Expérience 4 Effet du glycoside de phényléthanol de Cistanche Deserticola sur le modèle de dépression du syndrome périménopausique de la souris, matériaux et méthodes 1 Matériel expérimental

1.1 Animaux expérimentaux

Souris de qualité SPF, race Kunming, femelle, 18 ~ 22 g, fournie par Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., numéro de certificat de ce lot de souris : 0016003 ; numéro de certificat de laboratoire SYXK (Yu) 2010-001. 1.2 Médicaments expérimentaux

Cistanche phényléthanol glycosidea été préparé selon la méthode de l'expérience 1, et la teneur a atteint 66,47 %. Gengnian'an Capsule, ingrédients : Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, écorce de pivoine, Poria cocos, nacre, curculigo, Schisandra chinensis, magnétite, vigne Polygonum multiflorum, Uncaria, blé flottant, polygonum multiflorum . Fonctions et indications :Nourrir le yin et maîtriser le yang, soulager les ennuisetcalmer l'esprit. Utilisé pour les bouffées de chaleur et la transpiration de la ménopause, les étourdissements, les acouphènes, l'irritabilité et l'insomnie. Spécifications : 0,3 g par capsule. Utilisation et posologie : Orale, 3 gélules à la fois, 3 fois par jour. Fabricant : Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Numéro de lot de production : 121104. Numéro d’approbation : National Drug Approval No. Z14021848.

COMBIEN DE TEMPS FAUT-IL POUR CISTANCHE FONCTIONNE?

Isoflavones de soja et capsules molles de vitamine E, liste des ingrédients : poudre d'isoflavones de soja, vitamine E, huile de tournesol, gélatine, glycérine, eau, tartrazine, dioxyde de titane. Ingrédients et contenu emblématiques : Chaque 100 g contient 55,2 mg d'isoflavones de soja (calculées en génistéine) et 608,5 mg de vitamine E. Fonctions pour la santé : Augmente la densité osseuse. Mode d'emploi et posologie : Prendre 1 gélule 2 fois par jour avec de l'eau tiède. Spécifications : 500 mg × 100 gélules. Fabricant : Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Numéro de lot de production : 13070302. Numéro d'approbation : Guoshijianzi G20080032. 1.3 Réactifs expérimentaux

Carboxyméthylcellulose de sodium, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., numéro de lot : 20120418 ; pénicilline sodique pour injection, North China Pharmaceutical Co., Ltd., spécification : 4 millions d'unités, numéro de lot de production : c1206807 ; solution de formaldéhyde (qualité analytique), Yantai City Shuangshuang Chemical Co., Ltd., numéro de lot de production : 20130902 ; Injection de chlorure de sodium à 0,9 %, Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd. ; spécification : 250 ml, numéro de lot de production : 1301265303 ;

Hydrate de chloral, Institut de recherche en chimie fine de Tianjin Guangfu, numéro de lot 20120827 ; kit de détection E2 ELISA pour souris, société R&D, numéro de lot : 20140101A ; kit de détection T ELISA pour souris, société R&D, numéro de lot : 20140101A ; Kit de détection ELISA LH pour souris, société R&D, numéro de lot : 20140101A ; Kit de détection FSH ELISA pour souris, société R&D, numéro de lot : 20140101A ;

Kit de détection DA ELISA pour souris, société R&D, numéro de lot : 20140101A ; Kit de détection 5-HT ELISA souris, société R&D, numéro de lot : 20140101A. 1.4 Instruments expérimentaux

Balance électronique, Shanghai Minqiao Medical Instrument Co., Ltd., modèle : JY601 ; balance analytique électronique, société Ohaus (Shanghai), modèle : AR1140/C ; centrifugeuse de bureau à grande vitesse, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, modèle : TGL-168 ; Bain-marie thermostatique électrique, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd., modèle : HWS12 ; Testeur d'activité autonome de souris, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., modèle : ZZ-6 ; Appareil de mesure d'évitement de l'obscurité pour souris, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., modèle : BA-200 ; testeur de suspension arrière, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., modèle : TS-200 ; centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse, succursale Zhongjia de HKUST Innovation Co., Ltd., modèle : KDC-160HR ; instrument de pipetage réglable, Shanghai Leibo Analytical Instrument Co., Ltd.;

Lecteur de microplaques, American BIO-RAD Company, modèle : 680 ;

Microscope électrique, société japonaise OLYMPUS, modèle : BX61.

2 Méthodes expérimentales

2.1 Modélisation et administration de médicaments

90 souris Kunming femelles d'un poids corporel de 23-25 g ont été sélectionnées, et 10 ont été sélectionnées au hasard comme groupe vierge et ont subi une chirurgie fictive, et les souris restantes ont été utilisées pour créer modèles de périménopause. Après pesée, les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de 10% d'hydrate de chloral (0,03 ml/10 g) et la position abdominale a été fixée. Ensuite, les poils ont été coupés du dos de la souris sous la dernière côte, à l'intersection de la ligne médio-axillaire et à environ 1 cm de l'extérieur de la colonne vertébrale, puis incisés après désinfection. La peau et les muscles du dos mesurent environ 0,5-1 cm de large. Une masse grasse brillante, d'un blanc laiteux, est visible dans le champ d'incision et l'ovaire y est incrusté. Utilisez une petite pince à épiler pour saisir doucement la masse grasse et la retirer de l'incision, séparez la masse grasse et vous verrez un groupe d'ovaires fins, irréguliers, jaune-rouge. Lors de l'incision, ligaturez d'abord les trompes de Fallope (y compris la graisse) sous les ovaires avec des fils fins, puis retirez les ovaires. Après l'opération, les cornes utérines sont réinsérées dans la cavité abdominale, les muscles et la peau sont suturés et les deux ovaires sont retirés de la même manière. Après l'opération, les animaux ont été soigneusement élevés et de la pénicilline à raison de 200 000 u/kg (0,1 mL chacune) a été injectée par voie intramusculaire pour prévenir l'infection pendant 3 jours consécutifs, une fois par jour. 5 jours après l'opération, un frottis vaginal a été réalisé sur chaque souris une à une, une fois par jour pendant 5 jours consécutifs afin de déterminer si les ovaires étaient complètement retirés. Les souris présentant une réaction œstrale dans le frottis ont été écartées et 60 souris complètement castrées ont été divisées de manière aléatoire et égale en 6 groupes à des fins expérimentales, à savoir le groupe modèle, le groupe Mengnianan, le groupe isoflavone de soja, grand, moyen etGroupe glycoside phényléthanol Cistanche à faible dose. Les animaux de chaque groupe ont reçu les médicaments correspondants le 10ème jour après l'opération. Après 6 jours d'administration, les souris du groupe vierge ont été élevées à raison de 5 par cage, avec de la nourriture et de l'eau normales, sans aucune stimulation. Les 6 groupes modèles ont tous été élevés avec 1 souris par cage et ont reçu différentes stimulations au hasard chaque jour. Sept facteurs de stress ont été appliqués de manière aléatoire sur une période de 18 jours : litière humide (1 g de litière/1 ml d'eau) ; nager dans de l'eau glacée (4 degrés, 5 min) ; stress thermique (45 degrés, 5 min) ; éclairage nocturne (24h); serrage de la queue (1 min) ; privation d'eau (24 h) ; jeûne (24h). Un stimulus était donné au hasard chaque jour, et chaque stimulus ne pouvait pas apparaître en continu pendant 18 jours.

Méthode de préparation : 0,5 % CMC Méthode de préparation : Pesez 4 g de carboxyméthylcellulose sodique et mélangez-la avec de l'eau distillée pour obtenir 800 ml.

Les doses de grandes, moyennes et petites doses du groupe Cistanche phényléthanol glycoside étaient de 200 mg/kg, 10{{20}} mg/kg et 50 mg/kg respectivement (volume d'administration 0,1 ml/10 g). Méthode de préparation : Peser respectivement 2000 mg, 1000 mg et 500 mg de glycoside phényléthanoïde Cistanche, les dissoudre avec une petite quantité de CMC à 0,5 %, puis ajuster le volume à 100 ml, bien mélanger, et c'est tout. Capsules de Gengniangan (675 mg/kg, mélangées à de l'eau distillée à 67,5 mg/ml, 0,1 ml/10 g, équivalent à 15 fois la dose clinique) ; méthode de préparation : prenez 9 gélules de Gengniangan, utilisez d'abord une petite quantité de CMC Dissolve à 0,5 %, puis ajustez le volume à 40 ml et mélangez bien pour obtenir la dose de suspension de gélule de Gengnianan (675 mg/kg). Capsule molle de vitamine E d'isoflavone de soja (250 mg/kg, utiliser de l'eau distillée pour préparer 25 mg/ml, 0,1 ml/10 g, équivalent à 15 fois la dose clinique) ; Méthode de préparation : Prendre 2 capsules molles de vitamine E d'isoflavone de soja, utilisez-les d'abord. Dissoudre une petite quantité de 0,5 % de CMC, puis ajuster le volume à 40 ml et bien mélanger pour obtenir la dose de suspension de capsule molle d'isoflavone de soja vitamine E (250 mg/kg). ). Mode de conservation : réfrigérer, garder au chaud pendant l'utilisation.

Mode d'administration : Les animaux de chaque groupe ont reçu les médicaments correspondants le 10ème jour après l'intervention chirurgicale. Le groupe Gengnian'an a reçu par voie orale une suspension de capsule de Gengnian'an à raison de 675 mg·kg-1, le groupe d'isoflavones de soja a reçu par voie orale 250 mg·kg-1 de suspension de capsule molle d'isoflavone de soja et de vitamine E, et de grandes, moyen etpetites doses de Cistanchephényléthanol. Le groupe glycoside a reçu par voie orale des doses importantes, moyennes et petites de glycoside de phényléthanol Cistanche 200mg·kg-1, 10 mg·kg-1, 50 mg·kg{{ 5}}, 0,1 ml/10 g respectivement. Le groupe blanc et le groupe modèle ont été gavés avec le même volume de solution de CMC à 0,5 % une fois par jour pendant 30 jours consécutifs.

2.2 Éléments d'observation et méthodes de détection

Natation forcée : le premier jour après la fin de la stimulation par le stress chronique, le temps d'immobilité des souris de chaque groupe dans les 6 minutes a été mesuré pendant 2-6 minutes. (Mettez les souris de chaque groupe dans un bécher de 2 000 ml. La température de l'eau est de 25 degrés. En plus du mouvement minimum nécessaire pour maintenir la flottaison, les membres des animaux cessent de bouger et sont enregistrés comme immobiles. Enregistrez le temps d'immobilité totale de 2 à 6 minutes en 6 minutes.) Test d'activité volontaire : Le deuxième jour après la fin de la stimulation par stress chronique, le nombre d'activités spontanées des souris dans chaque groupe en 5 minutes a été mesuré.

Méthode d'évitement de l'obscurité : le 3ème jour après la fin de la stimulation du stress chronique, placez la queue de la souris dans la boîte de mesure face à la petite ouverture de la chambre noire et effectuez un entraînement. Après 24 heures, mesurez à nouveau la latence de la souris entrant dans la chambre noire pour la première fois et le temps nécessaire pour entrer dans la chambre noire dans les 5 minutes. Nombre de chocs électriques.

Test de suspension de la queue : Le 5ème jour après la fin de la stimulation par stress chronique, le temps d'immobilité des souris de chaque groupe dans les 6 minutes a été mesuré pendant 2-6 minutes.

2 heures après la dernière dose (12 heures sans nourriture ni eau), les souris ont été pesées, les globes oculaires ont été retirés, le sang a été prélevé, le sérum a été séparé et les contenus en E2, T, LH et FSH du sérum ont été mesuré; les souris ont ensuite été tuées par luxation des vertèbres cervicales et les souris ont été disséquées. , retirez le thymus, la rate et le tissu utérin, pesez leur poids humide et calculez l'indice d'organe (indice d'organe=poids humide de l'organe mg/poids de la souris g), puis retirez le cerveau, coupez-en la moitié et préparez le cerveau homogénat de tissus. Un test immunoenzymatique a été utilisé pour déterminer la teneur en neurotransmetteurs monoamines 5- HT et DA dans l'homogénat de tissu cérébral. Les tissus du thymus, de la rate, de l'utérus et du cerveau ont été fixés dans une solution de formaldéhyde à 10 %, inclus dans de la paraffine, sectionnés et colorés à l'HE. Les changements morphologiques de chaque groupe ont été observés au microscope optique. 2.3 Méthode de détermination des kits

Obtenir des échantillons de sérum : utiliser des tubes à essai exempts de pyrogènes et d'endotoxines. Évitez toute stimulation cellulaire pendant l’opération. Après avoir collecté le sang, centrifugez-le à 3 000 tr/min pendant 10 minutes pour séparer rapidement et soigneusement le sérum et les globules rouges. Obtenir des échantillons d'homogénéisation de tissus : ajouter une quantité appropriée de solution saline physiologique au tissu et l'écraser. Centrifuger à 3000 tr/min pendant 10 minutes et prélever le surnageant.

La méthode de détermination du kit ELISA d'estradiol (E2) de souris (Souris) est la même que celle de l'expérience 2. Les concentrations de produits standards (S0-55) sont : 0, 4, 8, 16, 32 , et 64 pmol/L.

La méthode de détermination du kit ELISA Testostérone (T) de souris est la même que celle de l’Estradiol (E2). Les concentrations de produits standards (S0-55) sont : 0, 50, 100, 200, 400, 800pg/mL.

La méthode de détermination du kit ELISA de l'hormone folliculo-stimulante (FSH) de souris est la même que celle de l'estradiol (E2). Les concentrations de produits standards (S0-55) sont : 0, 5, 10, 20, 40 et 8{{30} }mUI/mL. La méthode de détermination du kit ELISA de l'hormone lutéinisante (LH) de souris (Souris) est la même que celle de l'estradiol (E2). Les concentrations de l'étalon (S0-55) sont : 0, 0,5, 1, 2, 4 et 8 mUI/mL. La méthode de détermination du kit ELISA 5-hydroxytryptamine (5-HT) de souris est la même que celle de l'estradiol (E2). Les concentrations des produits standards (S0-55) sont : 0, 15, 30, 60, 120, 240ng/ml. La méthode de détermination du kit de détection ELISA de la dopamine (DA) de souris (Souris) est la même que celle de l'estradiol (E2). Les concentrations des produits standards (S0-55) sont : 0, 7,5, 15, 30, 60 et 120pg/ml.

Il ressort du tableau 21 et de la figure 25 que, par rapport au groupe vierge, le temps d'immobilité des souris du groupe modèle a augmenté de manière significative dans les expériences de nage forcée et de suspension de la queue (P<0.01), indicating that perimenopausal model mice with depression Increased levels of despair about adverse circumstances. Compared with the model group, the forced swimming immobility time and tail suspension immobility time of mice in each drug group were significantly reduced (P<0.01).

2 Effets sur les activités autonomes chez les souris modèles de dépression périménopausique

Les résultats du test d'activité autonome des souris dans chaque groupe expérimental sont présentés dans le tableau 22 et la figure 26.

Il ressort du tableau 23 et des figures 27 et 28 que, par rapport au groupe vierge, la période de latence des souris du groupe modèle a été considérablement réduite et le nombre de chocs électriques a été significativement augmenté (P<0.01), reflecting the decline in memory of the perimenopausal depression model mice. . Compared with the model group, the number of electric shocks received by mice in each administration group was significantly reduced (P<0.01), and the latency of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Mengnianan group, and soybean isoflavones group was significantly reduced (P<0.01). extension (P<0.01). The latent period of mice in the medium and small doses of Cistanche phenylethanoid glycoside group was significantly prolonged (P<0.05).

4 Effets sur l'indice d'organe chez les souris modèles de dépression périménopausique

Il ressort du tableau 24 et de la figure 29 que, par rapport au groupe vierge, l'indice thymus, l'indice splénique et l'indice utérin du groupe modèle ont été significativement réduits (P<0.01), indicating that the perimenopausal depression mouse model had thymus, spleen, and uterus index. Shrinkage of the organization. Compared with the model group, the thymus index, spleen index, and uterine index of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group could be significantly increased (P<0.01). The medium-dose Cistanche phényléthanol glycosidegroupe L'indice thymus et l'indice utérin des souris peuvent être significativement augmentés (P<0.01), and the spleen index can be significantly increased (P<0.05).