Évaluation du transport intestinal d'un extrait riche en phényléthanoïdes glycosides de Cistanche Deserticola à travers le modèle monocouche cellulaire Caco-2

Introduction

La lignée cellulaire Caco-2, dérivée d'adénocarcinomes du côlon humain, présente des caractéristiques semblables à celles des entérocytes. Dans des conditions normales, les cellules Caco-2 se différencient spontanément des cellules matures et forment des monocouches intactes [1]. Les cellules adjacentes adhèrent via des jonctions serrées formées sur le côté apical de la monocouche, ce qui peut discriminer les médicaments transportés passivement et activement à travers la couche épithéliale [2]. En raison de la similitude morphologique et biochimique avec les entérocytes normaux, les monocouches de cellules Caco-2 servent de modèle in vitro bien accepté pour l'étude du potentiel d'absorption intestinale et des caractéristiques de transport des médicaments [3, 4].

Contrairement aux produits chimiques, les extraits de plantes (EP) sont des mélanges dont l'activité biologique et les constituants actifs sont souvent mal identifiés [5]. De plus, les propriétés de transport intestinal du PE, contrairement aux propriétés de ses constituants, sont étroitement liées à l’utilisation clinique. Les mesures de flux pour un échantillon test à travers une monocouche de cellules Caco-2 impliquent généralement des méthodes chimiques, telles que HPLC, LC/MS, etc. Bien que ces méthodes soient des outils puissants, elles sont complexes, longues, coûteuses et parfois nécessitent un équipement sophistiqué. Plus important encore, ni une composante unique ni une composante minoritaire ne peuvent refléter l’EP dans son ensemble. Ainsi, une nouvelle approche indépendante de la détermination des constituants doit être établie pour identifier et évaluer les caractéristiques de transport du PE.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), une plante holoparasite, est une médecine traditionnelle chinoise courante principalement utilisée pour traiter l'insuffisance rénale, la faiblesse corporelle et la constipation, et ces utilisations ont été officiellement enregistrées dans la pharmacopée chinoise [6]. Glycosides phényléthanoïdes (PhG), notammentéchinacoside (EC), acteoside (AC) et isoacteoside(IS), etc., sont une classe de composés polyphénoliques [7]. Ils sont considérés comme l'un des principauxconstituants bioactifs de l'espèce Cistanche[8]. Des études pharmacologiques ont montré que la bioactivité des PhG est diversifiée et comprend des effets anti-oxydants [9], anti-fatigue [10], hépatoprotecteurs [11], immunomodulateurs [12], anti-inflammatoires [7, 13] et neuroprotecteurs [ 14]. Cependant, les caractéristiques du transport intestinal des PhG n’ont pas été étudiées. Dans cette étude, nous avons exploré lesperméabilité intestinale d'un extrait riche en PhG (PRE) de CDen tant que système intégré et la perméabilité de trois PhG majeurs (AC, IS et EC) dans les cellules Caco-2 différenciées. Nos résultats ont indiqué que le PRE est principalement transporté via une diffusion passive mal absorbée selon un gradient de concentration sans efflux, ce qui constitue la base pharmacocinétique de l'application clinique des PhG dans la MC.

HERBES NATURELLES DE CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Matériels et méthodes

Matériaux

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98 %) ont été achetés auprès de Must Biotechnology Co. (Chengdu, Chine). Le milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), le sérum fœtal bovin (FBS) et les acides aminés non essentiels (NEAA) ont été produits par Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). Des plaques 6-puits TranswellTM (insérer la zone de croissance de la membrane 4,67 cm2) ont été obtenues auprès de Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Le collagène de queue de rat a été obtenu auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Tous les réactifs et produits chimiques pour l’analyse HPLC étaient de qualité analytique.

Préparation du PRE à partir du CD

Le matériau CD séché à l'air a été réduit en poudre et extrait par percolation avec de l'éthanol à 70 %. La fraction riche en PhG a été préparée comme décrit précédemment [10] et extraite avec de l'alcool n-butylique saturé d'eau. La liqueur d'extrait a été concentrée et séchée sous pression réduite. La spectrophotométrie UV sur résine macroporeuse [15] a mesuré une teneur en PhG de 78,4 %. L'échantillon final représentait un rendement de 1,75 % en matière première en poids sec. L'échantillon obtenu a été conservé à -20 degrés jusqu'à une utilisation ultérieure.

Détermination de AC, IS et EC par HPLC

Un système HPLC Shimadzu équipé d'un logiciel de solution LC a été utilisé pour analyser le contenu de AC, IS et EC dans PRE. Une colonne Intersil C18 en phase inverse (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) a été utilisée et maintenue à température ambiante. Les phases mobiles étaient de l'acétonitrile et de l'eau contenant 0,1 % d'acide phosphorique (v/v) avec élution par gradient (tableau 1) à un débit de 1,0 ml/min. Le détecteur du spectrophotomètre UV a été réglé sur 334 nm. Pour déterminer avec précision le flux de AC et IS, nous avons développé une nouvelle méthode de détection par fluorescence HPLC (HPLC-FLD). Après une analyse structurelle et un balayage de la longueur d'onde de fluorescence (données non présentées), nous avons obtenu les conditions optimales de détection de fluorescence pour AC (Ex : 338 nm, Em : 448 nm) et IS (Ex : 320 nm, Em : 434 nm).

La méthode analytique HPLC a été validée en utilisant les caractéristiques de performance suivantes : stabilité, linéarité, sensibilité, précision (variabilité intra et interjournalière) et exactitude. Les analytes contenus dans le tampon de transport ont été stockés à 25 degrés dans l’obscurité pendant 24 h et leur stabilité a été mesurée. Les analytes étaient très stables en présence de vitamine C (0,4 %) car les valeurs d'écart type relatif (RSD) dans les zones de pic étaient < 3,5 %. L'équation de régression linéaire, le coefficient de corrélation, la plage de linéarité, la LOD et la LOQ pour AC, IS et EC sont présentés dans le tableau 2. Les LOD (18–30 nM) et les LOQ (60–100 nM) les valeurs illustrent que les méthodes HPLC-FLD et HPLC-UV sont très sensibles. Les valeurs RSD qui expriment la précision de la méthode étaient toutes < 2 % pour la variabilité intra et interjournalière, ce qui indique une bonne précision. Pour l'évaluation de la récupération, AC, IS et EC ont été ajoutés au tampon de transport pour obtenir trois niveaux de concentration (élevé, moyen et faible). Les valeurs de récupération de la méthode pour les analytes sont résumées dans le tableau 3. Les récupérations moyennes variaient de 90,0 % à 96,4 %, indiquant une bonne précision. En conclusion, les méthodes HPLC établies sont satisfaisantes en termes de linéarité, de sensibilité, de précision et d’exactitude pour la quantification de l’AC, de l’IS et de l’EC dans le tampon de transport.

EXTRAIT NATUREL DE CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Détermination du PRE par système de bioessai

Le bioessai (capacité antioxydante totale) était basé sur le test FRAP (pouvoir ferrique réducteur/antioxydant) que nous avons décrit précédemment [16] et validé en termes de linéarité et de précision (variabilité intra et inter-journalière). La linéarité de la méthode de test biologique a été déterminée sur la base des courbes d'étalonnage. La plage de concentrations de linéarité était de 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). La précision de la méthode de test biologique établie a été déterminée en termes de variabilité intra et interjournalière pour une analyse du PRE (10,0 ug/ml). La répétabilité intrajournalière de la méthode a été déterminée sur la base de cinq déterminations consécutives effectuées le même jour. La répétabilité interjournalière a été mesurée sur la base de cinq déterminations consécutives sur trois jours différents. Les valeurs RSD pour la précision de la méthode étaient respectivement de 1,014 % et 4,72 % pour la variabilité intra et interjournalière, ce qui indique une bonne précision. Ainsi, la méthode de test biologique établie est satisfaisante en termes de linéarité, de précision et d’exactitude pour la quantification du PRE dans un tampon de transport.

Culture de cellules

Les cellules Caco{{0}} ont été cultivées à 37 degrés et 95 % d'humidité relative dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 et un milieu composé de DMEM, 10 % de FBS, 1 % de NEAA, 1 % de L-glutamine et de pénicilline. (100 U/ml) et streptomycine (100 ug/ml). Le milieu a été changé tous les deux jours au cours de la croissance et de la différenciation cellulaire. Les cellules ont été cultivées dans des flacons en plastique de 75- cm2 et récoltées tous les 3 à 5 jours avec 0,05 % de trypsine EDTA. Pour les expériences de transport, les cellules ont été ensemencées à une densité de 1.105 cellules/cm2 sur des inserts Transwell recouverts de collagène. Environ 21 jours après l'ensemencement, les monocouches ont été utilisées pour les expériences de transport. Leur intégrité a été déterminée en mesurant la résistance électrique transépithéliale (TEER) à travers les monocouches avec un EVOM équipé d'ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). Les valeurs TEER de la monocouche de cellules Caco-2 devaient dépasser 500 O∙cm2.

Expériences de transport

La monocouche a été lavée avec un tampon de transport (tampon P contenant 1 0 mM de HEPES, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de glucose, 3 mM de CaCl2 et 145 mM de NaCl, pH 7,4), puis pré-incubée pendant 20 min. à 37 degrés. Après avoir retiré le tampon de transport, un nouveau tampon de transport contenant des échantillons de test a été ajouté à la chambre apicale (AP) (1,5 ml) dans les études directionnelles AP à basolatérales (BL) ou à la chambre BL (2,5 ml) dans les études directionnelles BL à AP. Pour les tests AC, IS et EC utilisant HPLC, une aliquote (300 ul) a été retirée de chaque chambre réceptrice à différents intervalles de temps (30, 60, 90 et 120 min). La chambre réceptrice a été remplie avec le même volume de tampon de transport frais préchauffé (37 degrés) après chaque échantillonnage. Les échantillons collectés ont été stockés à -20 degrés pour une utilisation ultérieure. Pour la détermination PRE à l’aide d’un essai biologique, seuls les échantillons à 120 min ont été prélevés. En raison de l'instabilité de PRE, AC, IS et EC, 0,4 % (p/v) de vitamine C a été

ajouté pour stabiliser les échantillons afin de déterminer les teneurs en AC, IS et EC par HPLC, et les échantillons pour le test biologique PRE ont été analysés immédiatement après avoir été échantillonnés. La valeur du coefficient de perméabilité apparente (Papp ou 'Papp) de chaque échantillon a été calculée.

L'analyse des données

Les valeurs de Papp dans les directions AP BL ou BLAP de AC, IS et EC ont été calculées sur la base de l'équation suivante : Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), où Papp est le coefficient de perméabilité apparente (cm/s) déterminé par HPLC. (4Q/4t) est la vitesse d'apparition du composé à tester (AC, IS ou EC) côté récepteur (µmol/s) ; A est la surface de l'insert (cm2 ) ; C0 est la concentration initiale du composé à tester du côté donneur (μmol/ml). Plus précisément, l'unité de masse « ug » a été utilisée à la place de « μmol » lors du calcul des valeurs 'Papp. Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± SD.

Résultats

Composition de AC, IS et EC dans PRE à partir de CD

Parce que AC, IS et EC sont considérés comme les principaux bioactifsPhG de l'espèce Cistanche[8], nous avons analysé leur contenu en PRE via HPLC-UV. Le chromatogramme représentatif est présenté sur la figure 1. L'identification de ces constituants était basée sur la comparaison des temps de rétention et du spectre UV avec ceux d'étalons authentiques à une longueur d'onde de 334 nm. Les teneurs en AC, IS et EC dans PRE étaient respectivement de 26,60 %, 1,84 % et 32,83 %. Ainsi, ces trois composés représentent 61,27% du PRE ; de plus, les résultats ci-dessus indiquent que la teneur en PhG dans PRE est de 78,4 %. Par conséquent, AC, IS et EC représentent environ 80 % des PhG dans PRE.

CISTANCHE TUBULOSA NATUREL POUR AMÉLIORER LA FONCTION RÉNALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Capacités antioxydantes totales de PRE, AC, IS et EC

Des études sur l'activité antioxydante des PhG provenant de la MC ont été rapportées [9], et AC, IS et EC représentent environ 80 % des PhG du PRE. Ainsi, les capacités antioxydantes totales de PRE, AC, IS et EC ont été testées et exprimées à l'aide des valeurs FRAP (× 10–6 mmol). Comme le montre la figure 2, lorsque la valeur FRAP était de 8 × 10–6 mmol, les concentrations finales de PRE, AC, IS et EC étaient de 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml et 4,89 ug/ml. /ml, respectivement, indiquant que la capacité antioxydante totale de ces quatre échantillons était classée comme suit : AC > EC > PRE > IS. La bioactivité du PRE est attribuée à ses groupes d'ingrédients actifs (AIG). Pour environ 60 % des PRE, AC et EC ont montré une activité antioxydante totale plus forte que PRE et IS. Étant donné que l'IS (1,84 %) constitue une très petite fraction du PRE, d'autres composants, tels que l'IS faiblement antioxydant, sont également clairement actifs dans le PRE. Étonnamment, l'activité antioxydante totale différait de près de 7- fois entre AC et son isomère IS, indiquant que non seulement le nombre de groupes hydroxyle phénoliques [9] mais également la position des groupes hydroxyle phénoliques dans la molécule affectaient l'activité antioxydante totale. effet antioxydant.

Validation des monocouches Caco-2

Pour valider le système de monocouches cellulaires Caco-2, les valeurs Papp du propranolol (un marqueur bien transporté) et du jaune Lucifer (un marqueur mal transporté) de l'AP au BL à travers les monocouches Caco-2 ont été déterminés à 1,51 × 10–5 cm/s et 2,8 × 10–7 cm/s, respectivement, et ces valeurs concordaient avec celles publiées dans les rapports précédents [17, 18]. Le test d'activité de la phosphatase alcaline a également confirmé que les monocouches de cellules Caco-2 étaient qualitativement comparables à l'épithélium de l'intestin grêle [19].

La perméabilité de AC, IS et EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), alors que ceux des médicaments mal absorbés étaient faibles (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2 [20]. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

La perméabilité du PRE

Les résultats ci-dessus indiquent que la capacité antioxydante totale du PRE est au moins due à 61,27 % d'AIG du PRE. Ainsi, nous avons évalué le TR du PRE sur la base de sa courbe concentration-effet de la capacité antioxydante totale et calculé les valeurs 'Papp pour refléter les caractéristiques de transport du PRE. Les valeurs 'Papp de PRE pour AP!BL et BL!AP étaient de (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s et (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, respectivement, indiquant que ce composé était peu perméable. De plus, l'efflux ou le transport actif n'était pas évident car le rapport 'Papp BL sur AP / 'Papp AP sur BL pour PRE était de 1,45 [20]. De plus, le TR bidirectionnel du PRE a augmenté de manière linéaire entre environ 300 et 900 ug/ml (Fig. 5). L'absence de préférence directionnelle des résultats suggère que la diffusion passive est le principal mécanisme de transport du PRE.

Discussion

Comparés aux produits pharmaceutiques hautement purifiés, les PE sont généralement des mélanges constitués de centaines de constituants aux propriétés physicochimiques très différentes. Par conséquent, les PE exercent une action synergique systématique, multicible et multicanal en raison de leur AIG complexe [21], ce qui entrave l'analyse des caractéristiques de transport des PE. Pour évaluer les propriétés de transport du PE de manière plus scientifique, certains chercheurs ont identifié plusieurs composants, plutôt qu'un seul, dans le PE [22-24]. Néanmoins, un nombre limité de constituants ne peut pas refléter l’ES dans son ensemble. Cependant, il est impossible de déterminer tous les composants du PE. De plus, si divers composants du PE présentent des caractéristiques de transport complètement différentes, les caractéristiques de transport holistiques du PE seront difficiles à identifier.

Dans les années 1990, des systèmes de bioessais ont été utilisés pour évaluer le TR des agents antimicrobiens [25]. En 2005, Eguchi et ses collègues [26] avaient évalué l'activité anti-oxydante de l'extrait de carotte en utilisant des milieux BL issus de cellules Caco-2 différenciées ; cette approche est plus appropriée pour refléter des situations in vivo.

Sur la base d'un précédent rapport sur l'activité des PhG [9] et de nos résultats (Fig. 2), le TR de l'AIG dans PRE peut être évalué en déterminant la capacité antioxydante totale du milieu dans la chambre réceptrice. Après les expériences de transport, nous avons constaté que le TR du PRE était similaire dans les deux sens, et que ce transport était insaturé et mal absorbé ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s) [3], et cela n'indiquait pas d'efflux, ce qui suggère que la diffusion passive selon un gradient de concentration est le principal mécanisme de transport du PRE (Fig. 5). De plus, les caractéristiques de transport du PRE sont cohérentes avec celles de AC, IS et EC, les composants efficaces qui présentent une activité antioxydante dans PRE (Fig. 4 et Tableau 4). Ce résultat était attendu et indique que le système de test biologique actuel est approprié et fiable pour l'évaluation des caractéristiques de transport de l'AIG dans PRE dans des cellules Caco -2 différenciées.

Contrairement à la valeur canonique de Papp, qui est couramment utilisée pour refléter le transport d'un seul composé, la valeur de 'Papp obtenue à partir du TR basée sur la courbe concentration-effet peut non seulement refléter les composants qui pénètrent dans des monocouches avec une structure intacte, mais aussi impliquent également d'autres facteurs liés à l'activité cible, tels que les métabolites des composants, les produits chimiquement dégradés et même certaines cytokines sécrétées par les cellules Caco-2 en réponse à une stimulation pouvant affecter la bioactivité cible. Ainsi, le multifacteur mentionné ci-dessus, plutôt que uniquement les composants intacts transportés, détermine la « valeur Papp ». Par conséquent, 'Papp peut être plus fortement corrélé aux situations in vivo que la valeur canonique de Papp [26]. Dans cette étude, nous avons clarifié la nature passivement diffusée et mal absorbée du PRE sur la base de sa valeur « Papp », et cette nature peut être liée au dosage élevé et à la longue période de traitement clinique de la MC [27]. Néanmoins, ces résultats fourniront des conseils plus systématiques aux cliniciens dans l'application de la CD lorsque seules les caractéristiques de transport de la plupart des AIG dans la CD, et non seulement des PhG, auront été identifiées.

EXTRAIT NATUREL DE CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cependant, l'élément de bioactivité sélectionné doit être suffisamment sensible pour être détecté dans le milieu de la chambre réceptrice, ce qui présente un défi pour la mise en place d'un système de bioessai permettant d'évaluer les caractéristiques de transport du PE. En outre, la bioactivité doit également dépendre du plus grand nombre possible de composants. Dans notre étude, le test de la capacité antioxydante totale était plus approprié que plusieurs autres méthodes (S1 Fig.). Mais même ainsi, notre test ne peut détecter le TR de PRE qu’à 120 min.

Collectivement, la présente étude a établi un nouveau système de test biologique pour évaluer la perméabilité intestinale du PRE dans des cellules Caco-2 différenciées. Les résultats obtenus ont montré qu'une diffusion passive mal absorbée selon un gradient de concentration sans efflux constitue le principal mécanisme de transport du PRE (Fig. 5), qui constitue la base pharmacocinétique de l'application clinique des PhG dans la MC. L'utilisation d'un nouveau système de dosage biologique pour évaluer le TR et ainsi calculer les valeurs de Papp pour évaluer lepropriété de transport intestinald’AIG dans les PE est réalisable. Cette approche peut également convenir à d’autres PE étant donné la bioactivité appropriée.