Effets des glyéosides de cistanche sur l'apprentissage de la cognition et de la plasticité synaptique chez des rats modèles de privation de sommeil
Aug 23, 2024
ABSTRAIT
Objectif:Explorer si les glycosides du cistanche peuvent améliorer l'apprentissage et la fonction cognitive des rats modèles de privation de sommeil en régulant la plasticité synaptique.
Méthodes : Cinquante rats Wistar mâles ont été répartis au hasard en un groupe témoin vierge (Contrôle), un groupe témoin plate-forme (PC), un groupe modèle (Modèle),glycosides du groupe cistanche (GC), et le groupe estazolam ( Est ). Le modèle de privation de sommeil des rats a été préparé par une méthode modifiée d'environnement aquatique multiplateforme. Le labyrinthe aquatique de Morris et les tests en champ ouvert ont été utilisés pour détecter la fonction cognitive spatiale et les changements émotionnels des rats. La coloration Nissl a été utilisée pour observer les changements de morphologie et de quantité de cellules nerveuses dans lezone CAl de l'hippocampe du rat. Le Western blot et la R'T - PCR ont été utilisés pour détecter les niveaux d'expression de la synaptophysine (SY'N), substance dense à membrane post-synaptique 95 (PSD -95), etfacteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF).
Résultats;Les résultats du labyrinthe aquatique Morris ont montré que par rapport au groupe témoin, leapprentissage et capacité cognitive des ratsdans le groupe modèle était significativement diminué ( P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wastraitement amélioré par les GC ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the niveaux d'expression des protéines et des gènes du BDNF, SYN et PSD -95dans le groupe Mlodel ont été significativement diminués ( P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.
MOTS CLÉSGlycosides de cistanche; Hippocampe ; Privation de sommeil ; Apprentissage et mémoire ; Anxiété; Plasticité synaptique
Trouble du sommeil (SD)est untrouble fonctionnel du sommeil anormalcausée par une série de facteurs complexes tels queinsomnie, rêverie, etréveil facile. Au cours des dernières années,l'incidence du SDa progressivement augmenté. Des études connexes ont rapporté que le SD peut causermaladies cardiovasculaires,dysfonctionnement métabolique,maladies immunitaires, etsystème nerveux centralmaladies dégénératives telles que la maladie d'Alzheimer [1]. Le SD peut provoquer des dommages oxydatifs aux neurones de l'hippocampe, provoquer un dysfonctionnement cognitif et produire des changements d'humeur tels que l'anxiété et la dépression [2]. La cistanche deserticola est une matière médicinale précieuse qui peut être utilisée à la fois comme médicament et comme aliment en Chine. Il a pour effet de tonifier les reins et de reconstituer le qi, d'humidifier les intestins, de favoriser les selles et de renforcer le yang. L'extrait principal de Cistanche deserticola, les glycosides de cistanche (GC), a des effets antioxydants, anti-apoptotiques, protecteurs du foie et neuroprotecteurs [3]. Nos recherches précédentes ont montré que les GC peuvent améliorer l'apprentissage et la fonction cognitive des souris SAMP8 en jouant un rôle antioxydant et anti-apoptotique [4].
Des études connexes ont montré que le dysfonctionnement cognitif provoqué par le SD est étroitement lié à la plasticité synaptique [5]. Cependant, il existe peu de rapports sur le mécanisme par lequel les GC régulent la plasticité synaptique et améliorent les troubles de l'apprentissage et de la mémoire ainsi que le déclin cognitif chez les rats induits par la privation de sommeil. Par conséquent, cette étude vise à explorer si les GC affectent la plasticité synaptique en régulant l'expression de marqueurs synaptiques, améliorant ainsi l'apprentissage et la fonction cognitive des rats avec des modèles de privation de sommeil, et à fournir de nouvelles idées et plans de traitement pour que les GC traitent l'apprentissage et cognitif. déficience causée par des troubles du sommeil.
1 Matériels et méthodes
1.1 Animaux expérimentaux
Des rats Wistar mâles âgés de 6 à 8 semaines, pesant 280 à 300 g, ont été achetés à Beijing Sibeifu, avec une licence de production animale [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Tous les animaux ont été gardés au Centre d'expérimentation animale du Baotou Medical College dans les conditions suivantes : température (24 ± 1) degrés, humidité de 50 % à 55 %, 12 h de lumière et 12 h d'obscurité, et aucune restriction sur la nourriture et l'eau. Cette expérience a été approuvée par le comité d'éthique de l'école [Baoyi Lunshen 2022 n° (63)].
1. 2 Principaux réactifs et instruments
Les glycosides totaux de Cistanche deserticola ont été achetés auprès de Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (numéro de lot : KSM20220609011) ; Les comprimés d'Estazolam ont été achetés auprès du CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (numéro de lot : 044220343) ; le tampon de chargement de protéines (P1015), le tampon de lyse RIPA (R0010), la solution chimiluminescente (PE0010), etc. ont tous été achetés auprès de Beijing Solebao ; la substance de densité post-synaptique dans l'anticorps 95 (PSD -95) (AB192757) et l'anticorps synaptophysine (SYN) (ab32127) ont été achetées auprès d'Abcam, USA Company ; Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) (48503-2) et la -actine (52901) ont été achetés auprès de la société SAB, États-Unis ; L'anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin (SA 00001-20) a été acheté auprès de Proteintech Company, USA ; la mélatonine de rat (MT) et le kit de recherche scientifique ELISA (MM-0657R1) ont été achetés auprès de Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Trancheur de paraffine (Leica, Allemagne); microscope optique (Leica, Allemagne) ;
Labyrinthe aquatique Morris, boîte d'essai en champ ouvert (Shanghai Xinruan) ; appareil d'électrophorèse verticale (Beijing Liuyi Company); agitateur de décoloration (Beijing Liuyi Company) ; système d'analyse d'imagerie protéique (Shanghai Tanon Technology) ; Instrument de PCR quantitative à fluorescence (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).
1.3 Méthodes expérimentales
1.3.1 Regroupement d'animaux et administration de médicaments
50 rats Wistar mâles ont été divisés au hasard en groupe témoin vierge (groupe témoin), groupe témoin plateforme (contrôle plateforme, groupe PC), groupe modèle (groupe modèle), glycosides totaux du groupe Cistanche deserticola (groupe GC). , 50 mg/kg) et le groupe estazoline (groupe Est, 0,54 mg/kg), avec 10 rats dans chaque groupe. Le groupe témoin et le groupe PC ont reçu une solution saline à 0,9 % par gavage. Tous les groupes ont été gavageés à 7 heures du matin tous les jours après le début de la modélisation, et le gavage a duré 21 jours.
1.3. 2. Préparation du modèle animal de privation de sommeil
Le modèle de privation de sommeil a été établi à l'aide de la méthode modifiée de l'environnement aquatique multiplateforme [6]. L'équipement expérimental était un réservoir d'eau rectangulaire en résine de polyéthylène de 130 cm × 50 cm × 45 cm. Une petite plateforme d'un diamètre de 5 cm et d'une hauteur de 20 cm a été placée dans le réservoir d'eau. La plateforme du groupe PC avait un diamètre de 10 cm et une hauteur de 20 cm. Le réservoir d'eau a été rempli d'eau jusqu'à une profondeur d'environ 18 cm et la température de l'eau a été maintenue à (20 ± 1) degrés. Une semaine avant le début de l’expérience, les rats ont été placés quotidiennement dans la boîte de privation de sommeil pendant 60 minutes afin de se familiariser avec l’environnement. Une fois le modèle établi, à l'exception du groupe témoin, les rats de chaque groupe ont été placés sur la petite plate-forme à temps, de 8 h à 20 h, tous les jours pour une privation de sommeil pendant 21 jours consécutifs.
Tous les rats avaient libre accès à la nourriture et à l’eau et se déplaçaient librement sur la plate-forme. Le cycle de lumière et d’obscurité durait 12 heures par jour.
1. 3. 3 Expérience du labyrinthe aquatique Morris
Le labyrinthe aquatique Morris a été divisé en 4 zones remplies d’eau et la plate-forme a été placée dans le 4ème quadrant. La surface de l'eau se trouvait à environ 2 cm au-dessus de la plateforme. De la mélanine comestible de qualité alimentaire a été ajoutée à l'eau et la température de l'eau a été maintenue à (25 ± 1) degrés. (1) Expérience de navigation par positionnement : le centre de chaque zone a été sélectionné et les rats ont été doucement placés dans l'eau. Ils étaient autorisés à explorer librement. Le temps nécessaire aux rats pour trouver la plate-forme cible en 60 secondes a été enregistré. Les rats qui n’ont pas trouvé la plate-forme ont été guidés vers la plate-forme et y sont restés 20 secondes. La formation s'est poursuivie pendant 5 jours. (2) Test d'exploration spatiale : Au 6ème jour, la plateforme a été retirée et les rats ont été placés dans l'eau depuis le centre du 2ème quadrant contre la paroi. Le nombre de fois où les rats ont dépassé la plate-forme en 120 s et le temps pendant lequel ils sont restés dans le 4ème quadrant ont été enregistrés.
1. 3. 4 Expérience en plein champ
Une boîte expérimentale de 100 cm × 100 cm × 50 cm a été utilisée et le fond de la boîte a été divisé en 9 grilles. Chaque groupe de rats a été placé au préalable dans la salle expérimentale en plein champ pour s'adapter à l'environnement intérieur pendant 60 minutes. Au début de l'expérience, les rats testés ont été placés tour à tour dans des coins fixes de la boîte expérimentale en champ ouvert, et le nombre de temps debout, la distance de mouvement et le temps statique des rats dans un délai de 5 minutes ont été enregistrés à l'aide d'un logiciel d'analyse comportementale. L'environnement devait être calme pendant l'expérience et le dispositif expérimental était essuyé respectivement avec de l'eau et de l'alcool entre deux expériences pour éviter que l'odeur du premier rat n'affecte le jugement comportemental du rat suivant.
1. 3. 5 Test immuno-enzymatique (ELISA)
Détection des taux sériques de MT chez les rats Les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale et 5 ml de sang ont été prélevés dans l'aorte abdominale. Après avoir attendu 30 minutes à température ambiante, le sang a été centrifugé pour obtenir du sérum. 40 µL de diluant d’échantillon ont été ajoutés à chaque puits, puis 10 µL de l’échantillon à tester ont été ajoutés. Après avoir été scellée avec un film de scellement, la plaque a été incubée à 37 degrés pendant 30 minutes. Lavée 5 fois, 50 µL de solution de marquage enzymatique ont été ajoutés et la plaque a été scellée avec un film d'étanchéité et incubée à 37 degrés pendant 30 min. Lavé 5 fois, puis la solution révélatrice de couleur et la solution de fin de réaction ont été ajoutées tour à tour. La valeur OD de chaque puits a été mesurée par un marqueur enzymatique à une longueur d'onde de 450 nm.
1. 3. 6 Coloration Nissl
Trois rats ont été sélectionnés dans chaque groupe et le tissu cérébral a été prélevé par décapitation et fixé avec une solution de polyoxyéthylène à 4 %. Le tissu a été déshydraté, immergé dans une solution de cire, incorporé et tranché par des méthodes conventionnelles. Les tranches ont été conservées sur une épaisseur de 5 µm, rincées au PBS, colorées au 0,1% de bleu de toluidine pendant 0,5 h, différenciées à l'alcool à 95%, déshydratées à l'alcool à 100%, transparentisées. avec du xylène et scellé avec de la gomme neutre. Les changements dans la morphologie et le nombre de neurones dans la région CA1 de l'hippocampe du rat ont été observés au microscope et des images ont été collectées.
1. 3. 7 Expérience de transfert Western
Quatre rats ont été sélectionnés dans chaque groupe et l'hippocampe a été isolé par décapitation. Le tissu de l'hippocampe a été mélangé avec du tampon de lyse RIP A dans un environnement de bain de glace et le tissu a été centrifugé pour obtenir le surnageant. La concentration en protéines a été détectée par la méthode BCA. 20 µg de protéine ont été ajoutés avec un tampon de chargement de protéines pour l'électrophorèse. Une fois l'électrophorèse des protéines terminée, la membrane a été transférée à un débit constant de 300 mA, bloquée avec 5 % de lait écrémé en poudre, l'anticorps primaire a été incubé à 4 degrés pendant la nuit et l'anticorps secondaire a été incubé à température ambiante pendant 2 h. Après avoir utilisé la solution de développement couleur, les bandes de protéines ont été analysées statistiquement à l'aide d'un système d'analyse par imagerie par chimiluminescence.
1. 3. 8 Expérience RT-PCR
Trois rats ont été sélectionnés dans chaque groupe pour préparer un homogénat de tissu hippocampique. L'ARN total dans le fluide tissulaire a été extrait par la méthode Trizol et la concentration a été mesurée. Un kit de synthèse d'ADNc fastking a été utilisé pour la transcription inverse et une réaction d'amplification quantitative par fluorescence a été réalisée à l'aide d'un kit quantitatif par fluorescence pour détecter le niveau d'expression relatif de l'ARNm de la protéine liée à la synaptique. Les résultats ont été analysés en utilisant 2-ΔΔCt. Les séquences d'amorces sont présentées dans le tableau 1.
Tableau 1 Séquences d'amorces RT-PCR
1.4 Méthodes statistiques
Les résultats des données conformes à la distribution normale ont été exprimés en moyenne ± écart type (x ± s) et une analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism 9.5. Une analyse de variance unidirectionnelle a été utilisée pour comparer plusieurs échantillons, et P < 0,05 a indiqué que la différence était statistiquement significative.
