Expérience 3 Effet du glycoside de phényléthanol de Cistanche Deserticola sur le modèle de périménopause de rat Ⅲ

Expérience 3 Effet du glycoside de phényléthanol de Cistanche deserticola sur le modèle de périménopause de rat

1 Matériel expérimental

1.1 Animaux expérimentaux

Rats Wistar, qualité SPF, femelles, fournis par Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., numéro de certificat de rat pour ce lot : 0017216 ; numéro de certificat de laboratoire SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Médicaments expérimentaux

Cistanche deserticola phényléthanol glycosidea été préparé selon la méthode de l'expérience 1, et la teneur a atteint 66,47 %. Gengnian'an Capsule, ingrédients : Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, écorce de pivoine, Poria cocos, nacre, curculigo, Schisandra chinensis, magnétite, vigne Polygonum multiflorum, Uncaria, blé flottant, polygonum multiflorum . Fonctions et indications :Nourrir le yin et maîtriser le yang, soulager les ennuiset calmer l'esprit. Utilisé pour les bouffées de chaleur et la transpiration de la ménopause, les étourdissements, les acouphènes, l'irritabilité et l'insomnie. Spécifications : 0,3 g par capsule. Utilisation et posologie : Orale, 3 gélules à la fois, 3 fois par jour. Fabricant : Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Numéro de lot de production : 121104. Numéro d’approbation : National Drug Approval No. Z14021848.

Isoflavones de soja et capsules molles de vitamine E, liste des ingrédients : poudre d'isoflavones de soja, vitamine E, huile de tournesol, gélatine, glycérine, eau, tartrazine, dioxyde de titane. Ingrédients et contenu emblématiques : Chaque 100 g contient 55,2 mg d'isoflavones de soja (calculées en génistéine) et 608,5 mg de vitamine E. Fonctions pour la santé : Augmente la densité osseuse. Mode d'emploi et posologie : Prendre 1 gélule 2 fois par jour avec de l'eau tiède. Spécifications : 500 mg × 100 gélules. Fabricant : Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Numéro de lot de production : 13070302. Numéro d'approbation : National Food Health G20080032.

COMBIEN DE TEMPS FAUT-IL POUR CISTANCHE FONCTIONNE?

1.3 Réactifs expérimentaux

Carboxyméthylcellulose sodique, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., numéro de lot : 20120418 ; pénicilline sodique pour injection, North China Pharmaceutical Co., Ltd., spécification : 4 millions d'unités, numéro de lot de production : c1206807 ;

Solution de formaldéhyde (analytiquement pure), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., numéro de lot de production : 20130902 ; Injection de chlorure de sodium à 0,9 %, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd. ; spécification : 250 ml, numéro de lot de production : 13082405B ;

Hydrate de chloral, Institut de recherche en chimie fine de Tianjin Guangfu, numéro de lot 20120827 ; Kit de détection Rat E2 ELISA, R&D Company, numéro de lot : 20140101A ; Kit de détection Rat T ELISA, R&D Company, numéro de lot : 20140101A ; Kit de détection ELISA LH pour rat, société R&D, numéro de lot : 20140101A ; Kit de détection FSH ELISA pour rat, société R&D, numéro de lot : 20140101A ;

2 Méthodes expérimentales

2.1 Modélisation et administration de médicaments

Méthode de modélisation : prenez 100 rats Wistar femelles pesant 210 à 230 g, sélectionnez au hasard 12 rats comme groupe vierge et subissez une opération chirurgicale fictive, et les rats restants seront utilisés pour créer la ménopause. des modèles. Après avoir pesé les rats, ils ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de 10 % d'hydrate de chloral (0,3 ml/100 g) et la position abdominale a été fixée. Ensuite, les rats ont été parés sous la dernière côte du dos à l'intersection de la ligne médio-axillaire et à environ 2 cm du côté latéral de la colonne vertébrale, puis désinfectés. La peau et les muscles du dos sont incisés d'environ 1 cm, et une masse grasse brillante d'un blanc laiteux peut être vue dans le champ de vision de l'incision, et l'ovaire y est incrusté. Utilisez une petite pince à épiler pour saisir doucement la masse grasse et la retirer de l'incision, séparez la masse grasse et vous verrez un groupe d'ovaires fins, irréguliers, jaune-rouge. Lors de la coupe, ligaturez d'abord la trompe de Fallope (y compris la graisse) sous l'ovaire avec un fil fin, retirez complètement l'ovaire gauche et retirez 80 % de l'ovaire droit. Après l'opération, les cornes utérines ont été replacées dans la cavité abdominale, les muscles et la peau ont été suturés et les deux ovaires ont été retirés de la même manière. Après l'opération, les animaux ont été soigneusement élevés et ont reçu une injection intramusculaire de 200,000 u/kg de pénicilline (0,1 ml chacun) pour prévenir l'infection, une fois par jour pendant 3 jours consécutifs. 5 jours après l'opération, l'examen des frottis vaginaux des rats a été commencé un par un, une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Les rats présentant des réactions œstrales dans le frottis ont été écartés. 72 rats complètement castrés ont été sélectionnés et répartis au hasard en 6 groupes. À des fins expérimentales, il s'agit du groupe modèle, du groupe Gengnianan, du groupe des isoflavones de soja et du groupe glycoside de phényléthanol Cistanche deserticola à grandes, moyennes et petites doses.

Méthode de préparation : Méthode de préparation : {{0}},5 % CMC Méthode de préparation : Pesez 4 g de carboxyméthylcellulose sodique et mélangez-la avec de l'eau distillée pour obtenir 800 ml. Les doses de grandes, moyennes et petites doses du groupe phényléthanol glycoside Cistanche deserticola étaient respectivement de 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg et 33,33 mg/kg (volume d'administration 1 ml/100 g). Mode de préparation : Peser respectivement 1333,3 mg, 666,7 mg et 333,3 mg de flavonoïdes totaux de framboise, les dissoudre avec une petite quantité de CMC à 0,5 %, puis ajuster le volume à 100 ml, bien mélanger, et c'est tout. Capsules de Gengniangan (450 mg/kg, mélangées à de l'eau distillée à 45 mg/ml, 1 ml/100 g, équivalent à 10 fois la dose clinique) ; Méthode de préparation : Prenez 15 gélules de Gengniangan, dissolvez-les d'abord avec une petite quantité de 0,5 % de CMC, puis ajustez le volume à 100 ml et mélangez bien, ce qui correspond à la dose de suspension de gélule de Gengnianan (450 mg/kg). Capsules molles de vitamine E d'isoflavone de soja (166,67 mg/kg, utiliser de l'eau distillée pour préparer 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, équivalent à 10 fois la dose clinique) ; Méthode de préparation : Prendre 4 capsules molles de vitamine E d'isoflavones de soja, dissoudre d'abord avec une petite quantité de 0,5 % de CMC, puis ajuster le volume à 120 ml et bien mélanger pour obtenir la dose de suspension de capsule molle d'isoflavones de soja vitamine E (16,67 mg/kg ).

Mode d'administration : Les animaux de chaque groupe ont reçu les médicaments correspondants le 10ème jour après l'opération. Le groupe blanc et le groupe modèle ont été gavés avec le même volume de solution de CMC à 0,5 % (le volume de gavage était de 1 ml/100 g), et le groupe Gengnianan a été gavé avec une suspension de capsules de Gengnianan (450 mg/kg, équivalent à 10 fois la dose clinique). ). ), le groupe isoflavone de soja a reçu par voie orale une suspension de capsule molle d'isoflavone de soja et de vitamine E (166,67 mg/kg, équivalent à 10 fois la dose clinique), et les doses forte, moyenne et faibleCistanche deserticola phényléthanol glycosideles groupes ont été administrés par voie orale en fonction du groupe. Doses grandes, moyennes et petites de phényléthanol glycoside de Cistanche deserticola (les dosages sont respectivement de 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg et 33,33 mg/kg, le volume de dosage est de 1 ml/100 g), administrées une fois par jour par administration intragastrique, en continu. . médicament pendant 30 jours.

2.2 Éléments d'observation et méthodes de détection

Les scores de mouvement horizontal-vertical des rats de chaque groupe ont été mesurés 29 jours après l'administration. 2 heures après la dernière administration gastrique (à jeun pendant 15 heures), retirer les globes oculaires pour recueillir le sang, séparer le sérum etplasma, et mesurer la teneur en E2, T, LH, FSH, GnRH et BGP dans le sérum, ainsi que la teneur en -EP dans le plasma ; les rats ont été disséqués. Retirez le thymus, la rate, l'utérus et les 20 % restants du tissu ovarien, pesez leurs poids humides et calculez l'indice d'organe du thymus, de la rate et de l'utérus (indice d'organe=poids humide de l'organe mg/poids du rat g) , puis retirer le cerveau Pour l'hypothalamus et l'hypophyse, des homogénats de tissus ont été préparés à partir de l'hypothalamus, de l'hypophyse et de la moitié de l'utérus, ainsi que du contenu des récepteurs d'œstrogènes dans l'hypothalamus, l'hypophyse et les homogénats de tissus utérins et les androgènes La teneur en récepteurs dans les homogénats de tissus hypothalamiques a été déterminée. Le thymus, la rate, l'utérus et l'ovaire ont été fixés dans une solution de formaldéhyde à 10 %, inclus dans de la paraffine, sectionnés et colorés à l'HE. Lechangements histomorphologiquesdans chaque groupe ont été observés au microscope optique.

2.2.1 Test de méthode en champ ouvert

Le dispositif expérimental est une boîte cubique ouverte d'une hauteur de 40 cm et d'une longueur et d'une largeur de 80 cm. Les murs environnants et le fond sont noirs. Le fond est composé de 25 blocs de superficie égale, divisés par des lignes blanches. Au cours de l'expérience, le rat a été placé dans le carré au centre de la boîte ouverte, et le score d'activité horizontale du nombre de blocs que le rat a traversés au fond en 5 minutes (les carrés avec les quatre pattes entrées peuvent être comptés), et le nombre de fois où les membres postérieurs se sont tenus debout (deux pattes avant étaient en l'air). (ou accroché à un mur) score d’activité verticale. Les matières fécales doivent être complètement éliminées après chaque expérience et chaque rat est mesuré une fois 2 heures après l'administration. Cette expérience a été menée dans une pièce calme.

2.2.2 Méthode de détermination des kits

Obtenir des échantillons de sérum : utiliser des tubes à essai exempts de pyrogènes et d'endotoxines. Évitez toute stimulation cellulaire pendant l’opération. Après avoir collecté le sang, centrifugez-le à 3 000 tr/min pendant 10 minutes pour séparer rapidement et soigneusement le sérum et les globules rouges. Prélever des échantillons de plasma : anticoagulés avec des tubes anticoagulants à l'héparine. Centrifuger à 3000 tr/min pendant 30 minutes et prélever le surnageant. Obtenir des échantillons d'homogénéisation de tissus : ajouter une quantité appropriée de solution saline physiologique au tissu et l'écraser. Centrifuger à 3000 tr/min pendant 10 minutes et prélever le surnageant.

La méthode de détermination du kit ELISA d'estradiol (E2) de rat (Rat) est la même que celle de l'expérience 2. Les concentrations d'étalons (S0-S5) sont 0, 4, 8, 16, 32 et 64 pmol/L.

La méthode de dosage du kit ELISA Testostérone (T) de rat (Rat) est la même que la méthode de dosage du kit ELISA Estradiol. Les concentrations d'étalons (S{{0}}S5) sont {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 et 320 pg /ml. La méthode de détermination du kit de détection ELISA de l'hormone lutéinisante (LH) de rat (Rat) est la même que la méthode de détermination du kit de détection ELISA d'estradiol. Les concentrations des standards (S0-S5) sont de 0, 3, 6, 12, 24 et 48 ml/ml. La méthode de dosage du kit ELISA d'hormone folliculo-stimulante (FSH) de rat (Rat) est la même que la méthode de dosage du kit ELISA d'estradiol. Les concentrations des standards (S0-S5) sont de 0, 0,75, 1,5, 3, 6 et 12 UI/L. La méthode de détermination du kit de détection ELISA de la gonadolibérine (GnRH) de rat (Rat) est la même que la méthode de détermination du kit de détection ELISA d'estradiol. Les concentrations d'étalons (S0-S5) sont de 0, 5, 10, 20, 40 et 80 mlU/ml.

La méthode de détermination du kit de détection ELISA de l'ostéocalcine (BGP/OCN) de rat (Rat) est la même que la méthode de détermination du kit de détection ELISA de l'estradiol. Les concentrations des standards (S{{0}}S5) sont 0, 0,75, 1,5, 3, 6 et 12 ng/ml. La méthode de détermination du kit de détection ELISA de rat (Rat) -endorphine (-EP) est la même que la méthode de détermination du kit de détection ELISA d'estradiol. Les concentrations d'étalons (S0-S5) sont 0, 3, 6, 12, 24 et 48 pg/mL. La méthode de détermination du kit de détection ELISA du récepteur des œstrogènes (ER) de rat (Rat) est la même que la méthode de détermination du kit de détection ELISA de l'estradiol. Les concentrations d'étalons (S{{20}}S5) sont de 0, 4, 8, 16, 32 et 64 pg/mL. La méthode de détermination du kit de détection ELISA des récepteurs androgènes (AR) de rat (Rat) est la même que la méthode de détermination du kit de détection ELISA d'estradiol. Les concentrations d'étalons (S0-S5) sont de 0, 25, 50, 100, 200 et 400 pg/mL.

2.3 Méthodes de traitement statistique

Pour l'analyse des données, le progiciel de statistiques médicales SPSS17.0 a été utilisé pour le traitement statistique des données. Les données de mesure ont été exprimées en moyenne ± écart type (-x ± s). Une analyse de variance unidirectionnelle a été utilisée pour la comparaison entre les groupes. La méthode LSD a été utilisée pour tester l’homogénéité des variances. , le test de Games-Howell a été utilisé pour les variances inégales et le test de Ridit pour les données de notes.

Il ressort du tableau 11 et de la figure 14 que, par rapport au groupe vierge, l'indice thymus, l'indice splénique et l'indice utérin des rats du groupe modèle ont été significativement diminués (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Effets sur les niveaux d'indice biochimique sanguin chez les rats modèles en périménopause

Les contenus sériques en E2, T, LH, FSH, GnRH et BGP et les contenus plasmatiques en EP des rats de chaque groupe sont présentés dans les tableaux 12 à 13 et les figures 15 à 17.

Il ressort des tableaux 12 à 13 et des figures 15 à 18 que, par rapport au groupe témoin, les taux sériques d'E2 et de T des rats du groupe modèle ont été significativement diminués (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tableau 14 Effet du phényléthanol glycoside de Cistanche deserticola sur les taux sériques de GnRH et de -EP plasmatique dans un modèle de périménopause de rat (-x ± s)

Il ressort du tableau 14 et des figures 19-20 que, par rapport au groupe vierge, le taux sérique de GnRH des rats du groupe modèle a été significativement augmenté et le taux plasmatique de -EP a été significativement diminué (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Effets sur les contenus ER et AR dans les tissus de rats modèles en périménopause

Les contenus en ER et AR dans les tissus pertinents des rats de chaque groupe sont présentés dans les tableaux 16 à 17 et les figures 22 à 23.

Il ressort du tableau 17 et de la figure 23 que, par rapport au groupe vierge, le niveau d'AR dans l'hypothalamus du groupe modèle était significativement inférieur (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Effets sur la morphologie des tissus organiques chez les rats modèles en périménopause

Les résultats d'observation pathologique et histologique de l'utérus, du thymus et de la rate des rats dans chaque groupe expérimental sont les suivants. Les photos pathologiques sont présentées en annexe 1 pour les photos pathologiques de rats modèles en périménopause.

5.1 Effet sur la morphologie du tissu utérin chez le rat modèle périménopausique

Selon les différents degrés de modifications de l'endomètre, des glandes et du myomètre des rats de chaque groupe expérimental, des normes semi-quantitatives ont été utilisées pour diviser la morphologie des tissus pathologiques en quatre niveaux, et les utérus des rats de chaque groupe expérimental ont été mesuré. Les résultats des observations sont présentés dans le tableau 18.

"-" Les cellules épithéliales de l'endomètre, les glandes, le myomètre et la séreuse sont tous normaux ; "+" les cellules épithéliales et les glandes de l'endomètre sont atrophiées, et le myomètre et la séreuse sont normaux ; "++" l'épithélium endométrial Les cellules et les glandes sont partiellement atrophiées, la couche musculaire est légèrement atrophiée et la séreuse est normale ; Les cellules et glandes épithéliales de l'endomètre "+++" sont considérablement atrophiées et la séreuse est normale.

Après le test de Ridit, il ressort du tableau 18 que, par rapport au groupe vierge, l'utérus des rats du groupe modèle présentait des lésions tissulaires pathologiques significatives (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Effet sur la morphologie du tissu ovarien chez les rats modèles en périménopause

Selon les différents degrés de modifications des follicules, du corps jaune, des cellules de la granulosa et des vaisseaux sanguins dans les ovaires des rats dans chaque groupe d'expériences, des normes semi-quantitatives ont été utilisées pour diviser la morphologie des tissus pathologiques en quatre niveaux. Les ovaires des rats de chaque groupe d'expériences ont été mesurés et observés. Les résultats sont présentés dans le tableau 19.

Tableau 19 Effet du phényléthanol glycoside de Cistanche deserticola sur les modifications pathologiques ovariennes chez des rats modèles en périménopause Unité : uniquement

"-" peut montrer les follicules en croissance, les follicules matures et le corps jaune à tous les niveaux. Le corps jaune est bien développé, avec de nombreuses couches de cellules de la granulosa, un liquide folliculaire riche et des vaisseaux sanguins riches ; "+" peut montrer des follicules en croissance, des follicules matures et du corps jaune, mais le nombre de follicules matures et de corps jaune est faible. , les follicules sont plus petits et les cellules de la granulosa sont moins stratifiées ; "++" peut montrer des follicules matures et le corps jaune, avec plus de corps jaune, moins de cellules de la granulosa et moins de vaisseaux sanguins ; "+++" n'a pas de follicules, plus de corps jaune et l'ovaire atrophique, avasculaire.

Après le test de Ridit, il ressort du tableau 19 que, par rapport au groupe témoin, les ovaires des rats du groupe modèle présentaient des lésions tissulaires pathologiques significatives (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Effets sur la morphologie des tissus du thymus et de la rate chez des rats modèles en périménopause

À l'aide d'un micromètre, mesurez l'épaisseur des parties les plus épaisses et les plus étroites du cortex thymique de chaque rat de chaque groupe expérimental pour obtenir la moyenne ; utilisez la ligne de base du micromètre pour tomber sur les nodules spléniques, mesurez l'épaisseur des nodules spléniques des deux côtés. avec l'artère centrale comme centre et calculez la moyenne. Les résultats mesurés sont présentés dans le tableau 20 et la figure 24.

Il ressort du tableau 20 et de la figure 24 que, par rapport au groupe témoin, l'épaisseur du cortex thymus et le volume des nodules spléniques dans le groupe modèle ont été significativement réduits (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).