Effets de quatre extraits de plantes chinoises sur les cellules de carcinome pulmonaire à petites cellules sensibles aux médicaments et multirésistantes
Feb 19, 2022
David SadavaJulie Ahn Mei Zhan Mei Lin PangJane DingSusan E. Kane
Objectif abstrait :Nous avons examiné la pharmacologie, la biologie cellulaire et la biologie moléculaire de cellules de carcinome pulmonaire à petites cellules traitées avec quatre extraits deMédicaments chinois à base de plantes. De nombreux patients atteints de cancer prennent ces médicaments, mais leurs effets au niveau cellulaire sont largement inconnus. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux effets sur les cellules résistantes aux médicaments, car la résistance est un problème clinique important danscancer du poumonr. Méthodes : Des cellules épithéliales pulmonaires sensibles aux médicaments (H69), multirésistantes aux médicaments (H69VP) et normales (BEAS-2) ont été exposées à des extraits de deux plantes utilisées en phytothérapie chinoise pourcancer du poumon: Glycyrrhiza glabra (GLYC) et Olenandria diffusa (OLEN), et aux extraits de deux combinaisons disponibles dans le commerce deMédicaments chinois à base de plantes, SPES (15 herbes) et PC-SPES (8 herbes). La cytotoxicité a été mesurée en termes d'inhibition de la croissance cellulaire (IC50). La cinétique de fragmentation de l'ADN après exposition aux extraits de plantes a été mesurée par marquage BudR suivi d'ELISA. L'apoptose a été mesurée par le test TUNEL suivi d'une cytométrie en flux. L'expression des gènes liés à l'apoptose et au cycle cellulaire a été mesurée par transcription inverse de l'ARNm suivie d'une hybridation sur filtre à des réseaux de sondes et d'une détection par chimiluminescence. Résultats : Dans chaque cas, les quatre extraits de plantes étaient également cytotoxiques pour H69 et H69VP et moins cytotoxiques pour BEAS-2. Les quatre extraits ont induit une fragmentation de l'ADN dans les cellules du carcinome pulmonaire. La cinétique a montré des fragments d'ADN libérés dans le milieu (indication de nécrose) dans les cultures exposées au GLYC, mais à l'intérieur des cellules (indication d'apoptose) dans les cultures exposées à OLEN, SPES et PC-SPES. L'analyse TUNEL a confirmé que l'exposition aux trois derniers extraits, mais pas au GLYC, a conduit à l'apoptose. Par rapport aux cellules non traitées et traitées au GLYC, les cellules H69 et H69VP traitées avec OLEN, SPES et PC-SPES ont montré une expression élevée d'un certain nombre de gènes impliqués dans la cascade apoptotique, similaires aux cellules traitées avec l'étoposide et la vincristine.
Conclusion:LaPhytothérapie chinoiseles extraits OLEN, SPES et PC-SPES sont cytotoxiques à la fois pour les résistants et les sensibles aux médicamentscancer du poumonles cellules, montrant une certaine spécificité des cellules tumorales par rapport à leur effet sur les cellules normales, et sont pro-apoptotiques tel que mesuré par les cassures de l'ADN et l'expression génique. La réaction des cellules tumorales à ces extraits était similaire à leur réaction aux médicaments chimiothérapeutiques conventionnels.
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Mots clés:Cancer du poumon, Résistance aux médicaments,Médicaments chinois à base de plantes,cistanche
Contact:joanna.jia@wecistanche.com
Introduction
Petite cellulecancer du poumon(SCLC) représente environ 20 pour cent de touscancers du poumonet est agressif, avec un taux de survie de 5- ans au moment du diagnostic inférieur à 10 % [19]. Les patients présentent généralement une maladie disséminée, et le traitement repose donc sur la chimiothérapie, avec des combinaisons impliquant généralement le cisplatine, l'étoposide, la doxorubicine, le 5-fluorouracil et le taxol [12]. Malheureusement, ce traitement finit par devenir inefficace car la plupart des tumeurs SCLC développent une multirésistance [18]. Comme il existe de nombreux mécanismes de résistance [15], surmonter la résistance est un défi clinique majeur.
Face aux soins palliatifs, de nombreux patients atteints de cancer ont recours aux médecines alternatives, notamment les phytothérapies [6, 23]. Parmi ces thérapies, la médecine traditionnelle chinoise est probablement la mieux établie et codifiée, datant de plusieurs milliers d'années. La base théorique de ce système médical concerne les forces opposées du yin et du yang, des cycles génératifs et destructeurs, et une force vitale, ou qi [2]. Des extraits de plantes spécifiques et des combinaisons ont été conçus pour traiter des maladies spécifiques, y compris les cancers [11, 27]. Bien qu'il existe des preuves empiriques que les herbes sont efficaces dans le traitement du cancer, leurs mécanismes d'action au niveau cellulaire sont largement inconnus. Cela prend une importance accrue si les patients combinent leur utilisation avec une chimiothérapie conventionnelle. En outre, les effets des extraits de plantes sur la résistance aux médicaments n'ont pas été signalés.
Nous avons étudié les effets de quatreMédicaments chinois à base de plantessur trois lignées cellulaires : SCLC, SCLC multirésistant et épithélium pulmonaire normal. Deux des quatre extraits provenaient de plantes uniques souvent prescrites pour le cancer du poumon, Glycyrrhiza glabra (GLYC) et Olenandria diffusa (OLEN). Les deux autres provenaient de combinaisons d'herbes disponibles dans le commerce appelées SPES et PC-SPES. OLEN (nom chinois Bai Hua she cao) a des activités antitumorales, antimutagènes et immunostimulantes [1, 25, 29]. Le GLYC (nom chinois gan car) est anti-inflammatoire, antitumorigène et antimutagène [7, 11]. Le SPES, développé par BotanicLabs (Brea, Californie), se présente sous forme de gélules contenant des extraits lyophilisés de 15 herbes chinoises et il a été démontré qu'il diminue la douleur chez les patients atteints de cancers avancés [14]. Parmi les herbes de SPES figurent les stimulants immunitairesCistanchedeserticola, l'agent antitumoral Rabdosia rubescens et l'agent anti-inflammatoire Zanthoxylum iridium [1, 11]. PC-SPES, également préparé par BotanicLabs, contient huit herbes, dont l'antiandrogène Serenoa repens qui inhibe l'hyperplasie prostatique [21], l'inhibiteur de la protéine kinase C Scutellaria baicalensis [13], l'agent antitumoral Panax ginseng [30] et Glycyrrhiza glabra ( voir au dessus). Bien que des preuves rigoureuses de l'efficacité antitumorale clinique du GLYC, de l'OLEN et du SPES fassent défaut, il existe certaines preuves de l'efficacité du PC-SPES. Dans les cellules cancéreuses de la prostate et les modèles animaux, PC-SPES est pro-apoptotique et cytotoxique [8, 9, 10, 28]. Des essais cliniques ont indiqué qu'il est efficace pour abaisser les niveaux d'antigène spécifique de la prostate et pour arrêter la croissance tumorale dans les cancers de la prostate androgéno-dépendants et androgéno-indépendants [4, 5, 17, 20, 26].
Bien que les patients cancéreux utilisent sans aucun doute des extraits de plantes, il existe peu de données précliniques ou cliniques sur les effets de ces extraits sur le CPPC. Notre objectif était de commencer cette analyse par un examen de la pharmacologie (cytotoxicité), de la biologie cellulaire (méthode de mort cellulaire) et de la biologie moléculaire (expression génique) dans les cellules SCLC sensibles aux médicaments et résistantes aux médicaments.
matériaux et méthodes
Extraits et produits chimiques
GLYC et OLEN ont été obtenus sous forme de plantes séchées auprès de Jen-On Medical Group (Monterey Park, Californie). Pour la préparation d'un extrait, 0.5 g a été broyé en une fine poudre avec un mortier et un pilon et mis en suspension dans 30 ml d'eau distillée. En médecine chinoise, les extraits de plantes sont consommés sous forme de tisanes après chauffage. Par conséquent, la suspension a été incubée sous agitation à 70 degrés pendant 18 h. Après centrifugation à 1500 g pendant 10 min, le surnageant a été stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,45-lm à l'aide d'une seringue. L'extrait résultant a été ajusté avec de l'eau distillée à 17 mg/ml sur la base du matériel végétal d'origine. Les extraits ont été stockés à 4 degrés jusqu'à 1 semaine jusqu'à leur utilisation.
SPES et PC-SPES ont été obtenus auprès de BotanicLabs (Brea, Californie) sous forme de capsules. La méthode d'extraction utilisée a été employée dans des études antérieures de ces préparations [8, 9, 10]. Le contenu d'une capsule (320 mg) a été dissous dans 1 ml d'éthanol à 95 % et la suspension a été incubée sous agitation à 37 degrés pendant 1 h. Après centrifugation à 3000 g pendant 10 min, le surnageant a été filtré-stérilisé comme ci-dessus. La concentration finale était de 300 mg/ml sur la base du matériel végétal d'origine. Les extraits ont été stockés à -20 degrés jusqu'à 1 semaine jusqu'à leur utilisation.
Cultures cellulaires et mesure de la cytotoxicité
Les cellules SCLC NCI-H69 ont été cultivées à 37 degrés dans une atmosphère contenant 5% de CO2 sous forme de suspension dans un milieu sans sérum AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY). Une lignée cellulaire multirésistante (H69VP) sélectionnée dans l'étoposide [16] a également été cultivée dans l'AIM-V et a montré une résistance croisée à l'étoposide (9- fois), à la doxorubicine (20- fois) et à la vincristine (10- fois) (données non affichées). Ces cellules ont de multiples mécanismes de résistance aux médicaments, y compris des altérations de la topoisomérase II et l'expression des pompes membranaires, MDR1 et MRP. Des cellules épithéliales pulmonaires normales BEAS-2 [22] ont été cultivées dans du DMEM-F12 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal.
Pour les tests de cytotoxicité, des extraits ont été ajoutés comme indiqué aux cellules en croissance logarithmique dans des cultures de 1- ml contenant 6 000 cellules/ml. Après 4 jours d'exposition continue, les cellules ont été comptées dans un compteur Coulter Z-1. Les comptages ont été validés au microscope par hémocytomètre après coloration au bleu trypan. Toutes les expériences ont été faites en triple et répétées au moins trois fois. Les valeurs IC50, définies comme la concentration d'extrait qui avait réduit le nombre de cellules au jour 4 de 50 %, ont été calculées par rapport aux témoins de solvant. Les valeurs moyennes ont été calculées et comparées par ANOVA pour les trois lignées cellulaires pour cet extrait.
Essais de mort cellulaire
Le mécanisme de la cytotoxicité a été étudié par la cinétique de fragmentation de l'ADN cellulaire (kit Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Ind.). Brièvement, 5.105 cellules/ml ont été incubées pendant 16 heures à 37 degrés dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 dans du milieu AIM-V contenant 10 1M de BudR. Les cellules ont été lavées et remises en suspension à 105/ml dans du milieu sans BudR, et 200 ul de cette culture ont été incubés avec de l'extrait de plantes à 2·IC50 pendant le temps indiqué, après quoi 100 ul du milieu de culture ont été retirés pour la quantification de l'ADN. fragments par ELISA. C'est une mesure de la nécrose cellulaire. Des fragments d'ADN dans les cellules, générés par apoptose, ont été mesurés après lyse cellulaire dans de l'albumine de sérum bovin (BSA)/Tween 20 à 21 degrés pendant 30 min. Après centrifugation, le lysat a été utilisé pour ELISA.
L'ELISA a été réalisée dans une plaque de microtitration à fond rond revêtue d'un anticorps anti-ADN (souris anti-ADN humain monoclonal, clone MCA-33) pendant une nuit à 4 degrés. Suite au blocage avec de la BSA, 100 ul de solution de fragment d'ADN marqué ont été ajoutés aux puits revêtus suivis d'une incubation pendant 90 minutes à 21 degrés. L'ADN a été fixé et dénaturé par irradiation micro-ondes à 500 W pendant 5 min. De l'anti-BudR de souris (souris monoclonale BMG 6HB) conjugué avec de la peroxydase a été ajouté et, après incubation dans l'obscurité pendant 120 min à 21 degrés, la réaction a été arrêtée par l'ajout de 500 ul de H2SO4 concentré. La couleur résultante a été quantifiée par absorbance à 450 nm. Les échantillons traités à l'extrait ont été comparés à des témoins non traités comme arrière-plan.
L'apoptose a été confirmée par analyse TUNEL. Les cellules à croissance logarithmique ont été exposées à un extrait de plantes à 1·IC50 pendant 3 h. Ils ont ensuite été lavés deux fois dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 % de BSA et remis en suspension dans du PBS/BSA à 5·105 cellules/ml. A 500 ul de cellules, 100 ul de paraformaldéhyde à 4 % ont été ajoutés et les cellules ont été fixées à 21 degrés pendant 1 h. Après lavage dans du PBS, les cellules ont été remises en suspension dans 100 ul de tampon de perméabilisation froid (0,1 % de Triton X-100, 0,1 % de citrate de sodium) pendant 2 minutes à 4 degrés. Les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS puis remises en suspension dans un mélange TUNEL de 50 ul contenant de la désoxyribonucléotide-idyl transférase terminale (TdT) et de la fluorescéine-dUTP (kit Boehringer-Mannheim). Après incubation dans l'obscurité à 37 degrés pendant 1 h, les cellules ont été contre-colorées avec de l'iodure de propidium et analysées par cytométrie en flux.
Analyse de l'expression génique
Des cultures (6 ml) de cellules à croissance logarithmique (5·105 cellules/ml) ont été incubées dans un milieu contenant de l'extrait de plantes à 1·IC50 à 37 degrés dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 pendant 3 h. Après deux lavages dans du PBS, les culots cellulaires ont été congelés à -70 degrés pendant la nuit. L'ARN a été isolé par le protocole RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA). Généralement, cette méthode a donné 0,5 ARN LG. Cette quantité d'ARN a été rétrotranscrite en ADNc et marquée avec de la biotine-dUTP, et hybridée à des sondes dénaturées aux gènes liés à l'apoptose et au cycle cellulaire sur des filtres. L'hybridation a été détectée en liant la phosphatase alcaline-streptavidine à l'ADNc à l'aide d'un substrat chimioluminescent, CDP-Star (SuperArray, Bethesda, Md.), suivi d'une exposition à un film radiographique, généralement pendant 1 à 2 min.
Les cibles de gènes témoins sur chaque filtre comprenaient la b-actine et la GAP-DH comme témoins positifs, et pUC18 comme témoin négatif. Les gènes suivants liés au cycle cellulaire et à l'apoptose étaient des cibles d'hybridation : bad, bcl-2, BCL-w, BCL-x, caspases 1–10, c-myc, E2F, fas, fas ligand, gadd45, iNOS , mdm2, NFkB, p21Waf1, p53, pig7, pig8, Rb, DR5, trail, Casper, CRADD, DAXX, IAP-1, IAP-2, NIK, TNFR2, TRAF2, TRAF3, TRAF5 et DR5. L'intensitéd'hybridation a été notée visuellement dans des taches en double en tandem sur le filtre par rapport aux témoins positifs.
Résultats
Nos premières expériences ont testé la cytotoxicité d'extraits d'herbes chinoises sur des cellules SCLC sensibles et résistantes aux médicaments, ainsi que sur des cellules épithéliales pulmonaires normales. Comme le montre le tableau 1, les quatre extraits de plantes étaient cytotoxiques à de faibles concentrations. Ces résultats sont similaires à ceux trouvés pour SPES et PC-SPES dans d'autres lignées cellulaires tumorales [8]. Dans chaque cas, les valeurs d'IC50 pour les cellules multirésistantes (H69VP) n'étaient pas différentes de celles des cellules sensibles aux médicaments (H69). En outre, les valeurs IC50 pour les cellules épithéliales pulmonaires normales étaient significativement plus élevées que celles des lignées cellulaires tumorales.
Nous avons ensuite étudié le mécanisme de la cytotoxicité en utilisant la cinétique de fragmentation de l'ADN comme indication de l'apoptose (fragments formés lentement dans les cellules) ou de la nécrose (fragments formés et libérés rapidement des cellules endommagées). Les cellules ont été incubées dans un extrait de plantes pendant 30 min à 8 h, puis les fragments d'ADN ont été estimés par ELISA dans le milieu de culture et les lysats cellulaires. La figure 1 montre des données représentatives pour les cellules H69 exposées aux quatre extraits pendant 90 min. Avec trois des extraits (SPES, PC-SPES, OLEN), la plupart des fragments d'ADN provenaient de l'intérieur des cellules (lysats), indiquant l'apoptose. Cependant, avec GLYC, les fragments ont été libérés dans le milieu à partir de cellules endommagées, indiquant une nécrose. Des résultats similaires ont été obtenus avec des cellules H69VP (données non présentées).
Ces expériences de cytotoxicité ont été suivies par des dosages TUNEL de cassures d'ADN in situ. Par rapport aux témoins non traités (1 à 3 % de cellules apoptotiques dans quatre expériences), les cellules SCLC traitées avec SPES (58 à 85 % ), PC-SPES (63 à 77 % ) et OLEN (49 à 81 % ) ont montré une positivité TUNEL, tandis que les cellules traitées avec GLYC ne l'ont pas fait (1 à 2 pour cent) (Fig. 2). Des résultats similaires ont été obtenus avec des cellules H69VP (données non présentées).
Nous avons analysé la transcription des gènes en réponse à des extraits de plantes à l'aide de GeneArrays. Ces réseaux ont des gènes disposés en tandem liés au cycle cellulaire et à l'apoptose. Nous avons effectué ces expériences deux fois avec des résultats similaires. La figure 3 montre des diagrammes représentatifs de arrayautora de cellules H69 exposées à l'étoposide ou au SPES. Nos résultats pour les cellules H69 sont résumés dans le tableau 2. Alors que les témoins non traités avaient une expression détectable de seulement quelques-uns des gènes étudiés, les cellules traitées avec des médicaments chimiothérapeutiques conventionnels (étoposide et vincristine) ont montré des signaux forts pour un certain nombre de gènes impliqués dans le cycle cellulaire. régulation et apoptose. Les cellules traitées avec OLEN, SPES et PC-SPES ont montré un schéma similaire à ceux obtenus avec les deux médicaments. En général, les cellules traitées avec GLYC ne semblaient pas montrer ce schéma de transcription et montraient plutôt une forte expression du gène anti-apoptose, BCL-2.
Discussion
Nous avons entrepris ces études pour deux raisons. Tout d'abord, il existe une ancienne tradition de phytothérapie chinoise basée sur ses propres théories et philosophie [2], et nous voulions commencer à comprendre en termes médicaux occidentaux les effets des remèdes à base de plantes. Ces herbes sont utilisées sous forme de mélanges, et bien qu'il y ait eu quelques progrès dans leur décomposition en constituants chimiques individuels [11], nos études se sont concentrées sur elles telles qu'elles sont utilisées dans la pratique traditionnelle. Notre deuxième motivation était que de nombreux patients atteints de cancer utilisent ces herbes avec des traitements conventionnels [6, 23], et la compréhension des effets cellulaires des herbes pourrait fournir des informations importantes pour la prise de décision clinique.
Les données de cytotoxicité (tableau 1) ont montré que les quatre extraits de plantes étaient effectivement cytotoxiques pour les cellules tumorales, plus sur une base de dosage que pour les cellules épithéliales pulmonaires normales, indiquant une certaine spécificité tumorale et peut-être un index thérapeutique favorable. Les similitudes d'IC50 entre les cellules sensibles aux médicaments et multirésistantes indiquent que ces extraits ne sont pas affectés par les mécanismes de résistance aux médicaments affichés dans les cellules H69VP, y compris la surexpression de deux transporteurs de médicaments, MDR1 et MRP.
La cinétique de fragmentation de l'ADN a montré que les extraits SPES, PC-SPES et OLEN étaient pro-apoptotiques, tandis que GLYC était pron-érotique (Fig. 1). Cela a été confirmé par la coloration TUNEL in situ (Fig. 2). La plupart des médicaments chimiothérapeutiques conventionnels sont pro-apoptotiques [3], et un groupe de gènes régulateurs de l'apoptose et du cycle cellulaire est régulé positivement dans les cellules en réponse aux médicaments [24]. Nous avons constaté que le schéma d'expression de certains des gènes exprimés en réponse aux trois applications pro aux extraits de plantes était similaire à celui observé dans ces cellules après exposition à des médicaments chimiothérapeutiques conventionnels (Fig. 3, Tableau 2). La réponse au GLYC seul semblait être différente, du moins au moment analysé dans ces expériences. Fait intéressant, GLYC fait partie de PC SPES, qui était pro-apoptotique, alors que GLYC seul ne l'était pas. Peut-être que d'autres composants de PC-SPES sont responsables de son activité pro-apoptotique. Bien que ces résultats ne montrent pas comment les extraits de plantes endommagent les cellules, ils suggèrent que les cellules H69 réagissent aux dommages aux niveaux moléculaire (transcription) et cellulaire (apoptose) d'une manière similaire à leur réponse à la chimiothérapie.
Nos études indiquent l'utilité potentielle de ces extraits de plantes chinoises dans le traitement du CPPC, en particulier des maladies résistantes aux médicaments.
RemerciementsNous remercions L. Brown pour son aide inestimable avec ses collègues cytométrie et R. Lingeman pour son aide avec les protocoles de biologie moléculaire. Les cellules BEAS-2 ont été généreusement fournies par le Dr I. Laird-Offringa, University of SouthernCalifornia, Norris Cancer Center. SPES et PC-SPES ont été offerts par le Dr S. Chen, New York Medical College. Cette recherche a été soutenue par la Pritzker Family Foundation et la WM KeckFoundation.
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