Effet de Shenkang sur la fibrose rénale et l'activation des fibroblastes interstitiels rénaux par la voie JAK2/STAT3

edmund.chen@wecistanche.com

Arrière plan

L'insuffisance rénale chronique (IRC) résulte d'une variété de maladies différentes qui endommagent de manière irréversible le rein et provoquent divers types de complications chez les patients [1]. Pour les patients sous dialyse, la qualité de vie est fortement affectée et les coûts médicaux sont très élevés [2]. Le processus pathologique primaire delésion rénaleconduit à la normalerénaldestruction du parenchyme et formation progressive de tissu cicatriciel, ce qui conduit finalement à la fibrose. Rénalla fibrose comprend la fibrose interstitielle tubulaire et la glomérulosclérose [3], conduisant à la destruction dertissu énal et la perte de fonction.Rénalla fibrose tubulo-interstitielle est la voie typique du développement progressif de presque toutes les maladies rénales chroniques et la principale base pathologique du stade terminalmaladie rénale,qui se caractérise par une atrophie des cellules épithéliales tubulaires, une infiltration de cellules inflammatoires, une activation aberrante et la croissance derénalfibroblastes et accumulation excessive de matrice extracellulaire (ECM) [4, 5]. Les cellules effectrices, les myofibroblastes positifs pour l'actine musculaire lisse (-SMA), synthétisent et sécrètent l'ECM. L'activation des fibroblastes interstitiels en myofibroblastes pourrait aider à réparer les tissus endommagés. Cependant, lorsque ce processus de réparation est anormal et qu'un excès d'ECM est sécrété, des lésions rénales irréversibles en résultent. En conséquence, la voie de signalisation qui médie l'activation des myofibroblastes peut être une cible pour atténuer le processus derénalfibrose.

CISTANCHE AMÉLIORERA LES MALADIES RÉNALES/RÉNALES

La voie Janus kinase/transducteur de signal et activateur de transcription (JAK/STAT) est une cascade de signalisation pléiotrope pour plusieurs facteurs de croissance et cytokines [6] qui assure la médiation de diverses fonctions cellulaires, notamment la survie et la prolifération cellulaires [7]. STAT3 est activé par la phosphorylation de la tyrosine (Tyr) au niveau de Tyr705 via la Janus kinase en réponse à une variété de facteurs de croissance et de cytokines, y compris le facteur de croissance transformant (TGF-) [8]. STAT3 phosphorylé forme des dimères, qui sont ensuite transférés dans le noyau, où ils se lient directement à la séquence d'ADN et régulent l'expression des gènes cibles [9]. L'activation de STAT3 et JAK2 est augmentée dans les fibroblastes interstitiels rénaux fibrogènes induits par une obstruction urétérale unilatérale (UUO) [10, 11]. Une augmentation de la phosphorylation de STAT3 a également été observée dans les cellules F NRK-49traitées au TGF- -traitées au TGF[12].

Les traitements actuellement largement utilisés pour l'IRC s'accompagnent souvent d'effets moins que satisfaisants [13] et d'effets secondaires courants. Ainsi, il est d'une grande importance d'étudier et d'identifier des mesures de traitement efficaces pour prévenir et contrôler l'apparition et le développement de l'IRC afin d'améliorer le pronostic des patients. Shenkang (SK) est une formule à base de plantes couramment utilisée qui contient de la rhubarbe (Rheum palmatum L. ou R. tanguticum Maxim. ex Balf.), de la sauge rouge (Salvia miltiorrhiza Bunge), du carthame (Carthamus tinctorius L.) et de l'astragale (Astragalus mongholicus Bunge). Depuis les années 1990, la SK est utilisée en Chine pour traiter l'IRC et les maladies apparentées, y compris la néphropathie diabétique (DN), lainsuffisance rénale, glomérulonéphrite, néphrite chronique etrénalinsuffisance. Avec ses effets thérapeutiques évidents et peu d'effets secondaires, la SK peut retarder la progression derénaldysfonctionnement dans l'IRC. Dans un essai clinique de 2200 personnes, l'efficacité de SK dans la protection contre les maladies chroniquesrénall'échec et les symptômes associés à l'IRC après un traitement par la médecine traditionnelle chinoise étaient de 73,05 et 98,00 %, respectivement. De plus, le taux de clairance de la créatinine et le taux de créatinine sérique (SCr) sont restés stables, ce qui montre que la SK a une bonne efficacité et est sans danger pour le traitement de l'IRC [14]. Il a été vérifié que SK est capable de soulager l'IRC etrénalfibrose en atténuant la fibrose, l'inflammation [15] et l'apoptose [16]. Cependant, la plupart des études existantes sur le sujet n'étaient pas suffisamment complètes et se concentraient principalement sur le TGF- et les voies associées. Le modèle UUO est reconnu comme un modèle expérimental pour étudier la fibrose rénale. Dans la présente étude, nous avons étudié les effets de SK sur l'activation des cellules fibroblastes NRK-49F et la fibrose rénale chez des souris UUO. Nous avons en outre démontré que ces effets curatifs de SK peuvent avoir été obtenus en ciblant la voie JAK2/STAT3 dans des cellules F NRK-49 cultivées et un modèle de souris UUO.

Mots clés:Shenkang, Maladie rénale chronique, Fibrose rénale, UUO, Activation des fibroblastes rénaux, Voie JAK2/STAT3

Méthodes

Produits chimiques et réactifs SK a été acheté auprès de Shijishenkang Pharmaceutical Company, Ltd. (Xi'an, Chine). Les comprimés de potassium de losartan ont été achetés auprès de Merck Sharp & Dohme Pharmaceutical Company, Ltd. (Hangzhou, Chine).

Culture de cellules

La lignée cellulaire de fibroblastes de rein de rat (NRK-49F) a été obtenue auprès de l'American Type Cell Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Les cellules NRK-49F ont été cultivées dans un milieu complet, c'est-à-dire le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (Invitrogen, Californie, États-Unis) contenant 5 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline et de streptomycine dans une atmosphère de 5 % de CO 2 et 95 pour cent d'air à 37 degrés. Ensuite, les cellules ont été traitées avec ou sans TGF- 1 (10ng/mL) (Novoprotein, Shanghai, Chine), un bloqueur des récepteurs de l'angiotensine (ARB) (1 mg/mL) et des concentrations de gradient de SK après adhérence, et la viabilité cellulaire a été évaluée.

Essais de viabilité cellulaire

La viabilité des cellules F NRK-49a été déterminée à l'aide du kit de comptage de cellules-8 (Dojindo, Kyushu, Japon) conformément aux instructions du kit. Les cellules NRK-49F ont été étalées à une densité de 5 ×10 4 cellules par puits dans des plaques 96-puits. Il y avait 5 répétitions pour chaque traitement. Après 24h ou 48h de culture, le milieu de chaque puits a été remplacé par 100 μL de milieu sans sérum contenant de la CCK-8 (10 :1), et les cellules ont été incubées dans un incubateur pendant encore 2 h. L'absorbance a été mesurée à une longueur d'onde de 450 nm. L'effet du traitement a été calculé comme le pourcentage de cellules vivantes par rapport aux cellules témoins vivantes traitées avec le véhicule uniquement.

Animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité de protection des animaux et d'éthique de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Pékin (n° BUCM{{{{30}}}},018,{ {39}}60,419-2023) et conformes aux principes internationalement reconnus d'utilisation et de soin des animaux de laboratoire. Trente-six 8-souris mâles C57BL/6 âgées d'une semaine ont été achetées auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (SYXK (Jing), 2017–0{ {51}}33). Les souris ont été placées dans un laboratoire spécial pour animaux exempt d'agents pathogènes dans une pièce climatisée (lumière : 12-h cycle lumière/obscurité ; température ambiante : 25±1 degré ; humidité relative : 50± 10 pour cent) et répartis au hasard dans les six groupes suivants : le groupe fictif, le groupe UUO, le groupe ARB et les groupes SK à dose élevée, modérée et faible. L'UUO a été induite chez les souris du groupe UUO, du groupe ARB et des groupes SK à dose élevée, modérée et faible selon une procédure préalablement établie. L'anesthésie a été induite avec 2 % d'isoflurane et maintenue avec 1,5 % d'isoflurane. Une incision longitudinale de 1- à 2- cm a été pratiquée dans le milieu de l'abdomen gauche, et l'uretère gauche a été séparé sans ménagement, ligaturé à deux endroits, puis coupé entre les deux ligatures. Ensuite, la cavité abdominale a été fermée, après quoi une analgésie a été administrée pendant 3 jours. Les souris du groupe fictif ont subi des procédures chirurgicales similaires, y compris une anesthésie pré et postopératoire, une laparotomie et une séparation franche de l'uretère, sans ligature ni incision urétérale. Dès le deuxième jour après l'obstruction, le losartan a été administré par voie intragastrique aux souris du groupe ARA à la dose de 0,13mg/10g (0,15mL/10g). SK à une dose élevée de 0,08 g/10 g (0,13 ml/10 g), une dose modérée de 0,04 g/10 g (0,13 ml/10 g) ou une faible dose de 0,02 g/10 g (0,13 ml/10 g) a été administrée à souris du groupe SK via la veine caudale pendant 14 jours après la ligature urétérale. Une solution saline (0,13 ml/10 g) a été administrée par la veine caudale aux souris des groupes fictif, UUO et ARB, et une solution saline (0,15 ml/10 g) a été administrée par gavage aux souris des groupes fictif, UUO et SK pour réduire biais. Après IRM, du sang a été prélevé sur les souris par ponction cardiaque lors du sacrifice sous anesthésie profonde (induite et maintenue avec 2 % d'isoflurane) le 14e jour, et des tissus rénaux ont été prélevés. Le sérum a été obtenu à partir de sang total par centrifugation à 1000 (× g) (4 degrés) pendant 10 minutes. Les taux sériques d'azote uréique sanguin (BUN), de SCR et de cystatine C (Cys-C) ont été mesurés par la méthode colorimétrique. Une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) et une coloration au rouge Sirius ont été réalisées pour la détection de l'histopathologie et du collagène dans les structures stromales du rein affecté, respectivement. Pour la coloration HE, les tranches ont été trempées dans de l'eau distillée après déparaffinage, trempées dans une solution de coloration à l'hématoxyline (Solarbio Science & Technology, Chine) suivie d'une solution d'alcool d'acide chlorhydrique à 1% pour la séparation des couleurs, lavées à l'eau du robinet, virées au bleu et colorées avec colorant éosine. Les tranches colorées ont été lavées avec de l'eau distillée, déshydratées, clarifiées et scellées avec de la gomme neutre. Pour la coloration au rouge Sirius, les tranches ont été déparaffinées, colorées à l'hématoxyline Harris, lavées, colorées au rouge Sirius (Solarbio Science & Technology, Chine), directement séparées et déshydratées avec de l'éthanol absolu, nettoyées au xylène et scellées. Cinq champs visuels durénalle cortex et la zone des tubules proximaux ont été sélectionnés au hasard pour chaque souris. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour calculer la zone rouge, et la zone rouge moyenne a été calculée pour déterminer la zone colorée en rouge Sirius.

IRM in vivo pour évaluer le degré de fibrose rénaleLes souris ont subi une IRM le 13e jour après l'administration de SK avec un système d'IRM pour petits animaux 7T (système d'IRM Agilent 7T) et une bobine corporelle. L'anesthésie a été induite avec 2 % d'isoflurane et maintenue avec 1,5 % d'isoflurane. Les souris ont été placées en position couchée avec leurs abdomens centrés par rapport au centre de la bobine de radiofréquence et connectées à un capteur de respirateur pour surveiller la respiration. Un système de tête de rat RAPID a été utilisé pour l'excitation par radiofréquence et la détection du signal. Tous les scans ont été réalisés en respiration libre. Les images ont été acquises à l'aide de séquences d'imagerie du tenseur de diffusion (DTI) et les paramètres étaient les suivants : directions=30 (b=1004.7s/mm 2 ) plus null (b=0s/mm 2 ), Δ=4ms et δ=16ms. Les paramètres d'acquisition d'image étaient les suivants : TR/TE=3000ms/50,73 ms, =60 degré, matrice=128×128, FOV=2×2 cm et épaisseur de tranche d'imagerie =1mm. La durée totale de la préparation de diffusion était de 4 ms. Un délai de balayage de 16 ms a été appliqué entre les balayages, et deux balayages b=0s/mm 2 ont été incorporés pour limiter les effets de la relaxation T1. La durée totale du scan était d'environ 1h. En raison de l'hydronéphroserénal manomalies structurelles causées par une obstruction urétérale, seuls le cortex externe et la médulla externe du tissu rénal de rat ont été évalués pour l'analyse par imagerie. Des cartes d'anisotropie fractionnelle (FA) ont été obtenues et calculées à l'aide du logiciel VNMRJ4.0. Pour mesurer avec précision l'intensité du signal IRM et déterminer le degré de fibrose entre différents groupes, cinq plans de balayage ont été sélectionnés pour chaque échantillon de rein, et trois petites régions d'intérêt ont été sélectionnées au hasard pour chaque plan de balayage.

CISTANCHE AMÉLIORE LA FONCTION RÉNALE/RÉNALE

Analyse Western blotLa protéine totale a été extraite des cellules à l'aide de 500μL de tampon de lyse des protéines RIPA (Solarbio, Pékin, Chine). Après centrifugation à 10 000 (× g) pendant 10 minutes, un kit de dosage des protéines Bradford (Applygen, Pékin, Chine) a été utilisé pour la quantification des protéines. Des quantités équivalentes de protéines (40 ug) ont été dénaturées à 100 degrés pendant 10 min dans un tampon de chargement (Applygen, Pékin, Chine), séparées par électrophorèse sur des gels SDS-PAGE à 8 – 10 % en fonction du poids moléculaire relatif, et électrotransférées sur 0. {{ Membranes de difluorure de polyvinylidène 10}}μm (Millipore, Bedford, MA, USA). Ensuite, les membranes ont été bloquées dans un tampon de blocage (Nacalai Tesque, Japon) à 25 ± 5 degrés et incubées avec des anticorps primaires, notamment -actine (Proteintech Group, USA, 1:5000), -SMA (Proteintech Group, USA, 1 : 1000), collagène III (col I) (Abcam, Royaume-Uni, 1:5000), STAT3 (Proteintech Group, États-Unis, 1:2000), p-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling Technology, États-Unis, 1:2000), JAK2 (Cell Signaling Technology, USA, 1:1000), p-JAK2 (Cell Signaling Technology, USA, Tyr1007) (1:1000), et Peroxiredoxin 5 (Prdx5) (Proteintech Group, USA, 1:800), à 4 degrés pendant la nuit. Après avoir été lavées dans du TBST, les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire (Cell Signaling Technology, USA, 1:10000) pendant 1h à température ambiante puis lavées à nouveau avec du TBST. Par la suite, des kits de détection ECL ont été utilisés pour l'exposition. Ensuite, la densité optique des bandes protéiques a été lue et analysée par le logiciel Image Lab™ pour une analyse quantitative. Les valeurs densitométriques ont été normalisées à la densité de la bande -actine.

PCR quantitative en temps réelL'ARN total a été extrait des cellules ourénaltissu à l'aide du kit Monarch® Total RNA Miniprep conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, le système de transcription inverse GoScript a été utilisé pour synthétiser l'ADNc du premier brin conformément au manuel. Une PCR de transcription inverse quantitative en temps réel a été réalisée dans une réaction de 20- μL. Les amorces de ciblage génétique ont été conçues sur la base de séquences d'ARNm publiées par le NCBI et sont répertoriées dans le tableau 1. L'abondance relative d'ARNm a été déterminée sur la base du rapport entre l'expression d'ARNm spécifique et l'expression d'ARNm d'actine dans le même échantillon, et le changement de pli par rapport à celui chez les souris du groupe fictif ou les cellules du groupe 0ng/mL TGF- 1 a été calculée par la méthode 2 -ΔΔCt.

analyses statistiquesToutes les données d'au moins trois expériences indépendantes sont exprimées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du progiciel SPSS 20.0. Des tests de normalité et des tests d'homogénéité pour la variance ont été effectués. Si les données étaient normalement distribuées, le test t de Student a été utilisé pour comparer les différences entre les deux groupes, et l'analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) (test LSD pour les variances paires et test de Dunnett pour les variances inégales) a été utilisée pour comparer les différences entre les groupes. Si les données n'étaient pas distribuées normalement, le test U non paramétrique de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer les différences entre deux groupes, et le test non paramétrique de Kruskal-Wallis a été utilisé pour comparer les différences entre plus de deux groupes. P<0.05, p=""><0.01 or="" p="" <="" 0.001="" indicates="" a="" significant="">

Résultats

Effet de SK sur la viabilité des cellules F NRK-49 après traitement au TGF- 1

Le TGF- est une cytokine fibrogénétique clé impliquée dans la fibrose rénale. Nous avons d'abord utilisé différentes doses de TGF- 1 (0, 10,20, 40 et 80ng/mL) pour stimuler la croissance des cellules F NRK- 49. Le traitement par TGF- 1 pendant 24 h a augmenté la viabilité cellulaire de manière dose-dépendante (Fig. 1a), ce qui est cohérent avec les résultats antérieurs obtenus via le test MTT [17]. Les gradients de concentration de SK (1, 2, 4 et 8 mg/mL) ont réduit de manière significative l'amélioration de la viabilité induite par 10 ng/mL de TGF- 1 (Fig. 1b) et l'effet du traitement pendant 48 h était plus évidente que celle d'un traitement de 24 h. Ce résultat indique que SK peut supprimer la croissance des fibroblastes rénaux induite par le TGF- 1- et l'amélioration de la viabilité in vitro.

SK a inhibé l'expression induite par le TGF- - de -SMA et le dépôt de composants ECM dans les cellules F NRK-49Les myofibroblastes sont des fibroblastes actifs caractérisés par l'expression de -SMA et le dépôt d'ECM. Le TGF- 1 est une cytokine importante impliquée dans la production de MEC par les myofibroblastes et la fibrose [18]. Comme le montrent les figures 2a et b, à la fois -SMA et col. III étaient fortement exprimés dans les cellules F NRK-49 après le traitement au TGF- 1, indiquant que les cellules cultivées étaient converties en myofibroblastes activés lorsqu'elles étaient administrées au TGF- 1. Pour étudier plus avant si SK pouvait supprimer l'activation des fibroblastes interstitiels rénaux, nous avons examiné l'effet de SK sur l'expression de -SMA et de collagène III dans les cellules F NRK-49. L'administration de SK a nettement diminué l'expression de -SMA (de manière dose-dépendante) (Fig. 2 et 3a) et col. III (Fig. 2), suggérant que SK pourrait supprimer directement l'activation induite par le TGF- 1- des cellules F NRK-49. L'effet de 4 ng/mL de SK sur la diminution de l'expression induite par le TGF- 1- de -SMA et le dépôt de composants ECM avait tendance à être supérieur à celui du losartan (1 mg/L).

SK a inhibé l'activation de STAT3, JAK2 induite par le TGF- 1- et l'expression de Prdx5 dans les cellules F NRK-49Pour explorer les mécanismes possibles par lesquels SK inhibe l'activation des fibroblastes, nous avons en outre détecté l'expression des gènes STAT3 et JAK2 et les niveaux de protéines dans les cellules NRK-49F en utilisant respectivement la RT-qPCR et le Western blot. Les cellules F NRK-49 ont exprimé des niveaux plus élevés d'ARNm STAT3 et JAK2 après stimulation par le TGF- 1 qu'avant le traitement. SK a considérablement inhibé l'expression de l'ARNm de STAT3 et JAK2 induite par le TGF - 1- à 24 h (Fig. 3b et c). La phosphorylation de STAT3 à Tyr705 et de JAK2 à Tyr1007 a été augmentée en présence de TGF- 1. SK a également supprimé la phosphorylation de ces deux molécules (Fig. 2). Prdx5, un régulateur de la voie JAK2/STAT3, a été régulé positivement en présence de TGF - 1, et cette régulation positive a également été inversée par le traitement SK (Fig. 2). Presque tous les effets, sauf celui sur la phosphorylation de JAK2 et l'expression de col. III, étaient plus robustes dans le groupe SK à forte dose que dans le groupe SK à faible dose. Par conséquent, il semble clair que SK pourrait inhiber l'activation induite par le TGF- 1-des fibroblastes NRK-49F en régulant l'activation de JAK2/STAT3. À 2 ng/mL ou 4 ng/mL, SK a eu un meilleur effet sur l'amélioration de l'activation de STAT3 et JAK2 induite par le TGF- 1- et de l'expression de Prdx5 que le losartan.

SK a atténué la dysfonction rénale induite par l'UUO et les changements morphologiques rénauxUn modèle murin de fibrose rénale a été établi en induisant UUO. La figure 4 a, b, c montre les indices de dysfonctionnement rénal du groupe fictif, du groupe UUO, du groupe ARA et des groupes SK à dose élevée, modérée et faible après 14 jours de traitement. La dose élevée de SK a considérablement réduit le niveau de Cys-C (P inférieur ou égal à 0.05 ; Fig. 4a) et les niveaux de SCr (P inférieur ou égal à {{12} }.01 ; Fig. 4c), et SK a nettement diminué le niveau de BUN à toutes les doses (P inférieur ou égal à 0,05 ou P inférieur ou égal à 0,01 ; Fig. 4b). Les résultats ci-dessus suggèrent que la SK améliore l'altération de la fonction rénale et la fibrose rénale et que les effets de la SK sont similaires à ceux du losartan. La coloration HE rénale a révélé cette accumulation d'ECM, l'infiltration de cellules inflammatoires, la dilatation et / ou l'atrophie des tubules rénaux, la dégénérescence et la nécrose des cellules épithéliales des tubules rénaux sans modifications évidentes de la structure glomérulaire dans le groupe UUO (Fig. 4d). L'insuffisance de la fonction rénale a été atténuée à des degrés divers dans les différents groupes de traitement par rapport au groupe UUO ; la dose modérée et la dose élevée de SK ont obtenu les meilleurs effets, bien que le degré de fonction rénale dans le groupe d'opération fictive n'ait été atteint dans aucun des groupes de traitement.

SK a diminué la valeur FA liée à la fibrose détectée à l'aide du DTIComme illustré par la figure 5, la valeur FA qui a une relation linéaire avec le degré de fibrose dans le tissu réel a été déterminée par DTI in vivo. Par rapport à celle du groupe fictif, la valeur FA dans le groupe UUO a été significativement augmentée (P<0.01). the="" increase="" in="" in="" the="" fa="" value="" in="" the="" presence="" of="" ureteral="" obstruction="" conditions="" was="" significantly="" reversed="" in="" the="" arb="" and="" high-,="" moderate-,="" and="" low-dose="" sk="" groups="" compared="" to="" the="" uuo="" group="">< 0.01="" or="" p=""><0.001), with="" moderate-dose="" sk="" having="" the="" most="" significant="" effect="" (p=""><>

SK a inhibé l'activation des fibroblastes et le dépôt des composants ECM chez les souris UUODe plus, nous avons évalué l'expression du marqueur d'activation des fibroblastes -SMA, la protéine spécifique des fibroblastes-1 (FSP-1) et les composants classiques de la MEC, la fibronectine (FN), col. III et collagène I (col I) dans les groupes sham, UUO et SK à dose modérée en utilisant la PCR en temps réel. Étant donné que la dose modérée de SK est égale à la dose cliniquement recommandée et que l'amélioration globale dans le groupe à dose modérée était supérieure à celle des groupes à dose élevée et faible, une dose modérée de SK a été utilisée pour évaluer l'expression de l'ARNm. Comme le montrent les figures 7a et b, la SK à dose modérée a significativement atténué les augmentations de -SMA, FSP, FN, col. III et col. Je niveaux. Ces résultats étaient cohérents avec les résultats de la coloration Siriusred, qui ont montré que la zone rouge de fibrose dans le rein affecté dans le groupe ARB et les groupes SK à dose modérée et faible était significativement plus petite que celle du groupe non traité (P<0.05) (fig.="" 6),="" indicating="" that="" sk="" decreased="" the="" number="" of="" col-="" lagen="" bundles="" in="" the="" affected="">

Effet de SK sur les niveaux d'ARNm de STAT3, JAK2 et TGF- et sur l'expression de molécules régulatrices et des protéines suppresseurs de signalisation des cytokines (SOCS) SOCS1 et SOCS3 chez des souris UUOComme le montre la figure 7c, les taux d'ARNm de TGF-, JAK2 et STAT3 étaient significativement élevés dans le groupe UUO par rapport au groupe fictif au 14e jour. Par rapport aux souris fictives, les souris UUO traitées à dose modérée avec SK ont montré une baisse marquée des niveaux d'ARNm de JAK2 et de TGF- le 14ème jour après l'obstruction, mais SK n'a pas diminué de manière significative les niveaux d'ARNm de STAT3 après UUO. Ce résultat suggère que l'effet de SK sur la fibrose rénale et l'activation des fibroblastes chez les souris UUO pourrait se produire par la régulation de l'activation de JAK2 et STAT3 sans modification de l'expression totale de l'ARNm de STAT3. Le niveau de TGF-, la molécule en aval de STAT3, était également diminué par SK dans le cadre de la ligature urétérale. Les protéines SOCS sont considérées comme vitales pour la régulation négative de la signalisation JAK/STAT [19]. En réponse à UUO, les niveaux de SOCS1 et SOCS3 ont augmenté de manière significative et ont diminué de manière significative dans le groupe SK par rapport au groupe modèle (Fig. 7d). Ce résultat suggère que SK pourrait supprimer la voie JAK/STAT pour diminuer l'expression de ses molécules régulatrices négatives en tant que rétroaction.

CISTANCHE AMÉLIORE LA DOULEUR RÉNALE/RÉNALE

Discussion

La fibrose tubulo-interstitielle rénale est la voie commune ultime de l'insuffisance rénale terminale. Les myofibroblastes, qui sont dérivés d'une variété de cellules, y compris les cellules épithéliales, les cellules endothéliales et les péricytes, par transdifférenciation épithéliale-mésenchymateuse (EMT) ou transdifférenciation endothéliale-mésenchymateuse (EndoMT), peuvent aider à réparer les tissus endommagés en produisant ECM et -SMA pour génèrent des tensions contractiles [20]. Parmi ces différents types de cellules, les fibroblastes interstitiels activés sont les principales sources de myofibroblastes, représentant 50 % de ces cellules [21]. En plus de -SMA, les fibroblastes activés expriment également spécifiquement FSP-1. Le TGF- est défini comme un moteur majeur de la fibrose rénale et s'est avéré être activé dans divers modèles de maladies rénales et cellules rénales. Le TGF- activé se lie au récepteur du TGF- et induit des molécules de signalisation en aval, y compris des molécules et des facteurs de transcription liés à l'EMT, à l'EndoMT, à l'activation des fibroblastes, à la production d'ECM et à l'inhibition de la dégradation de l'ECM, via Smad-y compris le TGF- [23], STAT3 est activé par la phosphorylation de Tyr à Tyr705 par l'intermédiaire de Janus kinases. La protéine STAT3 activée pénètre dans le noyau sous la forme d'un dimère et se lie au gène cible. De plus, STAT3 induit la transduction du signal de la voie TGF [24]. En effet, dans le modèle UUO, l'activation de STAT3 à Tyr705 dans les fibroblastes interstitiels rénaux, ainsi que les lésions histopathologiques et l'activation des fibroblastes, est augmentée dès le premier jour, culminant à 7 jours et augmentant jusqu'à 14 jours [25]. STAT3 est probablement impliqué dans de nombreux types de maladies rénales par la régulation de l'expression de gènes cibles, en particulier les facteurs de transcription impliqués dans le développement de l'IRC. Dans la présente étude, le 14e jour après l'obstruction, les niveaux d'ARNm de -SMA, JAK2 et STAT3 ont augmenté de manière significative avec l'augmentation du degré de fibrose rénale.

Selon des recherches antérieures, SK et ses composants se sont avérés réduire les dommages pathologiques, inhiber la prolifération des cellules endothéliales, atténuer la protéinurie et la glomérulosclérose, protéger la fonction rénale résiduelle et ralentir la progression de la maladie, intervenant ainsi dans la progression de la MRC et de la fibrose rénale ; cependant, il n'y a eu aucun rapport sur l'activation des fibroblastes. Selon des études précédentes et nos résultats CCK-8, 10 ng/mL de TGF- 1 ont été utilisés pour activer les fibroblastes ; 1, 2 et 4 mg/mL ont été sélectionnés comme doses faibles, modérées et élevées de SK ; et 48 h a été choisi comme temps d'intervention dans la présente étude. Une régulation à la hausse de -SMA et des changements morphologiques accompagnés d'une prolifération et d'une activation cellulaires, qui se sont manifestées par une augmentation de la viabilité cellulaire et de la production d'ECM, se sont produits dans les cellules NRK-49F après stimulation par le TGF- 1 [26, 27]. Dans cette étude, il a été confirmé que le TGF- 1 régulait l'expression génique de -SMA et ECM en activant la voie JAK2/STAT3 en amont. Nos données ont montré que SK inhibait directement l'activation des cellules F NRK-49induites par le TGF- 1-et la production d'ECM in vitro. De plus, nous avons démontré que SK pouvait atténuer la fibrose rénale chez les souris UUO in vivo, réduisant l'accumulation d'ECM interstitielle le 14e jour après l'obstruction. Ces résultats indiquent que SK pourrait atténuer nettement la fibrose rénale en inhibant l'activation des fibroblastes interstitiels et en réduisant l'expression de -SMA. Le mécanisme potentiel de l'effet antifibrotique de SK est l'inhibition de l'activation des fibroblastes par la régulation de la voie de signalisation JAK2/STAT3 à la fois in vitro et in vivo. La SK à dose modérée a également inversé de manière significative la régulation à la hausse du TGF- 1 induite par l'UUO, ce qui suggère que l'effet de la SK est lié au TGF-. Parce que TGF- et STAT3 interagissent l'un avec l'autre, SK peut inhiber STAT3 en ciblant TGF- , réguler négativement TGF- en ciblant STAT3, ou inhiber les deux. Notre précédente étude de pharmacologie systémique avait prédit STAT3 comme l'une des molécules cibles possibles de SK [28], et cette découverte a été vérifiée dans la présente étude. Nous utilisons le losartan, un ARA

peut atténuer significativement la fibrose rénale et l'apoptose des cellules tubulaires rénales en inhibant la phosphorylation de la protéine de signalisation STAT3 dans un modèle rat d'UUO [29], en tant que médicament témoin positif. Les résultats précédents sont cohérents avec nos données. Les peroxirédoxines sont une famille de peroxydases mercaptan-dépendantes qui peuvent réduire le stress oxydatif en catalysant la réduction du peroxyde d'hydrogène. Le niveau de Prdx5 dans le rein du rat a diminué le premier jour après UUO. Il a été observé que l'expression de Prdx5 augmente progressivement jusqu'à 5 jours après le traitement au TGF-. Il a été démontré que la surexpression de Prdx5 inhibe la phosphorylation induite par le TGF- - de STAT3 et diminue l'expression -SMA et FN induite par le TGF dans les cellules F NRK-49, indiquant que Prdx5 régule négativement le TGF- - induit l'activation de STAT3 et la fibrose dans les cellules F NRK-49 [12]. Le principal mécanisme de régulation sous-jacent à la signalisation STAT3 endogène implique la famille de protéines SOCS. Une fois STAT3 activé par les cytokines, le dimère STAT3 est transporté vers les gènes cibles en aval de l'induction nucléaire, y compris le SOCS [30]. Plus précisément, la région inhibitrice de la kinase de SOCS1 peut se lier directement peut atténuer de manière significative la fibrose rénale et l'apoptose des cellules tubulaires rénales en inhibant la phosphorylation de la protéine de signalisation STAT3 dans un modèle de rat d'UUO [29], en tant que médicament témoin positif. Les résultats précédents sont cohérents avec nos données. Les peroxirédoxines sont une famille de peroxydases mercaptan-dépendantes qui peuvent réduire le stress oxydatif en catalysant la réduction du peroxyde d'hydrogène. Le niveau de Prdx5 dans le rein du rat a diminué le premier jour après UUO. Il a été observé que l'expression de Prdx5 augmente progressivement jusqu'à 5 jours après le traitement au TGF-. Il a été démontré que la surexpression de Prdx5 inhibe la phosphorylation induite par le TGF- - de STAT3 et diminue l'expression induite par le TGF- --SMA et FN dans les cellules F NRK-49, indiquant que Prdx5 régule négativement le TGF{{ 38}}induit l'activation de STAT3 et la fibrose dans les cellules F NRK-49[12]. Le principal mécanisme de régulation sous-jacent à la signalisation STAT3 endogène implique la famille de protéines SOCS. Une fois STAT3 activé par les cytokines, le dimère STAT3 est transporté vers les gènes cibles en aval de l'induction nucléaire, y compris le SOCS [30]. Plus précisément, la région inhibitrice de kinase de SOCS1 peut se lier directement

à JAK2 et inhibent la phosphorylation de STAT3 [31]. L'activation de JAK/STAT induite par UUO provoque une élévation de l'expression de SOCS [32]. Après stimulation avec 10 ng/mL de TGF- 1 pendant 48 h, l'expression de la protéine Prdx5 dans les cellules F NRK-49 a augmenté de manière significative, ce qui est cohérent avec les résultats précédents. SK (4 mg/ml) a significativement réduit les niveaux de protéine Prdx5 après 48 h d'intervention. Le 14ème jour après UUO, les niveaux d'ARNm de SOCS1 et SOCS3 dans le rein affecté étaient significativement régulés à la hausse dans le groupe UUO par rapport au groupe témoin, indiquant que l'activation de la signalisation STAT3 après UUO induisait l'expression de SOCS1 et SOCS3 à réguler négativement le signal STAT3 suractivé. Après 14 jours d'intervention SK, les niveaux d'ARNm SOCS1 et SOCS3 ont diminué de manière significative. Ces résultats ont montré qu'au lieu d'élever directement les régulateurs négatifs pour inhiber la signalisation JAK2/STAT3, SK inhibait JAK2/STAT3, entraînant une régulation négative des régulateurs négatifs Prdx5, SOCS1 et SOCS3. Ainsi, JAK2/STAT3 pourrait être une cible thérapeutique directe de SK pour la fibrose rénale.

L'IRM est une méthode très sûre pour évaluer les changements structurels et physiologiques du rein sans l'utilisation d'un agent de contraste intraveineux [33, 34]. L'imagerie pondérée en diffusion (DWI) est une méthode d'IRM bien connue qui est utilisée pour imager le mouvement moléculaire ou la diffusion reflétant les changements dans la microstructure des tissus biologiques [35]. DTI est une nouvelle technologie d'imagerie développée sur la base de l'imagerie pondérée en diffusion (DWI) qui peut décrire non seulement la vitesse des molécules d'eau mais également la direction de leur mouvement, à savoir l'anisotropie. Comparé au DWI, le DTI est plus sensible et précis pour refléter le changement de dispersion de l'eau. DTI peut également fournir des informations supplémentaires sur la direction et la quantité de diffusion mesurée sur la base de FA. Huper et al. [36] ont montré que chez les rats DN, l'AF était liée à la glomérulosclérose, à la fibrose interstitielle et aux lésions tubulaires rénales. Yan et al. [37] ont trouvé que l'AF pourrait être un biomarqueur de la DN précoce. Kaimori et al. [38] ont observé une relation linéaire entre la valeur de FA et le degré de fibrose tissulaire réelle dans un modèle de rat UUO. Dans cette étude, nous avons optimisé les paramètres pour réduire le temps de balayage, le temps d'anesthésie et la consommation de ressources expérimentales. Les résultats du DTI étaient cohérents avec la coloration au rouge Sirius en termes de degré de fibrose rénale causée par l'UUO et de la capacité de SK à atténuer la fibrose rénale. Dans une certaine mesure, ces découvertes ont révélé que la SK a un effet réel sur la fibrose rénale in vivo. Dans cette étude, nous avons démontré le mécanisme par lequel SK régule la fibrose interstitielle rénale à la fois in vivo et in vitro. Dans les études futures, l'utilisation d'inhibiteurs ou d'ARNsi pour inhiber JAK2/STAT3 est nécessaire pour vérifier davantage ce mécanisme.

conclusion

En conclusion, nos données suggèrent que SK peut inhiber efficacement l'activation des fibroblastes rénaux et la fibrose rénale chez les souris UUO en régulant la voie de signalisation JAK2/STAT3. Nos résultats fournissent une bonne compréhension du mécanisme de SK dans le traitement des maladies rénales. Cependant, les mécanismes moléculaires détaillés du traitement SK dans la fibrose rénale nécessitent une exploration plus approfondie.