Abstrait

Objectif : Étudier les effets d'une formule contenant du Cistanche (remplaçant les herbes originales nourrissant le sang et tonifiant les reins) sur l'expression du facteur de croissance transformant - 2 (TGF - 2), le remodelage scléral et le transport de l'eau chez les rats atteints de myopie par privation de forme (FDM) en régulant la voie cavéoline-1 (CAV1)/aquaporine 1 (AQP1).

Méthodes : Quarante rats SD mâles de qualité SPF ont été sélectionnés, parmi lesquels 30 ont été utilisés pour établir le modèle FDM. Après une modélisation réussie, les rats ont été divisés en groupe FDM, groupe pirenzépine (PIR) et groupe formule Cistanche, avec 10 rats dans chaque groupe. Les 10 rats non modélisés restants constituaient le groupe normal. Le groupe normal et le groupe FDM n'ont reçu aucune intervention. Le groupe PIR a été traité avec des gouttes oculaires PIR deux fois par jour (matin et soir), tandis que le groupe avec formule Cistanche a reçu une administration intragastrique de la formule contenant du Cistanche. L'erreur de réfraction et la longueur axiale des rats ont été détectées à l'aide d'un rétinoscope et d'un instrument de diagnostic. La coloration HE a été utilisée pour observer les changements morphologiques du tissu scléral. La coloration immunohistochimique a été utilisée pour détecter l'expression du TGF- 2 dans le tissu scléral. Le Western blot a été utilisé pour déterminer les niveaux d’expression relatifs des protéines AQP1 et CAV1 dans le tissu scléral. La RT-PCR a été réalisée pour mesurer les niveaux d'expression relatifs de l'ARNm du transporteur de glutamate-aspartate (GLAST) et du transporteur de glutamate 1 (GLT-1) dans le tissu scléral. Résultats : Par rapport au groupe normal, l'erreur de réfraction, le niveau d'expression du TGF- 2 et les niveaux d'expression relatifs des protéines AQP1 et CAV1 dans le groupe FDM, le groupe de formule Cistanche et le groupe PIR ont été significativement diminués, tandis que la longueur axiale et les niveaux d'expression relatifs de l'ARNm GLAST et de l'ARNm GLT-1 ont été significativement augmentés (tous P < 0,05). Par rapport au groupe FDM, l'erreur de réfraction, le niveau d'expression du TGF - 2 et les niveaux d'expression relatifs des protéines AQP1 et CAV1 dans le groupe de formule Cistanche et le groupe PIR ont été significativement augmentés, tandis que la longueur axiale et les niveaux d'expression relatifs de l'ARNm GLAST et de l'ARNm GLT-1 ont été significativement diminués (tous P <0,05). Par rapport au groupe de formule Cistanche, l'erreur de réfraction, le niveau d'expression du TGF - 2 et les niveaux d'expression relatifs des protéines AQP1 et CAV1 dans le groupe PIR ont été significativement diminués, tandis que la longueur axiale et les niveaux d'expression relatifs de l'ARNm GLAST et de l'ARNm GLT-1 ont été significativement augmentés (tous P <0,05). Les résultats de la coloration HE ont montré qu’il n’y avait aucun changement anormal dans la structure de chaque couche rétinienne dans le groupe normal ; la rétine du groupe FDM était amincie et de graves modifications vacuolaires sont apparues dans la couche de cellules ganglionnaires ; l'épaisseur rétinienne du groupe de formule Cistanche et du groupe PIR a été augmentée, la disposition cellulaire était fondamentalement régulière, le nombre de cellules ganglionnaires a été augmenté et les cellules de chaque couche étaient densément disposées, avec les performances les plus significatives dans le groupe de formule Cistanche. Conclusion : La formule contenant du Cistanche a un certain effet positif sur le traitement du FDM, et son mécanisme peut être lié à la régulation de l'expression de CAV1, AQP1 et TGF- 2, ainsi qu'à l'équilibrage et à l'amélioration des fonctions de remodelage scléral et de transport de l'eau.

 

 

SUPPLÉMENT D'HERBES CISTANCHE POUR AMÉLIORER LA FONCTION RÉNALE

 

 

Mots-clés

Myopie par privation de forme ; Formule contenant de la cistanche ; Facteur de croissance transformateur- 2 ; Aquaporine 1; Cavéoline-1; Remodelage scléral ; Transport par eau

 

Ces dernières années, avec l'évolution des modes de vie des gens et le développement continu des appareils électroniques, l'incidence de la myopie a augmenté. En tant que maladie courante, elle est devenue un problème de santé mondial. La myopie par privation de forme (FDM) est un type particulier de myopie, généralement causée par la privation ou la réduction de la stimulation visuelle des yeux. Le FDM interfère non seulement avec le processus de remodelage scléral, mais entraîne également des modifications anormales de la forme du globe oculaire et des troubles de la fonction de transport de l'eau, ce qui peut aggraver davantage les lésions et la déformation du tissu scléral. L'aquaporine 1 (AQP1) est une protéine largement existante dont la fonction principale est de favoriser le transport rapide des molécules d'eau à travers les membranes cellulaires. Dans l'œil, la distribution et la fonction de l'AQP1 sont liées à l'équilibre dynamique du liquide intraoculaire. La cavéoline-1 (CAV1) est une protéine impliquée dans la formation des microstructures membranaires cellulaires et la transduction du signal. Dans l’œil, CAV1 est principalement présent dans les cellules épithéliales pigmentaires de la rétine et les cellules photoréceptrices et est lié à la transmission des signaux visuels et à la stabilité de l’environnement intraoculaire. Le facteur de croissance transformant- 2 (TGF- 2) est une cytokine pléiotrope ayant de multiples effets biologiques tels que la promotion de la prolifération, de la différenciation et de la migration cellulaires. Dans l'environnement intraoculaire, le TGF- 2 joue un rôle important dans le développement et le maintien de la cornée et de la sclère. À l’heure actuelle, le traitement principal du FDM est la pharmacothérapie.

En médecine traditionnelle chinoise (MTC), on pense que la formation de la myopie est liée à des facteurs tels qu'un manque de qi et de sang et une carence en essence rénale. Le rein est considéré comme la « fondation congénitale » et est étroitement lié à la fonction des yeux. La MTC soutient que « le rein gouverne l'essence et l'essence nourrit les yeux ; le foie s'ouvre sur les yeux et une quantité suffisante de sang hépatique assure une vision claire ». Par conséquent, tonifier les reins et nourrir le sang a toujours été un principe thérapeutique important pour les maladies oculaires causées par des syndromes de carence en MTC.

Le cistanche, connu sous le nom de « ginseng du désert » et l'un des « neuf médicaments immortels » de la MTC, a une histoire de plus de 2 000 ans en tant qu'ingrédient médicinal. Considéré comme une matière médicinale nourrissante de première qualité dans les anciens classiques de la MTC, le Cistanche est très apprécié pour ses effets de tonification des reins, de reconstitution de l'essence, de nutrition du sang et d'hydratation de la sécheresse. Contrairement à de nombreuses autres herbes de MTC, le Cistanche pousse exclusivement dans les déserts, principalement en parasite les racines de Tamarix ramosissima dans des régions telles que le Xinjiang, la Mongolie intérieure et le Gansu en Chine. L'environnement désertique unique lui confère de riches ingrédients actifs, notamment l'échinacoside, le verbascoside et les flavonoïdes, dont il a été scientifiquement prouvé qu'ils possèdent de fortes propriétés antioxydantes, réduisent l'apoptose cellulaire et favorisent la prolifération cellulaire.

La recherche moderne a montré que le Cistanche a des effets nourrissants importants sur les reins. Il peut réduire l'apoptose des cellules rénales, favoriser la prolifération des cellules rénales, réparer les cellules rénales endommagées et dilater les vaisseaux sanguins rénaux, améliorant ainsi la fonction rénale. De plus, Cistanche peut renforcer l'immunité en favorisant la prolifération des lymphocytes, résister à la fatigue en augmentant la production de glycogène hépatique et exercer des effets anti-âge en éliminant les radicaux libres. Ces activités biologiques sont tout à fait cohérentes avec la théorie de la MTC « tonifier les reins et nourrir l'essence », et fournissent également une base scientifique pour son application dans le traitement des maladies oculaires. Basée sur le principe thérapeutique de la MTC consistant à tonifier les reins et à nourrir le sang, et combinant les caractéristiques pharmacologiques modernes du Cistanche, cette étude a remplacé les herbes originales nourrissant le sang et tonifiant les reins par du Cistanche pour former une nouvelle formule contenant du Cistanche, et a exploré son efficacité et son mécanisme dans le traitement de la FDM, dans le but de fournir une nouvelle idée pour le développement de thérapies naturelles à base de plantes pour la myopie.

1 Matériels et méthodes

1.1 Animaux expérimentaux

Quarante rats SD mâles de qualité SPF, pesant 180 à 200 g et âgés de 6 à 8 semaines, ont été achetés au centre d'élevage d'animaux de Beijing Keyu [numéro de licence : SCXK (Jing) 2022-0004] et élevés régulièrement dans le laboratoire animalier de l'hôpital ophtalmologique de l'Académie chinoise des sciences médicales chinoises. Cette expérience était conforme aux dispositions pertinentes du « Règlement sur l'administration des animaux d'expérimentation » et a été approuvée par le comité d'éthique médicale de l'hôpital ophtalmologique de l'Académie chinoise des sciences médicales chinoises (numéro de lot : YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Principaux réactifs et instruments

Cistanche tubulosa (acheté auprès de Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd., avec des ingrédients actifs comprenant de l'échinacoside supérieur ou égal à 30,0 %, du verbascoside supérieur ou égal à 12,0 % et des glycosides d'alcool phénéthylique totaux supérieurs ou égaux à 75,0 %) a été utilisé comme matière médicinale de base. Pirenzépine (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Gouttes oculaires composées de tropicamide (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., spécification 5 ml) ; 4 g·L⁻¹ gouttes oculaires de chlorhydrate d'oxybuprocaïne (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.) ; Anticorps AQP1 (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); Anticorps CAV1 (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -anticorps d'actine (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); IgG anti-lapin de chèvre (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.) ; Kit de coloration HE (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Méthode de modélisation et regroupement

Trente rats ont été utilisés pour établir le modèle FDM. Les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (30 mg·kg⁻¹). Après avoir nettoyé et désinfecté l’œil droit avec de la povidone iodée, un masque oculaire opaque a été collé sur l’œil droit. Le masque pour les yeux a été vérifié quotidiennement pour déceler tout détachement ou toute fuite de lumière, et recollé s'il était lâche. L’œil gauche n’a pas été traité. Après 4 semaines de privation de forme monoculaire, une rétinoscopie binoculaire et une mesure de la longueur axiale ont été réalisées sur les rats. Les critères de réussite de la modélisation : après une cycloplégie, l'erreur de réfraction a été mesurée avec un rétinoscope ou un réfractomètre automatique, et l'œil privé a montré un changement myope significatif de l'état de réfraction [c'est-à-dire que la différence d'erreur de réfraction binoculaire supérieure ou égale à 2 D a été considérée comme une modélisation réussie, et le décalage myope moyen de l'œil privé par rapport à l'œil témoin était d'environ (-4,5 ± 1,2) D]. Les 30 rats ont été modélisés avec succès et divisés en groupes FDM, PIR et Cistanche, avec 10 rats dans chaque groupe. Les 10 rats non modélisés restants constituaient le groupe normal.

1.4 Méthodes d'intervention

Le groupe normal et le groupe FDM n'ont reçu aucune intervention. Le groupe PIR a reçu 5 gouttes de collyre PIR dans l'œil droit deux fois par jour (matin et soir) à 2 minutes d'intervalle pendant 15 jours. Le groupe de formules Cistanche est intervenu avec la formule contenant des Cistanche. La cistanche tubulosa (50 g, l'ingrédient principal) a été décoquée avec de l'eau et concentrée en une solution médicinale d'une concentration de 1 000 g·L⁻¹. Les rats ont reçu une administration intragastrique à une dose de 12,70 g·kg⁻¹ une fois par jour pendant 15 jours. Le dosage de Cistanche a été déterminé sur la base de son expérience d'application clinique et de la recherche pharmacologique moderne, garantissant des concentrations efficaces d'ingrédients actifs tels que l'échinacoside et le verbascoside.

1.5 Méthodes de détection

1.5.1 Évaluation de l'erreur de réfraction et des changements de longueur axiale

Détection des erreurs morphologiques et de réfraction : Vingt-quatre heures après la fin de la privation de forme, 3 rats ont été sélectionnés au hasard dans chaque groupe pour la détection. Avant l’expérience, les rats ont été placés dans un environnement adapté à l’obscurité pendant 30 minutes, puis anesthésiés par inhalation d’isoflurane et fixés sur un support spécial pour animaux. Un système d’imagerie OCT haute résolution a été utilisé pour un balayage panoramique du globe oculaire. Pendant le balayage, la sonde a été ajustée pour être perpendiculaire à la cornée afin d'obtenir des images claires en coupe transversale de la rétine et du cristallin. Chaque œil a été scanné 3 fois de suite et la distance axiale entre la surface cornéenne antérieure et la couche d'épithélium pigmentaire rétinien (c'est-à-dire la longueur axiale) a été automatiquement mesurée par le logiciel intégré du système pour calculer l'erreur de réfraction équivalente sphérique. Pour garantir l’exactitude des données, deux chercheurs professionnellement formés ont analysé les images de manière indépendante et en aveugle. Si la différence entre les deux résultats de mesure était supérieure à 0,50 D, les données étaient rejetées et remesurées. Détection de confirmation de la longueur axiale : Pour vérifier les résultats de la mesure OCT, un instrument de diagnostic par ultrasons A-scan a également été utilisé. Tout d’abord, des gouttes oculaires de chlorhydrate d’oxybuprocaïne ont été instillées dans les deux yeux des rats pour une anesthésie topique, puis la sonde A-scan a été doucement placée en contact avec la cornée. L'instrument a été réglé en mode manuel et la vitesse précise de propagation des ultrasons a été réglée en fonction du milieu intraoculaire : 1540 m·s⁻¹ pour la chambre antérieure et le corps vitré. Pendant le fonctionnement, chaque interface a été localisée par marquage manuel et chaque œil a été mesuré 3 fois à plusieurs reprises pour prendre la valeur moyenne. Cette expérience a été réalisée en aveugle et tous les opérateurs ont reçu une formation unifiée pour garantir des techniques de mesure cohérentes. L'instrument a été calibré avant la mesure et certains échantillons ont été sélectionnés au hasard pour des tests de répétabilité afin d'évaluer les coefficients de corrélation intraclasse et interclasse (ICC). Des procédures opérationnelles standardisées strictes ont été suivies pendant l’expérience pour garantir la scientificité et la fiabilité des données.

1.5.2 Coloration HE

Après avoir détecté l’erreur de réfraction et la longueur axiale, les rats ont été sacrifiés sous anesthésie excessive. Les paupières et les tissus environnants des deux yeux ont été désinfectés et les limbes nasal et temporal perpendiculaires au milieu de la cornée ont été marqués. La conjonctive a été incisée selon les marques et le globe oculaire a été énucléé. Le limbe a été incisé pour retirer le tissu du segment antérieur et du corps vitré, et le tissu scléral a été conservé. Le tissu scléral a été fixé avec 40 g·L⁻¹ de paraformaldéhyde pendant 24 heures, déshydraté avec un gradient d'éthanol, régulièrement inclus dans de la paraffine, nettoyé au xylène, monté avec du baume neutre, sectionné à 5 μm, coloré à l'HE et observé pour les changements morphologiques du tissu scléral au microscope optique.

1.5.3 Coloration immunohistochimique pour l'expression du TGF- 2 dans le tissu scléral

Deux rats ont été sélectionnés dans chaque groupe. Des coupes de tissus scléraux ont été soumises à la récupération et au blocage de l'antigène, incubées avec de l'anti-TGF - 2 de souris (1 : 3 000) pendant 24 heures, lavées, incubées avec un anticorps secondaire (1 : 2 000) pendant 1 heure, développées et contre-colorées en routine, montées avec du baume neutre, et 2 à 3 images ont été prises au microscope optique pour observer les changements tissulaires. La valeur de gris de la partie positive a été détectée par un système d'analyse d'image.

1.5.4 Détection par Western Blot des niveaux d’expression des protéines AQP1 et CAV1 dans le tissu scléral

Deux rats ont été sélectionnés dans chaque groupe. Le tissu scléral a été excisé, homogénéisé et la protéine totale a été extraite en ajoutant du tampon de lyse RIPA. La dénaturation, la quantification, l'électrophorèse, le transfert membranaire et le blocage des protéines ont été réalisés. Les anticorps primaires AQP1 (1: 1 000), CAV-1 (1: 3 000) et l'anticorps -actine (1: 2 000) ont été ajoutés et incubés pendant la nuit à 4 degrés. Un anticorps secondaire (1: 2000) a été ajouté et incubé à température ambiante pendant 1 heure. Le réactif ECL a été ajouté et la valeur de gris protéique a été analysée avec le logiciel Image Lab. Le rapport entre la valeur de gris de la bande cible et celle de la -actine était son niveau d'expression relatif.

1.5.5 Détection RT-PCR de GLAST et de l'expression de l'ARNm GLT-1 dans le tissu scléral

Le tissu scléral restant de rats a été prélevé et l'ARN total a été extrait selon la méthode Trizol. L'ARN total a été mesuré avec un spectrophotomètre et l'ADNc a été soumis à une transcription inverse conformément aux instructions du kit. Le système réactionnel RT-PCR a été préparé dans les conditions de réaction suivantes : 75 degrés pendant 30 s, 85 degrés pendant 60 s, 80 degrés pour un recuit pendant 30 s, 65 degrés pour une extension pendant 30 s, un total de 40 cycles. Avec la -actine comme référence interne, les niveaux d'expression relatifs du transporteur de glutamate-aspartate (GLAST) et du transporteur de glutamate 1 (GLT-1) ont été calculés par la méthode 2⁻ΔΔCt. Les séquences d'amorces sont présentées dans le tableau 1. Une analyse de variance unidirectionnelle a été utilisée pour la comparaison entre les groupes, et le test LSD-t a été utilisé pour une comparaison par paires entre les groupes. Le niveau de test :=0.05.