ± 0.06	0.20 ± 0.03¹

Valeur F/P :ECH : 0,857 / 0,521 ; RocA: 22.050 /<0.001
Note:Par rapport à 0 μmol/L : ¹ P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Résumé (réécrit en anglais, point par point)

Objectif

Pour évaluer siéchinacoside (ECH)protège les cellules épithéliales alvéolaires humaines delésion inflammatoire induite par les lipopolysaccharides (LPS), et si cette protection est liée à la réglementation ducGAS–STINGvoie de signalisation.

Méthodes (conception de l'étude)

Modèle de cellule :Lignée de cellules épithéliales alvéolaires humainesA549.

Dépistage de cytotoxicité/viabilité :Test MTT pour tester ECH et un activateur de la voie cGAS – STING (RocA) pour la toxicité.

Regroupement:

Contrôle (culture standard)

LPS (30mg/L)

LPS + ECH dose faible/moyenne/élevée (9, 12, 24 µmol/L)

LPS + ECH (24 µmol/L) + RocA (12 nmoles/L)

Points finaux :

Prolifération:Coloration EdUetPCNA(Tache occidentale)

Apoptose :Cytométrie en flux (Annexine V‑FITC/PI); Bax/Bcl‑2(Tache occidentale)

Inflammation:TNF‑, IL‑6dans le surnageant (ELISA)

Lectures de parcours :GAZc, ARNm de STING(qRT‑PCR) ;Protéines cGAS, STING, TBK1, IRF3(Tache occidentale)

 

Tableau 2. Comparaison du taux d'EdU-positif, de l'expression de PCNA, du taux d'apoptose, de l'expression de Bax/Bcl-2 et des niveaux de TNF-/IL-6 dans les cellules A549 parmi les groupes (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Groupe	Taux EdU-positif	PCNA/GAPDH	Taux d'apoptose (%)	Bax/GAPDH	Bcl-2/GAPDH	TNF- (ug/ml)	IL-6 (ng/ml)
Contrôle	57.38 ± 3.24	1.67 ± 0.15	4.38 ± 1.09	0.37 ± 0.06	1.63 ± 0.12	4.65 ± 1.08	18.47 ± 1.19
LPS	27.51 ± 1.68¹	0.49 ± 0.08¹	36.75 ± 2.31¹	1.59 ± 0.13¹	0.28 ± 0.06¹	30.71 ± 1.68¹	49.23 ± 2.75¹
ECH-L	33.72 ± 1.96²	0.86 ± 0.10²	29.16 ± 2.27²	1.24 ± 0.11²	0.67 ± 0.08²	22.58 ± 1.52²	41.78 ± 2.46²
ECH-M	40.59 ± 2.40²,³	1.27 ± 0.13²,³	21.93 ± 1.64²,³	0.85 ± 0.09²,³	1.08 ± 0.10²,³	15.83 ± 1.16²,³	32.64 ± 2.18²,³
ECH-H	48.21 ± 2.57²,³,⁴	1.58 ± 0.14²,³,⁴	13.86 ± 1.45²,³,⁴	0.49 ± 0.08²,³,⁴	1.35 ± 0.11²,³,⁴	7.91 ± 1.13²,³,⁴	23.59 ± 1.57²,³,⁴
RocA	35.79 ± 2.38⁵	0.92 ± 0.11⁵	25.74 ± 1.69⁵	0.93 ± 0.10⁵	0.74 ± 0.09⁵	19.76 ± 1.20⁵	36.78 ± 2.61⁵

Valeur F : 118.927; 85.600; 245.724; 131.552; 159.598; 321.852; 161.353
Valeur P :tous<0.001

Notes (comparaisons multiples) :
Par rapport àContrôle: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05
Par rapport àLPS: ² P<0.05P<0.05P<0.05
Par rapport àECH-L: ³ P<0.05P<0.05P<0.05
Par rapport àECH-M: ⁴ P<0.05P<0.05P<0.05
Par rapport àECH-H: ⁵ P<0.05P<0.05P<0.05

 

 

Résultats (principales conclusions)

Par rapport au contrôle,LPS:

DiminuéTaux EdU-positif,PCNA, etBcl‑2

Augmentétaux d'apoptose,TNF‑, IL‑6

Régulé positivementcGAS et STING au niveau de l'ARNm

AugmentéProtéines des voies Bax et cGAS – STING (GAZ c, STING, TBK1, IRF3)
(Tous statistiquement significatifs, P<0.05P<0.05P<0.05.)

Par rapport au LPS seul,ECH (9→12→24 μmol/L)en fonction de la dose :

Prolifération restaurée(taux EdU-positif et PCNA plus élevés)

Apoptose réduite(taux d'apoptose plus faible, Bax inférieur, Bcl‑2 plus élevé)

Inflammation supprimée(diminution du TNF‑ et de l’IL‑6)

Signalisation cGAS – STING régulée à la baisse(ARNm cGAS/STING inférieur ; protéines cGAS, STING, TBK1, IRF3 inférieures)
(Dépendant de la dose, P<0.05P<0.05P<0.05.)

RocA a contrecarréProtection de l'ECH dans des conditions de blessure au LPS (P<0.05P<0.05P<0.05), consistent with cGAS–STING pathway involvement.

Conclusion

ECHviabilité améliorée et activité proliférativede cellules épithéliales alvéolaires contestées par le LPS etapoptose et réponses inflammatoires supprimées. Le mécanisme de protection est probablement lié àinhibition/blocage de la signalisation cGAS-STING suractivée.

 

Contexte (pourquoi est-ce important)

Chez les patients exposés ou infectés par le LPS (un composant bactérien Gram négatif majeur),lésion pulmonaire aiguë (ALI)et sa forme sévèreSDRAsont des facteurs clés de morbidité et de mortalité. La pathologie caractéristique implique des lésions diffusesépithélium alvéolaireetendothélium capillaire, entraînant une fuite de la barrière et un œdème pulmonaire.

Malgré les progrès en matière de soins de soutien,les thérapies ciblées efficaces restent limitées, il est donc important d’identifier de nouveaux candidats médicaments et de nouvelles cibles.

Échinacoside (ECH)est un glycoside phényléthanoïde ayant des activités signalées, notamment des effets antioxydants, anti-inflammatoires, cytoprotecteurs et anti-apoptotiques.
Pour les développeurs de produits naturels :Cistanche (肉苁蓉)est une plante traditionnelle souvent mise en avant pour êtreriche en échinacoside, ce qui en fait un matériau source pratique lors de l'exploration de formulations orientées ECH, tout en nécessitant également un travail minutieux de normalisation et de traduction au-delà des analyses cellulaires.

LeVoie cGAS-STINGest un axe de détection de l'ADN cytosolique qui favorise la production d'interféron de type I et de médiateurs inflammatoires. Les preuves suggèrent queactivation excessivede cGAS – STING contribue à la pathologie inflammatoire et auto-immune, et que la suppression de cette suractivation peut aider à atténuer les lésions pulmonaires inflammatoires.

 

Matériels et méthodes (résumé R&D-friendly)

Lignée cellulaire et culture

Les cellules A549 ont été cultivées dansDMEM à faible teneur en glucoseavec10 % de SVFet1% d'antibiotiques, avec des changements moyens tous les 2 jours. Des expériences ont été réalisées à~80 à 90 % de confluence.

Réactifs (haut niveau)

ECH(informations sur le fournisseur répertoriées dans le document original)

LPS

RocA(utilisé ici commeActivateur de la voie cGAS – STING)

Kits de dosage : MTT, EdU, kit d'apoptose (Annexin V‑FITC/PI), kits ELISA pour TNF‑ et IL‑6

Dosages moléculaires : extraction d'ARN, transcription inverse, réactifs qRT‑PCR ; anticorps pour Western blot (PCNA, Bax, Bcl‑2, cGAS, STING, TBK1, IRF3, GAPDH)

Sélection de la dose (dépistage de la viabilité)

ECH (0 à 24 μmol/L)a montrépas de cytotoxicité significativedans les cellules A549 et donc9/12/24 µmol/Lont été utilisés.

RocAn'était pas toxique à l'intérieur0 à 12 nmoles/L, tandis qu'une concentration plus élevée réduisait la viabilité ;12 nmoles/La été sélectionné.

Induction et regroupement des blessures LPS

Une lésion du LPS a été induite par30 mg/L de LPS.

Les bras de traitement étaient tels que décrits dans le résumé (Contrôle ; LPS ; LPS+ECH faible/moyen/élevé ; LPS+ECH élevé+RocA).

Mesures des résultats

Prolifération:Cellules EdU-positives par microscopie à fluorescence ; PCNA par Western blot.

Apoptose :Cytométrie en flux (Annexine V‑FITC/PI) ; Niveaux de protéines Bax et Bcl‑2.

Médiateurs inflammatoires :TNF‑ et IL‑6 dans le surnageant de culture par ELISA.

Expression du parcours :ARNm cGAS et STING par qRT‑PCR utilisant GAPDH comme contrôle interne ; protéines (cGAS, STING, TBK1, IRF3) par Western blot.

Statistiques:ANOVA avec tests post-hoc SNK‑q (GraphPad Prism 9.0), signification fixée à P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Résultats (ce qui a changé avec LPS, ECH et RocA)

1) Fenêtre de viabilité cellulaire/toxicité

L'ECH a été bien tolérée jusqu'à la plage testée utilisée pour les études mécanistiques.

RocA nécessitait un dosage prudent ; une concentration de travail non toxique a été sélectionnée.

Figure 1. Prolifération des cellules A549 dans chaque groupe (coloration EDU, × 200)

 

2) La prolifération a été supprimée par LPS et restaurée par ECH

LPS réduitIncorporation de l'EdUetPCNAexpression, indiquant une diminution de l’activité proliférative.

L'ECH a augmenté les taux d'EdU-positifs et de PCNAde manière dose-dépendante.

L'ajout de RocA a réduit ces gains, ce qui suggère que la voie contribue à l'effet pro-survie/pro-prolifération de l'ECH.

3) L'apoptose a augmenté avec le LPS et a été inhibée par l'ECH

LPS a augmenté le taux d'apoptose, a augmentéBax, et a diminuéBcl‑2.

ECH a inversé ces changements en fonction de la dose (taux d'apoptose et Bax plus faibles, Bcl-2 plus élevé).

RocA a ramené le phénotype vers l'apoptose, affaiblissant la protection ECH.

Figure 2. Analyse par Western blot de l'expression de PCNA, Bax et Bcl-2 dans chaque groupe

 

4) Les cytokines inflammatoires (TNF-, IL-6) ont été réduites par l'ECH

Le LPS a augmenté le TNF- et l'IL-6 dans les surnageants.

L'ECH a réduit les deux cytokines de manière dose-dépendante.

RocA les a augmentés par rapport à la dose élevée d'ECH seule, ce qui est cohérent avec la réactivation de la voie amplifiant l'inflammation.

5) La transcription de cGAS et STING a été induite par le LPS et supprimée par l'ECH

LPS augmentéARNm de GASc et de STING.

ECH a réduit leur expression (dose‑dépendante).

RocA a augmenté l'expression par rapport à la dose élevée d'ECH.

Figure 3. Comparaison de l'apoptose des cellules A549 dans chaque groupe

 

6) Les protéines de la voie cGAS – STING ont été régulées négativement par ECH

LPS augmentécGAS, STING, TBK1 et IRF3expression des protéines.

L'ECH a réduit ces protéines en fonction de la dose.

RocA a augmenté les niveaux de protéines de la voie par rapport à une dose élevée d'ECH seule.

 

Tableau 3. Comparaison de l'expression des protéines de la voie cGAS/STING et de la voie cGAS-STING dans les cellules A549 parmi les groupes (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Groupe	ARNm de GASc	ARNm de STING	GAPc/GAPDH	STING/GAPDH	TBK1/GAPDH	IRF3/GAPDH
Contrôle	1.00 ± 0.12	1.00 ± 0.11	0.32 ± 0.07	0.36 ± 0.08	0.29 ± 0.05	0.25 ± 0.06
LPS	2.15 ± 0.16¹	2.28 ± 0.17¹	1.68 ± 0.13¹	1.85 ± 0.16¹	1.57 ± 0.13¹	1.62 ± 0.14¹
ECH-L	1.74 ± 0.13²	1.83 ± 0.14²	1.34 ± 0.12²	1.42 ± 0.13²	1.24 ± 0.11²	1.23 ± 0.12²
ECH-M	1.36 ± 0.11²,³	1.31 ± 0.12²,³	0.82 ± 0.09²,³	1.03 ± 0.11²,³	0.86 ± 0.09²,³	0.78 ± 0.09²,³
ECH-H	0.73 ± 0.09²,³,⁴	0.62 ± 0.08²,³,⁴	0.45 ± 0.08²,³,⁴	0.57 ± 0.09²,³,⁴	0.47 ± 0.08²,³,⁴	0.38 ± 0.07²,³,⁴
RocA	1.58 ± 0.12⁵	1.69 ± 0.15⁵	1.17 ± 0.11⁵	1.28 ± 0.14⁵	1.12 ± 0.10⁵	0.97 ± 0.10⁵

Valeurs F/P :

ARNm de GASc : 103,612 /<0.001

ARNm de STING : 124,857 /<0.001

GAZc/GAPDH : 160,066 /<0.001

STING/GAPDH : 124.141 /<0.001

TBK1/GAPDH : 150,139 /<0.001

IRF3/GAPDH : 158,576 /<0.001

 

Figure 4. Expression des protéines de la voie cGAS-STING dans les cellules de chaque groupe

 

Discussion (interprétation pour les lecteurs de produits et de mécanismes)

Le LPS est couramment utilisé pour modéliser les lésions pulmonaires inflammatoires. Ici, le LPS altère directement la capacité de prolifération des cellules épithéliales alvéolaires et favorise l'apoptose, accompagné d'une élévation du TNF- et de l'IL-6, deux cytokines largement liées aux lésions pulmonaires inflammatoires.

ECH a agi en tant queagent cytoprotecteur et anti-inflammatoiredans ce contexte in vitro, ce qui concorde avec les rapports antérieurs selon lesquels l'ECH peut atténuer le stress oxydatif, l'inflammation et l'apoptose dans les contextes de lésions pulmonaires.

L'axe cGAS – STING (et en aval TBK1/IRF3) semble être un nœud mécaniste :ECH a abaissé les marqueurs de la voie cGAS – STING, etRocA a émoussé les avantages d'ECH, confortant l'hypothèse selon laquelle l'ECH protège les cellules au moins en partie enbloquer l'activation excessive de cGAS – STING.

Ce que cela suggère pour le développement botanique naturel (contexte Cistanche)

Parce queCistanche (肉苁蓉)est connu pourteneur élevée en échinacoside, c'est un candidat botanique logique pour explorer les formulations centrées sur l'ECH visant les thèmes de l'équilibre inflammatoire et de la protection épithéliale.

Cependant, traduire cela en suppléments nécessite de la prudence : ce travail estbasé sur une lignée cellulaire, utiliseBlessure au LPSetECH purifiée, et n'établit pas l'efficacité chez l'homme, la biodisponibilité orale, le métabolisme ou la posologie cliniquement pertinente.

Limites et prochaines étapes (comme le sous-entendent les auteurs)

Les résultats doivent être validés dansmodèles ALI/ARDS in vivopour confirmer l'efficacité et le lien mécanistique avec cGAS – STING dans des conditions physiologiques.

Des travaux supplémentaires seraient nécessaires pour cartographier les déclencheurs en amont et confirmer si les effets sont une inhibition directe de la voie ou secondaire à un stress cellulaire réduit.

 

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À propos du fabricant d'extraits Cistanche (肉苁蓉) (pour les développeurs de produits)

Pour les équipes explorantBasé sur Cistanchedéveloppement d'ingrédients naturels, notamment des extraits standardisés positionnés autouréchinacoside-Les informations sur les antécédents et les capacités du fabricant peuvent être trouvées ici :
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