L'effet de l'inhibiteur STAT6 AS1517499 dans le traitement de la fibrose rénale
Mar 24, 2022
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PARTIE Ⅰ : L'inhibition pharmacologique de STAT6 améliore l'activation des fibroblastes myéloïdes et la polarisation alternative des macrophages dans la fibrose rénale
Baihai Jiao, Changlong An, Melanie Tran, Hao Du, Penghua Wang, Dong Zhou et Yanlin Wang
INTRODUCTION
L'insuffisance rénale chronique (IRC) est devenue un enjeu majeur de santé publique(1). La fibrose est la voie commune ultime pour le développement de l'IRC et est considérée comme un facteur majeur de progression de toutes les formes d'IRC(2).Fibrose rénaleest une caractéristique pathologique de l'IRC, entraînant le remplacement de la structure normale du tissu rénal par une matrice extracellulaire (ECM) avec des dommages progressifs et irréversibles à la fonction rénale (3). Cependant, malgré une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires defibrose rénale, il n'existe pas de traitement spécifique pour contrôler la fibrose et restaurer la fonction rénale. Comme l'origine et la contribution fonctionnelle des fibroblastes ne sont pas complètement comprises, le ciblage efficace des fibroblastes dans la fibrose des organes reste un défi.
De nombreuses preuves indiquent que les myéloïdes myéloïdes appelés fibrocytes jouent un rôle crucial dans le processus de fibrose(4-7). Nous et d'autres avons déjà montré que le recrutement de fibroblastes dérivés de la moelle osseuse augmente la progression et le développement derénalfibrose(8-12). Par conséquent, le ciblage de ces cellules peut constituer une stratégie thérapeutique efficace pour traiter l'insuffisance rénale chronique. Les fibroblastes dérivés de la moelle osseuse partagent les caractéristiques des cellules mésenchymateuses ainsi que des cellules hématopoïétiques(13,14). Cependant, diverses cytokines produites dans le microenvironnement local déterminent la différenciation des fibroblastes dérivés de la moelle osseuse. Nous avons précédemment démontré que les cytokines Th2 (I-4 et IL-13), qui sont considérées comme des cytokines profibrotiques, améliorent l'expression du collagène de type I, de la fibronectine et du -SMA dans les monocytes dérivés de la moelle osseuse (15 , 16).
STAT6la signalisation est principalement activée par les cytokines Th2 telles que IL-4 et IL-13 et est associée à la pathogenèse du poumon (17,18), du foie (19) etrénalfibrose(15, 20). Nous avons récemment montré que JAK3/STAT6joue un rôle crucial dans l'activation des fibroblastes dérivés de la moelle osseuse et le développement derénalfibrosedans la néphropathie obstructive(15). De plus, nous avons montré que le knock-out de IL-4Ro inhibeSTAT6activation, accumulation de fibroblastes myéloïdes et transformation en myofibroblastes, polarisation des macrophages M2 et développement derénalfibrosesuite à une lésion obstructive ou à l'administration d'acide folique(16). Ces constatations suggèrent que laSTAT6voie de signalisation peut servir de nouvelle cible thérapeutique pourrénalfibrose.
Dans cette étude, nous avons évalué le rôle thérapeutique potentiel deAS1517499, un puissant et sélectifSTAT6inhibiteur(21), dans l'activation des fibroblastes myéloïdes et le développement derénalfibrosedans deux modèles murins expérimentaux. Nos résultats démontrent queAS1517499aboliSTAT6activation dans les cellules interstitielles du rein avec lésion obstructive ou néphropathie à l'acide folique. En outre, l'administration deAS1517499supprime l'activation des fibroblastes myéloïdes, réduit la polarisation des macrophages M2 et atténuerénalfibrose. Ces résultats suggèrent que l'inhibition deSTAT6avecAS1517499a le potentiel pour le traitement de la maladie rénale fibrotique.
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RÉSULTATS
L'AS1517499 inhibe l'activation de STAT6 dans le rein avec une lésion obstructive
Nous avons signalé que JAK3/STAT6la signalisation est activée dans les cellules interstitielles des reins fibrotiques suite à une lésion obstructive ou à l'administration d'acide folique(15,16). Pour évaluer siSTAT6peut servir de cible thérapeutique pour le traitement derénalfibrose, des souris de type sauvage ont été soumises à une lésion obstructive puis traitées avec un véhicule ouAS1517499, a STAT6- inhibiteur spécifique, tous les deux jours pendant 10 jours. Une coloration immunohistochimique et une analyse Western blot ont été réalisées pour examinerSTAT6activation dans le rein. La coloration immunohistochimique a révélé que le phosphore positifSTAT6la coloration a été principalement détectée dans les cellules interstitielles du rein avec une néphropathie obstructive, qui a été réduite parAS1517499traitement (figures 1A, B). Conformément à ces résultats, l'analyse Western blot a montré le niveau de phospho-STAT6a été inhibée dans le rein avec une néphropathie obstructive aprèsAS1517499traitement (figures 1C, D). Ces données indiquent que l'inhibition deSTAT6avecAS1517499empêcheSTAT6activation dans le rein avec néphropathie obstructive.AS1517499Altère l'accumulation de fibroblastes myéloïdes dans la néphropathie obstructive De nombreuses preuves indiquent que le recrutement de fibroblastes myéloïdes contribue de manière significative à la pathogenèse derénalfibrose. Pour rechercher siAS1517499affecte l'accumulation de fibroblastes myéloïdes, des sections de rein ont été colorées pour le marqueur hématopoïétique CD45 et le marqueur mésenchymateux PDGFR-.
FIGURE 1|AS1517499 inhibe l'activation de STAT6 dans le rein avec une lésion obstructive.(A) Photomicrographies représentatives de sections de rein au jour 10 d'UUO colorées pour phosphoryléeSTAT6(marron) et contre-coloré à l'hématoxyline (bleu). Barre d'échelle, 50um. (B) Analyse quantitative des phosphorylésSTAT6-cellules positives dans le rein.***P<0.001 vs.=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" western="" blots="" show="" protein="" levels="" of="">STAT6etSTAT6dans le rein au jour 10 de UUO.(D) Analyse quantitative p-STAT6taux de protéines dans le rein, *** P<0.001 vs=""><0.05 vs="" vehicle-uuo;="">< 0.05="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="">
Le nombre de cellules doublement positives CD45 et PDGFR était significativement augmenté dans les reins obstrués, alors queAS1517499le traitement a nettement réduit les cellules CD45 et PDGFR-doublement positives (figures 2A, B). Ces données suggèrent queSTAT6inhibiteurAS1517499améliore l'accumulation de fibroblastes myéloïdes dans le rein après une lésion obstructive.AS1517499Atténue la polarisation des macrophages M2 dans la néphropathie obstructive La transformation des monocytes en fibroblastes dérivés de la moelle osseuse est médiée par la polarisation des macrophages M2.STAT6joue un rôle clé dans la polarisation des macrophages M2. Par conséquent, nous avons examiné si l'inhibition deSTAT6avecAS1517499médie la polarisation des macrophages. Des sections de rein ont été colorées pour CD206 (marqueur de macrophage M2) et PDGFR-. CD206 et PDGFR- cellules positives doubles ont été nettement augmentées dans le rein de souris présentant une lésion obstructive. En revanche,AS1517499réduit de manière significative le nombre de cellules CD206 plus et PDGFR- plus dans les reins atteints de néphropathie obstructive (figures 2C, D). Ces données indiquent queAS1517499atténue significativement la transition des monocytes en fibroblastes myéloïdes et réduit la polarisation des macrophages M2.
FIGURE 2 |AS1517499 atténue l'accumulation de fibroblastes myéloïdes et la polarisation des macrophages dans le rein avec une lésion obstructive.(A) Photomicrographies représentatives de sections de kidhey au jour 10 de UUO colorées pour CD45 (rouge), PDGFR- (vert) et DAPI (bleu) Barre d'échelle, 50 μm. B） Analyse quantitative des fibroblastes CD45* et PDGFR-* dans le rein.**P<0.001 vs=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (c)representative="" photomicroaraphs="" of="" the="" kidney="" at="" day="" 10ofuuo="" stained="" for="" cd206="" (red).pdgfr-b="" (green).and="" dapiblue).scale="" bar.,50um.(d)="" quantitative="" analysis="" of="" cd206t="" and="" pdgfr-b+="" fibroblasts="" in=""><0.01 ys=""><0.01 vs=""><0.01 vs="" as-uuo.n="6" per="" group.="" (e)quantitative="" analysis="" of="" mrnaexpression="" of="" m2="" macrophage="" markers="" (mrc.fzz1.arg1.ccl17="" in="" the="" kidney="" of="" vehide="" or="">AS1517499souris traitées.*P<><><0.05 vs=""><><0.05 vs=""><><0.05vs as-uuo.n="6" per="">
Pour mieux évaluer l'effet deSTAT6inhibiteurAS1517499sur la polarisation des macrophages M2, une RT-PCR en temps réel a été réalisée pour détecter les expressions d'ARNm des marqueurs des macrophages M2.AS1517499le traitement a supprimé l'abondance de l'expression de l'ARNm d'Argl, MRCl, Fizzl et CCL17 dans les reins obstrués (figure 2E). Ces données indiquentSTAT6coloration par immunofluorescence de signalisation et analyse Western blot. La coloration par immunofluorescence et l'analyse Western blot ont révélé que les niveaux de fibronectine et de collagène I étaient nettement augmentés dans le rein obstrué, alors queAS1517499le traitement a significativement atténué les taux de protéines de collagène I et de fibronectine dans le rein obstrué (figures 4C-H).
FIGURE 3|L'AS1517499 réduit la formation de myofibroblastes dans le rein en cas de lésion obstructive.(A) Photomicrographies représentatives de sections de rein traitées UUO colorées pour a-SMA (vert) et contre-colorées avec DAPI (bleu). Barre d'échelle, 50 mm. (B) Analyse quantitative de la zone positive a-SMA dans le rein. ***P < 0.001="" contre="" véhicule-con,="" #="" p="">< 0.05="" contre="" véhicule-uuo,="" plus="" plus="" p="">< 0,01="" vs="" as-uuo.="" n="6" par="" groupe.="" (c)="" les="" western="" blots="" représentatifs="" montrent="" les="" niveaux="" de="" protéine="" a-sma="" dans="" le="" rein.="" (d)="" analyse="" quantitative="" de="" l'expression="" de="" la="" protéine="" a-sma="" dans="" le="" rein.="" ***p="">< 0,001="" vs="" véhicule-con,="" ##p="">< 0,01="" vs="" véhicule-uuo,="" plus="" plus="" p="">< 0,01="" vs="" as-uuo.="" n="6" par="">
FIGURE 4|L'AS1517499 atténue la fibrose rénale et la production de protéines ECM dans le rein présentant une lésion obstructive.(A) Photomicrographies représentatives de sections de rein colorées au rouge Sirius pour l'évaluation du dépôt total de collagène dans le rein. Barre d'échelle, 50 mm. (B) Analyse quantitative du dépôt interstitiel de collagène dans le rein. ***P<0.001 vs="" vehicle-con.="" ##p="" <="" 0.01="" vs="" vehicle-uuo,="" ++p="" <="" 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (c)="" representative="" photomicrographs="" of="" the="" kidney="" sections="" stained="" for="" fibronectin="" (green)="" and="" counterstained="" with="" dapi="" (blue).="" scale="" bar,="" 50mm.="" (d)="" quantitative="" analysis="" of="" the="" fibronectin-positive="" area="" in="" the="" kidney.="" ***p="" <="" 0.001="" vs="" vehicle-con.="" ##p="" <="" 0.01="" vs="" vehicle-uuo,="" +="" p="" <="" 0.05="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (e)="" representative="" photomicrographs="" of="" the="" kidney="" sections="" stained="" for="" collagen="" i="" (green)="" and="" counterstained="" with="" dapi="" (blue).="" scale="" bar,="" 50mm.="" (f)="" quantitative="" analysis="" of="" collagen="" i="" positive="" area="" in="" the="" kidney.="" ***p="" <="" 0.001="" vs="" vehicle-con.="" #="" p="" <="" 0.05="" vs="" vehicle-uuo,="" ++p="" <="" 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="" group.="" (g)="" representative="" western="" blots="" show="" protein="" expression="" of="" fibronectin="" and="" collagen="" i="" in="" the="" kidney.="" (h)="" quantitative="" analysis="" of="" protein="" levels="" of="" fibronectin="" and="" collagen="" i="" in="" the="" kidney.="" ***p="" <="" 0.001="" vs="" veh-con;="" ##p="" <="" 0.01,="" #="" p="" <="" 0.05="" vs="" veh-uuo;="" ++p="" <="" 0.01="" vs="" as-uuo.="" n="6" per="">
AS1517499 InhibeSTAT6Activation dans la néphropathie à l'acide folique
La néphropathie à l'acide folique est un autre modèle murin couramment utilisé derénalfibrose. Par conséquent, nous avons examiné siAS1517499peut inhiberSTAT6activation et pathogenèse derénalfibrosedans la néphropathie à l'acide folique. Des coupes de rein ont été colorées pour la phospho-STAT6.STAT6la phosphorylation a été significativement induite dans les cellules interstitielles du rein avec une néphropathie FA, alors queAS1517499le traitement a nettement inhibé l'expression de phospho-STAT6 (figures 5A, B). Ces résultats ont été confirmés par une analyse Western blot (figures 5C, D). Ces données indiquent queSTAT6est activé dans les cellules interstitielles du rein endommagé par la néphropathie à l'acide folique, qui est significativement inhibée aprèsAS1517499traitement.
FIGURE 5|L'AS1517499 inhibe l'activation de STAT6 dans la néphropathie à l'acide folique.(A) Images représentatives de la coloration immunohistochimique de phosphoryléSTAT6dans le rein 2 semaines après le véhicule ouAS1517499traitement. Barre d'échelle, 50 mm. (B) Analyse quantitative des phosphorylésSTAT6-cellules positives dans le rein 2 semaines après le véhicule ouAS1517499traitement. ***P < {{0}}.001="" contre="" con ;="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" plus="" véh.="" n="6" par="" groupe.="" (c)="" western="" blot="" représentatif="" de="">STAT6etSTAT6dans le rein. (D) Analyse quantitative p-STAT6niveaux de protéines dans le rein. ***P < {{0}}.001="" contre="" con ;="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" plus="" véh.="" n="6" par="">
AS1517499Supprime l'accumulation de fibroblastes myéloïdes dans la néphropathie à l'acide folique Examiner le rôle deAS1517499dans l'accumulation de fibroblastes myéloïdes dans le rein avec néphropathie à l'acide folique, nous avons effectué une double coloration par immunofluorescence pour CD45 et PDGFR-. Le nombre de cellules doublement positives pour CD45 et PDGFR a augmenté dans le rein avec une néphropathie à l'acide folique.AS1517499a considérablement supprimé le nombre de cellules positives doubles CD45 et PDGFR dans le rein avec une néphropathie à l'acide folique (figures 6A, B).
AS1517499Atténue la polarisation des macrophages M2 dans la néphropathie à l'acide folique Nous avons ensuite examiné si l'inhibition pharmacologique deSTAT6avecAS1517499régule la polarisation des macrophages M2 dans la néphropathie FA. Comme confirmé par l'analyse de coloration par immunofluorescence, le traitement deAS1517499a inhibé de manière significative le nombre de cellules CD206 et PDGFR- double positives par rapport aux souris traitées avec un véhicule avec administration de FA (figures 6C, D). Ces marqueurs macrophages M2 ont été réduits aprèsAS1517499traitement (Figure 6E). Ces données indiquent que l'inhibition pharmacologique deSTAT6avecAS1517499atténue la polarisation des macrophages M2 dans le rein avec une néphropathie FA.
FIGURE 6|L'AS1517499 atténue l'accumulation de fibroblastes myéloïdes et la polarisation des macrophages dans la néphropathie à l'acide folique.(A) Photomicrographies représentatives de sections de rein 2 semaines après le véhicule ouAS1517499traitement coloré pour CD45 (rouge), PDGFR-b (vert) et DAPI (bleu). Barre d'échelle, 50 mm. (B) Analyse quantitative des fifibroblastes CD45 plus et PDGFR-b plus dans le rein. **P < 0.01="" contre="" con.="" #="" p="">< 0,05="" vs="" fa="" plus="" véh.="" n="6" par="" groupe.="" (c)="" photomicrographies="" représentatives="" de="" sections="" de="" rein="" 2="" semaines="" après="" le="" véhicule="">AS1517499traitement coloré pour CD206 (rouge), PDGFR-b (vert) et DAPI (bleu). Barre d'échelle, 50 mm. (D) Analyse quantitative des fifibroblastes CD206 plus et PDGFR-b plus dans le rein. ***P < 0,001="" contre="" con.="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" plus="" véh.="" n="6" par="" groupe.="" (e)="" analyse="" quantitative="" de="" l'expression="" de="" l'arnm="" des="" fabricants="" de="" macrophages="" m2="" (mrc,="" fizz1,="" arg1,="" ccl17)="" dans="" le="" rein="" 2="" semaines="" après="" le="" véhicule="">AS1517499traitement. ***P < {{0}}.001="" contre="" con ;="" ###p="">< 0,001="" vs="" fa="" plus="" veh ;="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" plus="" véh.="" n="6" par="">
AS1517499Atténue la formation de myofibroblastes dans la néphropathie à l'acide folique Pour déterminer siAS1517499affecte la transformation des myofibroblastes, l'expression de -SMA a été examinée dans des coupes de rein et par analyse Western blot. Conformément à nos découvertes dans le modèle UUO, les myofibroblastes positifs pour -SMA et l'expression de la protéine -SMA ont été améliorés dans le rein après traitement avec FA par rapport aux souris traitées avec le véhicule. De plus, la co-administration de FA avecAS1517499réduit significativement les cellules positives -SMA et le niveau de protéine -SMA dans le rein par rapport au groupe de véhicule co-administré FA (figures 7A-D). Ces résultats démontrent queAS1517499inhibe la formation de myofibroblastes dans le rein avec néphropathie à l'acide folique.
FIGURE 7|L'AS1517499 réduit la formation de myofibroblastes dans la néphropathie à l'acide folique.(A) Photomicrographies représentatives de sections de rein 2 semaines après le véhicule ouAS1517499traitement coloré pour a-SMA (vert) et contre-coloré avec DAPI (bleu). Barre d'échelle, 50 mm. (B) Analyse quantitative de la zone positive a-SMA dans le rein. ***P < 0.001="" contre="" con ;="" ###p="">< 0,001="" vs="" fa="" plus="" véh.="" n="6" par="" groupe.="" (c)="" western="" blots="" représentatifs="" montrant="" les="" niveaux="" de="" protéine="" a-sma="" dans="" le="" rein="" 2="" semaines="" après="" le="" véhicule="">AS1517499traitement. (D) Analyse quantitative de l'expression de la protéine a-SMA dans le rein. ***P < 0.001="" contre="" con,="" ##p="">< 0,01="" contre="" fa="" plus="" veh.="" n="6" par="">
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AS1517499 amélioreRénalFibroseet préserve la fonction rénale dans la néphropathie à l'acide folique
Pour évaluer l'effet deAS1517499surrénalfibrose, une coloration au picrosiriusred a été réalisée sur des coupes de rein. Les souris traitées par FA avaient des niveaux nettement élevés de dépôt de collagène, alors queAS1517499le traitement a considérablement réduit les quantités de dépôt de collagène dans le rein (figures 8A, B). De plus, la coloration par immunofluorescence et l'analyse Western blot ont en outre démontré queAS1517499inhibe de manière significative l'expression des protéines ECM (fibronectine et collagène I) dans le rein atteint de néphropathie à l'acide folique (figures 8C-H). Ces données suggèrent queAS1517499inhibe la production d'ECM dans le rein et le développement derénalfibrosedans la néphropathie à l'acide folique.
Pour évaluer l'effet deSTAT6déficience sur la fonction rénale dans la néphropathie à l'acide folique, la créatinine sérique a été mesurée. Les souris traitées à l'acide folique ont présenté une élévation significative de la créatinine sérique (figure 8I). En revanche, les souris traitées avecAS1517499présentait une créatinine sérique beaucoup plus faible dans la néphropathie à l'acide folique. Ces résultats indiquent que l'inhibition deSTAT6avecAS1517499protège le rein de la néphropathie à l'acide folique.
FIGURE 8|AS1517499 réduit la fibrose rénale et préserve la fonction rénale dans la néphropathie à l'acide folique. (A) Photomicrographies représentatives de sections de rein 2 semaines après le véhicule ouAS1517499traitement coloré au rouge Sirius pour l'évaluation du dépôt total de collagène dans le rein. Barre d'échelle, 50 mm. (B) Analyse quantitative du dépôt interstitiel de collagène dans le rein. ***P < 0.0{{10}}1="" contre="" con,="" ##p="">< 0.01="" contre="" fa="" plus="" veh="" .="" n="6" par="" groupe.="" (c)="" photomicrographies="" représentatives="" de="" sections="" de="" rein="" colorées="" pour="" la="" fibronectine="" (vert)="" et="" contre-colorées="" avec="" dapi="" (bleu).="" barre="" d'échelle,="" 50 mm.="" (d)="" analyse="" quantitative="" de="" la="" zone="" positive="" à="" la="" fifibronectine="" dans="" les="" reins="" traités="" par="" fa.="" ***p="">< 0,001="" contre="" con,="" ##p="">< 0,01="" contre="" fa="" plus="" veh.="" n="6" par="" groupe.="" (e)="" photomicrographies="" représentatives="" de="" sections="" de="" rein="" colorées="" pour="" le="" collagène="" i="" (vert)="" et="" contre-colorées="" avec="" dapi="" (bleu).="" barre="" d'échelle,="" 50="" mm.="" (f)="" analyse="" quantitative="" de="" la="" zone="" positive="" au="" collagène="" i="" dans="" le="" rein.="" ***p="">< 0,001="" contre="" con,="" #="" p="">< 0,05="" contre="" fa="" plus="" veh.="" n="6" par="" groupe.="" (g)="" western="" blots="" représentatifs="" montrant="" l'expression="" protéique="" de="" la="" fibronectine="" et="" du="" collagène="" i="" dans="" le="" rein.="" (h)="" analyse="" quantitative="" des="" taux="" de="" protéines="" de="" fibronectine="" et="" de="" collagène="" i="" dans="" le="" rein.="" ***p="">< 0,001="" contre="" con ;="" ##p="">< 0,01="" vs="" fa="" plus="" véh.="" n="6" par="" groupe.="" (i)="" effet="">AS1517499sur la créatinine sérique. **P < {{0}}.001="" contre="" con ;="" #="" p="">< 0,05="" vs="" fa="" plus="" véh.="" n="6" par="">
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