Schéma d'expression de la tubuline, de l'inversine et de sa cible échevelée -1 et morphologie des cils primaires dans le développement et les maladies normales du rein humain

edmund.chen@wecistanche.com

Résumé:L'expression spatio-temporelle des protéines -tubuline, d'inversion et échevelée-1 (DVL-1) associées à la voie de signalisation Wnt et la morphologie primaire des cils ont été analysées dans le développementreins(14e à 38e semaines de développement), postnatal en bonne santé (1,5- et 7- ans) et humain pathologiquement modifiéreins,dont dysplasie multikystiquereins(MCDK), la glomérulosclérose segmentaire focale (FSGS) et le syndrome néphrotique de type finlandais (CNF). L'analyse a été réalisée par double immunofluorescence, microscopie électronique, méthodes semi-quantitatives et statistiques. La co-expression cytoplasmique de -tubuline, d'inversion et de DVL-1 a été observée dans les tubules contournés proximaux (pct), les tubules contournés distaux (dct) et les glomérules (g) des tissus analysés. Durantun reindéveloppement, l'expression globale de -tubuline, d'inversion et de DVL -1 a diminué, tandis que dans la période postnatale a légèrement augmenté. Les expressions les plus élevées de -tubuline et d'inversion caractérisaient dct et g, tandis que le DVL élevé -1 caractérisait pct. -tubuline, inversion et modèles d'expression DVL-1 dans MCDK, FSGS et CNFreinsdifférait significativement du témoin sain. Par rapport à sainreins, pathologiquement modifiéreinsavaient des cils primaires dysmorphiques. Différentes dynamiques d'expression de -tubuline, d'inversion et de DVL-1 pendantun reinle développement pourrait indiquer que le basculement entre la signalisation Wnt canonique et non canonique est essentiel pour la normaleun reinmorphogenèse. En revanche, leur expression perturbée dans les pathologiesreinspourrait être associée à des cils primaires anormaux, entraînant unemaladies rénales.

Mots clés:développement du rein humain; -tubuline; inverser; LDV-1 ; MCDK ; FSGS ; CNF; rein, rénal

CISTANCHE AMÉLIORERA LES MALADIES RÉNALES/RÉNALES

Introduction 

Le développement du définitif ou métanéphriquereinscommence au cours de la cinquième semaine de gestation (GW), qui se différencie ensuite continuellement pour former les reins permanents [1,2]. Les interactions de signalisation entre le mésenchyme métanéphrique et le bourgeon urétéral assurent une bonneun reindéveloppement au cours de la néphrogénèse. En bref, le bourgeon urétéral induit une transition mésenchymateuse-épithéliale (MET) dans le mésenchyme métanéphrique, qui se condense et formerénalvésicules, suivies de corps en forme de virgule et en forme de S, et conduisant finalement à la formation de glomérules [3]. En retour, le mésenchyme induit une nouvelle ramification du bourgeon urétéral. Les reins métanéphriques deviennent des unités excrétrices fonctionnelles à la 11e semaine du développement humain. Cependant, la néphrogenèse est terminée entre la 34e et la 36e semaine de développement fœtal, lorsque plusieurs événements de ramification sont terminés, mais le processus de différenciation des reins se poursuit dans la période postnatale [4,5]. Les perturbations de ces interactions complexes entraînent diverses anomalies congénitales des reins et des voies urinaires (CAKUT), y compris la dysplasie, la polykystose rénale, la dysplasie multikystique.maladie du rein(MCDK), entraînant par conséquent desmaladie du rein(CKD) [6].

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l'apparence des cils primaires et la voie de signalisation Wnt, qui joue un rôle important au cours de la néphrogénèse normale et dans laun reinprocessus de réparation, à la suite de crises aiguës ou chroniquesmaladie du rein[sept]. L'existence de cils primaires au cours de la néphrogénèse et le grand nombre d'étapes développementalesun reinles défauts survenant chez les patients atteints de maladie ciliaire soulignent qu'une véritable fonction cil primaire est nécessaire pour un fonctionnement normal.un reinorganogenèse [8,9]. Le cil primaire est un organite à base de microtubules important pour l'homéostasie tissulaire, où la -tubuline est le composant de base [10]. La perte d'acétylation de la -tubuline dans les cellules immortalisées déclenche la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), ce qui implique que la -tubuline acétylée est importante dans la stabilisation des microtubules [11]. Au cours du développement humain, la voie primaire Wnt médiée par les cils permet la prolifération cellulaire, la différenciation et la morphogenèse tissulaire [12]. Un nombre important d'enfants présentant une fonction cilaire primaire altérée et une voie de signalisation Wnt perturbée développent une IRC, où congénitalerénalles troubles sont responsables de près de la moitié des cas [13]. La maladie kystique congénitale la plus fréquente chez l'enfant est la dysplasie multikystiquemaladie du rein(MCDK) [14]. Kystes multiples qui ne communiquent pas [15] et manquent de normalitérénalparenchyme sont des résultats microscopiques caractéristiques pour MCDK. La glomérulosclérose segmentaire focale (FSGS) est l'une des maladies glomérulaires les plus courantes qui conduisent au stade terminalmaladie du rein[16]. Au début, le FSGS est caractéristique d'être focal, n'impliquant qu'une minorité des glomérules et segmentaire, n'impliquant des changements que dans un segment du cercle glomérulaire [17]. Le syndrome néphrotique congénital de type finlandais (CNF) est une maladie rare à transmission autosomique récessivemaladie du reinreprésenté par une poussée prénatale de perte protéique extensive [18], associée à une cystogenèse des tubules proximaux [19]. De nombreuses formes de maladies glomérulaires primaires développent une protéinurie en raison de la barrière de filtration glomérulaire endommagée [20]. Un nombre considérable d'études implique que les lésions et le dysfonctionnement des podocytes ont des rôles intrinsèques dans la pathogenèse de la protéinurie CKD [21]. L'étude de Vukojevic et al. montre une augmentation du nombre de podocytes ciliés et peu différenciés dans le LNC [22]. Des études antérieures ont indiqué que la voie de signalisation Wnt/-caténine a un rôle fondamental dans la modération du dysfonctionnement des podocytes avec protéinurie [23]. Il existe deux principales voies de signalisation Wnt, l'une dite canonique dépendante de la caténine et l'autre non canonique, indépendante de la caténine. Pendant la sourisun reindéveloppement, la signalisation canonique Wnt est active sur les extrémités des bourgeons urétéraux et dans les corps en forme de S [24]. De plus, Wnt via la signalisation canonique a une pertinence dans le maintien de MET pendant la néphrogénèse [25]. À savoir, la liaison du complexe protéique contenant Dvl au récepteur membranaire est obligatoire pour l'activation de la voie Wnt, tandis que la désactivation des composants clés de cette voie entraîne une mortalité périnatale précoce en raison de l'absence de la zone néphrogénique dans leun rein[25]. 

Une protéine cruciale en tant que commutateur moléculaire entre les voies de signalisation Wnt canoniques et non canoniques s'est avérée être l'inversion [26]. Bien que des interactions de diverses protéines avec l'inversion aient été détectées, sa fonction exacte n'a pas encore été complètement clarifiée. Dans lerénalcellules épithéliales, l'inversion est localisée dans les cils primaires, agissant comme une protéine ciliaire [27]. De plus, l'inversion forme un complexe stable avec la tubuline dans les cultures derénalcellules, et ils colocalisent in vivo [27,28]. L'inversion semble jouer un rôle essentiel dans la morphogenèse précoce du système pronéphrique et la détermination de la symétrie gauche-droite au cours du développement [29,30]. Un événement significatif pour les voies de signalisation Wnt canoniques et non canoniques dans le recrutement de la Dvl cytoplasmique à la membrane cellulaire. Étant donné que les découvertes précédentes ont montré que l'inversion et Dvl colocalisent dans les cellules épithéliales rénales, on peut supposer que l'inversion pourrait également jouer un rôle dans la signalisation non canonique. La dérégulation de la signalisation Wnt médiée par l'inversion déclenche une prolifération aberrante dans les tubules [31]. Des tests génétiques ont révélé une mutation DVL-1 chez des patients atteints du syndrome de Robinow autosomique dominant, présentant des troubles hétérogènes chez certains patients associés à des troubles urogénitaux etrénalanomalies [32].

CISTANCHE AMÉLIORERA LA DIALYSE RÉNALE/RÉNALE

Le modèle d'expression développementale de la -tubuline, de l'inversion et de la DVL-1 a été étudié dans différents modèles animaux. Ainsi, leur expression dans le pronéphros de Xenopus laevis a été confirmée en utilisant la microscopie intravitale [31], alors qu'elles ont été trouvées dans des lignées cellulaires dérivées de cellules tubulaires proximales murines en utilisant la microscopie confocale et la spectrométrie de masse [33]. De plus, la microscopie optique et la double immunofluorescence ont révélé leur présence dans des coupes de sourisreins[34]. Des études sur des souris knock-out d'inversion ont rapporté des kystes élargis et diffus dans lerénalmedulla et cortex associés à une inversion viscérale situs [35]. Chez l'homme, la mutation d'inversion a été présentée avec une néphronophtise infantile qui a conduit à l'interruption de grossesse [36]. Malgré de nombreuses études surrénal-tubuline, inversion et modèle d'expression et fonction de DVL-1, à notre connaissance, un modèle d'expression de ces protéines dans le tissu humain fœtal et postnatal humain n'a pas encore été étudié et mis en corrélation. De plus, aucune preuve n'a été rapportée concernant l'expression de l'inversion et de la DVL -1 au début du développement humain. Par conséquent, cette étude visait à analyser le modèle d'expression spatiale et temporelle de la -tubuline, de l'inversion et de la DVL -1 au cours des stades fœtaux et postnatals de l'homme en bonne santé.reins, Aussi bien que dedansun reintissus de MCDK, FSGS et CNFreinsafin d'établir un éventuel chaînon manquant entre ces entités. À savoir, nous proposons que les modèles d'expression perturbés des protéines -tubuline, d'inversion et DVL-1 pourraient être le processus de cystogenèse sous-jacent et une fonction anormale des cils primaires conduisant à une maladie chronique.maladies rénales. 

Résultats

L'analyse des troubles développementaux et postnatalsun reintissus a été réalisée sur des structures distinctement différenciées de laun rein:tubules contournés proximaux (pct), tubules contournés distaux (dct) et glomérules (g). Au cours des stades de développement analysés et en période postnataleun reintissus, -tubuline, inversion et DVL-1 ont montré des modèles d'expression positifs mais avec des différences d'intensité, de distribution et de quantité. L'analyse de la pathologietissu rénalde MCDK, FSGS et CNF a été réalisée sur le nombre d'images complet des cellules positives par rapport au témoin de tissu rénal sain.

2.1. Microscopie optique, microscopie électronique et immunohistochimie (-tubuline) de tissu rénal humain postnatal sain et pathologiquement modifié

2.1.1. Lumière rénale postnatale saine

microscopie postnataleun reinle tissu montre bien définiun reinstructures, avec une nette différence entre la moelle et le cortex et la formation du pct, dct et g dans la région corticale. La coloration immunohistochimique de la -tubuline révèle la présence d'un cil primaire au centre de la surface cellulaire apicale de chaque cellule tubulaire et dans 0.018 % ± 0,00014 % SD à la surface des cellules glomérulaires. La microscopie électronique montre la présence d'un seul cil primaire provenant du corps basal à la surface cellulaire apicale du tubule (Figure 1a).

2.1.2. CNF

La plupart des g analysés sont plus petits et lobulés (80 % ), tandis que la minorité est de taille normale ou hypertrophique (20 % , n=100). On trouve une sclérose segmentaire ou globale de g, tandis que pct et dct sont partiellement dilatés et recouverts d'épithélium atrophique. Ultrastructurellement, on observe une perte de microvillosités et une diminution de la hauteur cellulaire avec multifragmentation des noyaux. Dans les podocytes, les processus du pied sont perdus de manière diffuse. Les cils primaires tubulaires sont désorganisés, en particulier dans les kystes des tubules proximaux, montrant des changements de longueur et de position cytoplasmique (Figure 1b).

2.1.3. MCDK

Dans le tissu rénal, des g immatures et matures sporadiques peuvent être trouvés.Un reinle tissu est rempli de nombreux kystes ovales. Les cellules épithéliales cylindriques recouvrent les kystes et sont entourées de tissu conjonctif lâche. La coloration immunohistochimique à la tubuline montre de multiples cils primaires longs et désorganisés à la surface des cellules épithéliales (Figure 1c).

2.1.4. FSGS

Chez 90 % des g, une sclérose segmentaire étendue est retrouvée (n=100), associée à une fibrose interstitielle et à des signes de lésions tubulaires. La diminution de la hauteur des cellules épithéliales avec perte de microvillosités se retrouve au microscope électronique, tandis que les cellules endothéliales et les régions mésangiales ont une ultrastructure régulière. Au microscope électronique, le cil extrêmement long et disloqué (décentralisé) est observé à la surface de la cellule tubulaire distale (Figure 1e). Les podocytes présentent une perte diffuse des processus du pied avec un tissu microvillositaire étendu. La coloration immunohistochimique de l'a-tubuline montre de multiples cils primaires longs et désorganisés à la surface des cellules épithéliales (Figure 1c).

2.2. Coloration immunohistochimique de la 心tubuline, inversion et DVL-1- et analyse statistique des reins humains postnatals sains et en développement

Aux 14e, 15e et 16e semaines de gestation, leun reinle tissu est présenté avec différents stades de développement de la formation des néphrons : des cupules métanéphriques,rénalstades de vésicules pour commander des néphrons en forme de S, formant ainsi la zone néphrogénique dans le cortex externe (Figure 2). La différenciation de pct, dct et g peut être observée dans les régions corticales plus proches de laun reinmoelle. Au cours de la 22e GW, des parties de la moelle et du cortex sont devenues clairement distinctes, tandis qu'à la 38e GW,un reinles structures apparaissent comme hautement différenciées, contenant des formes matures de pct, dct et g

2.2.1. a-tubuline

Au cours du développement, l'a-tubuline est fortement exprimée dans tous lesun reinstructures, visualisant principalement la forme des cils primaires sur les surfaces des cellules épithéliales pariétales de la capsule de Bowman, g, pct et dct. Dansun reintissu, 82 à 97 % des cellules pct expriment l'a-tubuline, tandis que dans le dct, l'expression chute de 99 % à 72 % dans la 38e GW (voir figure 3, tableau 1). Parmi les différents stades de développement, l'expression la plus forte de l'a-tubuline se trouve dans le g de la 16e GWreins, contenant 93 % de cellules positives. les 14e, 15e et 22e GW (voir Figure 3a, b, tableau 1), environ 70 % des cellules g expriment l'a-tubuline, tandis que la moindre expression est observée dans la 38e GW (p <0,01) avec="" 34="" pour="" cent="" des="" cellules="" positives="" (figure="" 3c).="" en="">un reintissu (1.5-ans et 7-ansreins), la plus forte immunoréactivité à l'a-tubuline est observée sur la surface cellulaire apicale du pct et du dct (figure 3d-f). L'expression de l'a-tubuline est également présente dans le cytoplasme périnucléaire du dct et les cellules épithéliales pariétales de la capsule de Bowman. l'a-tubuline tache toutrénalstructures avec une moyenne de 50 % de cellules positives en pct, 94 % en dct et 85 % en g (Figure 3f). Le Dct colore significativement différent du PCT (p < 0,0001).="" toutes="" les="" structures="" étudiées="" se="" colorent="" positivement="" à="" l'a-tubuline,="" avec="" 77 %="" de="" cellules="" positives="" dans="" le="" pct,="" 72 %="" dans="" le="" dct="" et="" 58 %="" dans="" le="" g="">

Figure 3. Coloration par immunofluorescence de la -tubuline et du DAPI dans les tissus rénaux humains en développement et postnatals (a–e). Reins des 14e, 15e/16e, 38e GW (a–c) ;reinsd'enfants de 1.5- et 7- ans (d,e). Une coloration positive de la -tubuline (flèches) est montrée dans chaque structure du cortex à travers les phases de développement et postnatales (a – e), les tubules contournés proximaux (pct), les tubules contournés distaux (dct) et les glomérules (g). Les détails des cils primaires dans pct (d) et dct (a – c, e) sont présentés sous forme d'encarts à plus fort grossissement (boîte blanche). Grossissement ×40, barre d'échelle 100 µm. La distribution des cellules positives à la -tubuline par structure au cours des différents stades de développement et dans la période postnatale est indiquée dans le graphique (f). Le graphique (g) (nombre total de cellules positives pour les protéines dans les structures observées) montre l'expression des protéines liée au temps de développement (régression linéaire) et l'interrelation de -Tubuline à DVL-1 à travers le développement et la maturation (ANOVA à deux voies suivie de test post-hoc de SIDAK). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD.

La distribution des cellules positives pour la -tubuline par structure à travers les différents stades de développement et dans la période postnatale est montrée dans le graphique (f). Le graphique (g) (nombre total de cellules positives pour les protéines dans les structures observées) montre l'expression des protéines liée au temps de développement (régression linéaire) et l'interrelation de la -tubuline à DVL-1 à travers le développement et la maturation (ANOVA à deux voies suivie de test post-hoc de Sidak). Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD.

2.2.2. Double coloration par immunofluorescence à l'inversion et coloration nucléaire DVL-1 et DAPI dans les reins postnatals en développement et sains Expression d'inversion dans les tissus rénaux en développement et postnatals

Dans les 14e, 15e et 16e GW, l'inversion montre une forte expression granulaire en g et une légère expression granulaire dans le cytoplasme de pct et dct (Figure 4a, b), tandis que dans les 22e et 38e GW (voir Figure 4c), la forte une expression positive est observée en g (tableau 1). Entre la 14e et la 22e GW, environ 50 % des cellules expriment la version. Dans la 16e GW, les cellules pct expriment une inversion dans 73 % des cellules, tout en diminuant à 29 % des cellules (p <0, 05)="" dans="" la="" 38e="" gw="" (voir="" la="" figure="" 4f).="" l'expression="" positive="" de="" l'inversion="" se="" trouve="" dans="" environ="" 80="" à="" 90 %="" des="" cellules="" dct="" et="" g="" du="">un reintissus des 14e et 16e GW, avec l'expression la plus faible dans le dct de la 38e GW (p <0.05, p=""><0,0001, respectivement)="" où="" 66 %="" des="" cellules="" étaient="" positives.="" en="">reins, pct se colore fortement au niveau de la membrane cellulaire apicale, tandis que le dct se colore principalement au niveau de la membrane cellulaire basale et dans le cytoplasme périnucléaire (Figure 4d, e). A ce stade, nous avons trouvé l'expression de l'inversion dans tous les cas étudiés.rénalstructures, y compris pct, dct et g, avec une expression moyenne de cellules positives de 92 % pour pct, 88 % pour dct et 90 % pour g (Figure 4f). Nous n'avons pas observé de différence significative dans la force du signal d'expression d'inversion entre les structures. L'expression la plus élevée d'inversion se trouve en g, avec une moyenne de 94 % de cellules positives (figure 4f). Une différence significative est trouvée en comparant la coloration de g (où 94 % des cellules se colorent positivement) à pct, où 58 % des cellules se colorent positivement (p <0.01) et="" à="" dct,="" où="" 49 %="" des="" cellules="" sont="" colorées.="" positif="" (p="">< 0,0001,="" figure="">

Expression DVL-1 dans les tissus rénaux en développement et postnatals

Une expression légère à forte de DVL{{0}} est observée dans le cytoplasme de pct, dct et g pendant la période fœtale (voir Figure 4a–c, Tableau 1). En pct, 76 à 86 % des cellules expriment DVL -1 dans la 14e à la 22e GW, tandis que dans la 38e GW, il y a 57 % de cellules positives (Figure 4g). Dans le dct des 14e et 15e GW, 68–70 % des cellules expriment DVL-1, dans les 16e et 22e GW, le nombre de cellules positives tombe à 42–5{{41} } pour cent, tandis que dans la 38e expression GW (p <0,001), est="" observée="" dans="" 19="" pour="" cent="" des="" cellules="" dct.="" l'expression="" de="" dvl-1="" augmente="" en="" g="" tout="" au="" long="" des="" stades="" fœtaux :="" dans="" la="" 14e="" gw,="" elle="" est="" de="" 6 %,="" tandis="" qu'aux="" 15e,="" 16e="" et="" 22e="" gw,="" elle="" augmente="" à="" 10 %="" (p="">< 0,01).="" dans="" les="" 38 gw,="" 14 %="" des="" cellules="" g="" expriment="" dvl="" -1="" (figure="" 4="" g).="" dans="" la="" période="" postnatale,="" l'immunoréactivité="" dvl="" -1="" est="" dispersée="" dans="" le="" cytoplasme="" (tableau="" 1)="" à="" la="" fois="" du="" pct="" et="" du="" dct="" (figure="" 4d,="" e).="" le="" signal="" se="" retrouve="" dans="" toutes="" les="" structures="" étudiées="" mais="" principalement="" dans="" le="" cytoplasme="" périnucléaire.="" l'intensité="" de="" l'expression="" de="" dvl-1="" est="" significativement="" plus="" élevée="" en="" pct="" par="" rapport="" à="" dct="" et="" g="" (p="">< 0,01).="" 39="" à="" 45 %="" des="" cellules="" du="" pct="" et="" du="" dct="" expriment="" dvl="" -1,="" tandis="" que="" dans="" g,="" 21 %="" des="" cellules="" sont="" positives="" (figure="" 4="" g).="" nous="" n'avons="" pas="" trouvé="" de="" différence="" significative="" entre="" le="" pourcentage="" de="" cellules="" immunoréactives="" dans="">rénalstructures. Le pourcentage de cellules immunoréactives DVL-1 est de 34 % en pct, 36 % en dct et 27 % en g, respectivement (figure 4g).

Figure 4. Double coloration par immunofluorescence d'inversion (vert), DVL-1 (rouge) et DAPI (bleu) dans les tissus rénaux en développement et postnatals (14e à 38e GW, 1.5- et {{6 }} tissus rénaux âgés d'un an). Une coloration positive (flèches) est indiquée dans chaque structure tout au long de toutes les phases de développement (a – c) et de la période postnatale (d, e). Microphones fusionnés avec des structures d'intérêt dans le cortex : tubules contournés proximaux (pct), tubules contournés distaux (dct) et glomérules (g). La colocalisation de l'inversion/DVL-1 (pointe de flèche) est montrée dans les microphotographies fusionnées. Les colorations de contrôle négatives sont présentées sous forme d'encarts sur l'inversion et DVL-1 (a). Les érythrocytes peuvent être vus comme des cellules fortement colorées près de dct. Les détails sont affichés sous forme d'encarts à plus fort grossissement. Grossissement ×40, barre d'échelle 100 µm. La distribution dynamique des cellules positives de l'inversion et de la DVL -1 dans les structures rénales (pct, dct, g) tout au long des stades de développement et postnatals est illustrée dans les graphiques (f, g). Le graphique (h) montre l'expression des protéines (nombre total de cellules positives dans les structures) liée au temps de développement (régression linéaire) et à l'interrelation de l'inversion en DVL -1 par le développement et la maturation (ANOVA à deux voies suivie du test post hoc de Sidak ). Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD.

La co-expression de l'inversion et du DVL -1 est observée dans le cytoplasme du rein g, dct et pct au cours du développement (voir Figure 4a – c, fusion). Dans la période postnatale, la co-expression de l'inversion et du DVL-1 caractérise différents compartiments cellulaires des cellules tubulaires dans pct et dct, tandis que la co-expression dans g est caractérisée par la forte prévalence de l'expression d'inversion (voir Figure 4d, fusion ). Dans les reins postnatals de l'7-année, la co-expression de l'inversion et de la DVL-1 est observée dans les cellules tubulaires de dct et de pct, et dans g où l'expression de l'inversion prévaut légèrement par rapport à la DVL-1 (Figure 4e, fusion).

2.2.3. Différences d'expression de la -tubuline, de l'inversion et de la DVL-1 entre les différents stades de développement du rein et les reins postnatals

Le nombre de cellules positives pour la tubuline dans le pourcentage de tissu rénal fœtal était statistiquement significativement plus élevé par rapport au tissu rénal des enfants de 7- ans (13e (p < 0.0{="" {11}}1),="" 15e="" (p="">< 0.0001)="" et="" 16e="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" le="" dct="" des="" stades="" fœtaux="" précoces="" (13e,="" 15e,="" 16e="" et="" 22e="" gw)="" avait="" plus="" de="" cellules="" positives="" par="" rapport="" au="" 38e="" gw="" et="" au="" tissu="" rénal="" d'enfants="" de="" 1.5-="" ans="" (p=""><0,0001, respectivement,="" figure="" 3f).="" lorsque="" différents="" stades="" de="" développement="" ont="" été="" comparés,="" nous="" avons="" trouvé="" des="" niveaux="" inférieurs="" d'expression="" d'inversion="" dans="" le="" pct="" du="" 13e="" (p=""><0,0001), 15e="" (p=""><0,00001), 22e="" (p=""><0,001) et="" 38e="" (p=""><0,0001) gw="" par="" rapport="" à="">rénaltissu de l'enfant de 1.5- ans. Dans dct, une expression d'inversion inférieure statistiquement significative a été trouvée en comparant le tissu rénal du 16e GW au 38e GW (p <0.0001). en="" outre,="" une="" expression="" plus="" faible="" de="" l'inversion="" dans="" le="" dct="" a="" été="" observée="" dans="" le="" tissu="" rénal="" d'un="" enfant="" de="" 7- ans ;="" comparant="" le="" 13e,="" le="" 15e="" (p=""><0,001, les="" deux),="" le="" 16e="" et="" le="" 1.5-tissu="" rénal="" âgé="" de="" 7-ans="" à="" dct="" de="" tissu="" rénal="" âgé="" de="" 7-ans="" (p=""><0,00001, respectivement,="" figure="" 4f).="" le="" signal="" observé="" de="" l'expression="" de="" dvl-1="" à="" travers="" les="" différentes="" étapes="" a="" révélé="" que="" le="" pct="" du="" 13e="" (p="">< 0,01),="" 15e,="" 16e="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Relation entre les expressions de -tubuline et l'inversion en DVL-1 dans les tissus rénaux en développement et postnatals

-Les expressions de tubuline et d'inversion ont été comparées à l'expression de DVL-1 tout au long des stades de développement et dans le tissu rénal postnatal. -la tubuline avait une expression statistiquement plus élevée à tous les stades observés, par rapport à l'expression de DVL-1 (p <0.001, figure="" 3g).="" à="" toutes="" les="" étapes="" observées,="" l'inversion="" avait="" une="" expression="" plus="" élevée="" par="" rapport="" à="" dvl="" -1="" (p=""><0,0001, figure="" 4="">

2.2.5. Comparaison de la coloration immunohistochimique à -Tubuline, version et DVL-1- et analyse statistique du tissu rénal pathologiquement modifié (MCDK, CNF, FSGS) -Tubuline La différence de coloration -tubuline dans MCDK, FSGS et CNF était statistiquement significative en comparaison au tissu rénal postnatal sain comme groupe témoin (p <0.0001, respectivement).="" les="" tissus="" rénaux="" dysplasiques="" avaient="" une="" expression="" significativement="" plus="" élevée="" par="" rapport="" au="" groupe="" témoin,="" tandis="" que="" le="" fsgs="" et="" le="" cnf="" présentaient="" une="" expression="" significativement="" plus="" faible="" de="" la="" -tubuline="" par="" rapport="" au="" témoin="" sain="" (figure="">

Inversion

L'inversion est exprimée dans le cytoplasme des cellules épithéliales désorganisées et des tubules de MCDK (Figure 5a). Dans le CNF, l'expression d'inversion caractérise g et dct, alors qu'elle apparaît moins intensément dans les kystes pct (Figure 5b). Dans FSGS, l'inversion est fortement exprimée en g et dct mais moins intensivement dans les kystes pct (Figure 5c). L'expression spatiale de l'inversion a montré un taux de coloration statistiquement plus élevé dans les tissus rénaux sains (Figure 5g) par rapport à MCDK, FSGS et CNF (p <0.0001,>

Figure 5. Double marquage par immunofluorescence d'inversion (vert), DVL-1 (rouge) et DAPI (bleu) dans les tissus rénaux pathologiques dans MCDK (a), CNF (b) et FSGS (c) : tubules (t) , les glomérules (g), le kyste pct (c), la hauteur des cellules épithéliales pct (*). La co-localisation de la structure et de la cellule de l'inversion et du DVL -1 (pointes de flèches) sont présentées dans les sections fusionnées avec des détails dans des encarts à plus fort grossissement. Les colorations de contrôle négatives sont présentées sous forme d'encarts sur l'inversion et DVL -1 (a). Grossissement ×40, barre d'échelle 10{{20}} µm. Relation de la -tubuline (d) et de l'inversion (e) avec l'expression de DVL-1 dans MCDK, FSGS et CNF (ANOVA à deux voies suivie du test post hoc de SIDAK). La différence de hauteur des cellules épithéliales (f) de FSGS, CNF et MCDK pct par rapport au témoin sain (ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey, n=50). La différence dans le pourcentage global de cellules positives de -tubuline, d'inversion et de DVL -1 dans MCDK, CNF et FSGS par rapport au contrôle sain (g – i), ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey). Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD. Les différences significatives sont indiquées par la valeur p (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" est="" très="" légèrement="" exprimé="" uniquement="" dans="" les="" tubules="" désorganisés="" de="" mcdk,="" tandis="" que="" dans="" cnf,="" son="" expression="" caractérise="" dct="" et="" g="" (figure="" 5a,="" b).="" dans="" fsgs,="" dvl-1="" est="" observé="" comme="" une="" légère="" réactivité="" dans="" g,="" dct="" et="" pct="" (figure="" 5c).="" les="" tissus="" rénaux="" sains="" colorés="" au="" dvl="" -1="" ont="" montré="" un="" taux="" de="" coloration="" significativement="" plus="" élevé="" (figure="" 5="" h)="" contrairement="" au="" mcdk="" et="" au="" fsgs="" (p=""><0,0001, les="" deux),="" alors="" qu'aucune="" différence="" significative="" n'a="" été="" trouvée="" pour="" le="">

2.2.6. Relation entre les expressions de -tubuline et l'inversion en DVL-1 dans les tissus rénaux pathologiquement modifiés (MCDK, CNF, FSGS)Dans MCDK, FSGS et CNF, la -tubuline est colorée de manière significativement plus élevée que DVL-1 (p <0.0001, respectivement,="" figure="" 5d).="" l'inversion="" est="" nettement="" plus="" colorée="" que="" dvl-1="" dans="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" et="" dans="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" figure="">

2.2.7. Différences dans la hauteur des cellules épithéliales des tubules contournés proximaux entre le contrôle sain et le tissu rénal pathologiquement modifié (MCDK, CNF, FSGS)La hauteur des cellules épithéliales pct (n {{0}} par groupe) a été comparée entre les cellules tubulaires dans les tissus rénaux sains et les tissus rénaux pathologiquement modifiés (Figure 5b, c, f). La hauteur moyenne des cellules épithéliales dans HC était de 12,91 µm ± 1,847 µm et était significativement plus élevée par rapport à CNF et FSGS (p <0.0001, respectivement).="" la="" hauteur="" moyenne="" des="" cellules="" dans="" le="" pct="" cnf="" était="" de="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" tandis="" que="" dans="" le="" fsgs="" était="" de="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" les="" cellules="" épithéliales="" pct="" de="" mcdk="" n'ont="" pas="" montré="" de="" changements="" significatifs="" de="" hauteur="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" par="" rapport="" à="">

2.2.8. Différences de longueur des cils primaires entre le contrôle sain et le tissu rénal pathologiquement modifié (MCDK, CNF, FSGS)

La longueur du cil primaire (n= 50 par groupe) a été comparée entre les tissus rénaux HC et pathologiquement modifiés (Figure 6c). Des tissus rénaux sains et MCDK ont été colorés avec -tubuline pour rassurer la spécificité de la coloration du cil -tubuline (Figure 6a, b). Dans les tissus rénaux sains, le cil primaire mesurait 5,065 µm ± 1,229 µm de long, tandis que dans le MCDK, le CNF et le FSGS étaient significativement plus longs (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Discussion

Le but de notre étude était d'étudier une expression immunohistochimique de l'a-tubuline, de l'inversion et de la DVL-1 chez le fœtusrénaltissus et tissus rénaux postnatals. De plus, nous voulions explorer si l'expression et le schéma de coloration de l'a-tubuline, de l'inversion et de la DVL -1 sont perturbés dans différentes maladies rénales par rapport au témoin sain. À savoir, malgré l'intérêt considérable des autres chercheurs sur le rôle de l'a-tubuline, de l'inversion et de la DVL-1 au cours du développement rénal, la plupart des études précédentes ont utilisé des animaux ou des modèles expérimentaux in vitro. À notre connaissance, il s'agit de la première étude qui a montré l'expression et la localisation de l'a-tubuline ainsi que l'inversion et la DVL -1 dans les reins humains fœtaux et postnatals, et qui a exploré l'expression des protéines mentionnées dans les reins. maladies telles que MCDK, FSGS et CNF. Nous avons également analysé les changements de longueur et d'apparence des cils par microscopie optique et électronique, car notre étude précédente a déjà indiqué que des perturbations ciliaires peuvent être associées à la cystogenèse dans le FSGF et le CNF [19].

Dans la voie canonique de signalisation Wnt, la liaison des ligands Wnt aux récepteurs recrute Dvl [37]. Les processus du MET et de la voie de polarité cellulaire planaire au cours des premiers stades de la morphogenèse rénale sont contrôlés par la signalisation Wnt. En médiant la voie Wnt, les cils primaires contrôlent la prolifération cellulaire, la différenciation et la morphogenèse tissulaire [12] en organisant le cytosquelette cellulaire et l'orientation cellulaire ainsi que l'allongement de la structure tubulaire [2,38]. Dans notre étude, la -tubuline, l'inversion et la DVL-1 étaient toutes présentes dans les structures rénales, et toutes colocalisées non seulement pendant le développement du rein fœtal, mais également dans le tissu rénal de 1.5- et {{9 enfants de }} ans. Ces résultats sont en accord avec l'activation de la voie de signalisation Wnt qui s'est avérée se produire déjà pendant la tubulogenèse [39]. De plus, nos résultats ont révélé que l'expression de -tubuline et l'inversion sont réciproquement liées à DVL-1 et qu'elles montrent une différence statistiquement significative entre leurs modèles d'expression. Ceci est en corrélation avec les modèles expérimentaux, car la mutation de la famille complète des protéines Dvl chez la souris entraîne un manque de processus de gastrulation, tandis que les mutations qui n'incluent pas toute la famille des protéines montrent des défauts de placement des cils nodaux ainsi que des défauts d'organes [40] . Des découvertes antérieures ont suggéré que l'inversion joue un rôle dans la migration cellulaire chez Xenopus pronephros. Étant donné que ce segment est en corrélation avec la boucle de mammifère de Henle et les tubules distaux, cela pourrait également indiquer l'importance de l'inversion au cours du développement du rein chez l'homme [41]. En accord avec cette prémisse, des études antérieures ont révélé que la mutation du gène d'inversion pourrait entraîner une néphronophtise de type 2, qui est médiée par une expression anormale de DVL-1 [42]. Bien que le rôle du cil primaire soit controversé dans la régulation de la voie de signalisation Wnt, nous avons constaté que la -tubuline était colocalisée avec l'inversion et la DVL-1 dans les échantillons de rein analysés. De plus, des études antérieures ont souligné que le cil primaire avec l'inversion régule la dégradation de Dvl en influençant la voie de signalisation Wnt [43]. Dans les maladies rénales humaines associées au développement de kystes, une localisation et une fonction anormales des cils primaires ont été observées [19]. De même, la présente étude a également confirmé les changements morphologiques de la formation des cils primaires dans des conditions pathologiques telles que CNF, FSGS et MCDK. Des découvertes antérieures ont reconnu que la suractivation de la voie canonique Wnt suite à une lésion rénale entraîne des modifications structurelles irréversibles du tissu rénal [44]. Au contraire, le cil primaire s'est vu confier le rôle de passer de la voie Wnt canonique à la voie non canonique pour aiderrénalréparation. De plus, la suractivation de la voie canonique Wnt dans le tissu rénal transplanté s'est avérée avoir une valeur prédictive positive vis-à-vis de la fibrose rénale [45]. Si la voie canonique Wnt prévaut au détriment de la voie non canonique, elle soutient la théorie de la fibrose rénale comme résultat. Nos découvertes de la diminution de l'expression de la tubuline et de l'inversion dans le CNF et le FSGS impliquent l'inactivité de la voie Wnt non canonique, d'autant plus que les deux conditions ont tendance à conduire au stade terminal.maladie rénale.À savoir, on pense que la localisation et la fonction normales du cil primaire pourraient être un facteur dans le maintien d'une voie Wnt régulière et, par conséquent, une condition préalable au développement normal. En revanche, si la voie Wnt est améliorée, cela peut entraîner une prolifération et une différenciation cellulaires dérégulées conduisant à la cancérogenèse [46]. Comme décrit précédemment, la voie canonique Wnt est obligatoire pour l'initiation de MET et la formation du néphron, tandis que sa perturbation pourrait conduire àrénalhypoplasie [47]. Nos résultats appuient cette idée en révélant l'expression la plus faible de DVL -1 avec l'expression la plus élevée de -tubuline dans MCDK par rapport au témoin sain. Ces résultats peuvent impliquer la plus faible activation de la voie canonique Wnt, ce qui pourrait être une cause sous-jacente de l'absence de formation de néphrons. En revanche, l'expression la plus élevée de tubuline avec l'expression la plus faible de DVL -1 pourrait expliquer les résultats de plusieurs kystes car il n'y a pas d'élongation organisée et de polarisation cellulaire guidée par la voie Wnt non canonique. Des études antérieures avaient également montré que l'inversion inhibe la voie de signalisation canonique Wnt en ciblant Dvl pour la dégradation [26]. Cette étape de leur interaction s'est avérée nécessaire pour inhiber la signalisation Wnt canonique dans le maintien de l'allongement et du positionnement tubulaires normaux. La mutation d'inversion entraîne une régulation à la hausse de la signalisation canonique Wnt, qui a ensuite provoqué une prolifération anormale dans les cellules tubulaires. Cette étape s'est avérée cruciale dans la cystogenèse [42], tandis que le knock-out de l'inversion chez la souris conduit à la polykystose rénale [48]. Selon la théorie derénalcystogenèse, l'inversion est considérée comme une "mycoprotéine", en raison de sa localisation aux cils primaires dansrénalcellules tubulaires. Dans notre étude, les cils primaires étaient présents sur la surface cellulaire apicale des cellules tubulaires à tous les stades analysés, tandis que pendant les stades fœtaux, l'expression de la -tubuline était plus forte que pendant la période postnatale.

CISTANCHE AMÉLIORE LA DOULEUR RÉNALE/RÉNALE

Des études antérieures ont montré que la fonction primaire des cils peut être affectée par une dérégulation de la -tubuline au cours du développement, ce qui peut entraîner une cystogenèse, un développement anormal des reins et une éventuelle maladie rénale chronique chez l'enfant [31,49]. Ceci est conforme à nos découvertes de cils primaires raccourcis et dysmorphiques observés dans MCDK ou avec des cils multiples et extrêmement allongés ou disloqués trouvés dans les tubules dilatés de CNF et FSGS par rapport au contrôle sain. Pour étayer le fait que les voies de signalisation Wnt canoniques et non canoniques, régulées par les cils primaires, sont considérées comme obligatoires pour le développement normal des reins, nous avons trouvé une coloration significativement plus faible de l'inversion et du DVL -1 dans MCDK par rapport au témoin sain [31,49]. Différentes dynamiques de modèle d'expression de -tubuline, d'inversion et de DVL -1 tout au long des différentes phases de développement du rein peuvent indiquer une commutation entre la voie de signalisation Wnt canonique et non canonique au cours de la morphogenèse rénale normale. Nous suggérons que leur échange détermine la transcription dans la voie canonique ou l'ordre de migration cellulaire et de polarisation au cours du développement du rein dans une voie de signalisation non canonique. Leur équilibre et leur expression dans toutes les structures rénales étudiées impliquent leur rôle important dans le développement normal des reins. Au cours du développement normal des reins (de la 13e GW à la 38e GW), l'expression globale de -tubuline, d'inversion et de DVL-1 diminue à mesure que le tissu rénal acquiert une morphologie mature. Dans les tissus rénaux de 1.5- et 7- ans, la -tubuline et l'inversion ont montré une légère augmentation de l'expression, ce qui confirme le fait que la voie Wnt non canonique reste active après la naissance. Au contraire, DVL -1 persiste avec une diminution du modèle d'expression, ce qui pourrait ajouter à la conclusion selon laquelle la voie canonique Wnt est réduite au silence dans le tissu rénal sain. Suite à des conditions rénales pathologiques, les cellules épithéliales du rein pourraient réagir avec la réapparition d'EMT et de fibrose [50] associée à la réactivation de la voie canonique Wnt [44]. Par conséquent, les perturbations de la -tubuline, de l'inversion et de la DVL-1 trouvées dans les reins malades pourraient être le mécanisme pathologique sous-jacent et le résultat du passage de la voie Wnt non canonique à la voie canonique dans le rein en développement, faisant allusion au passage d'un rein réversible à un rein irréversible. dégâts. De plus, les changements dans leur vie prénatale et postnatalerénalle profil d'expression pourrait être associé à une altération de la fonction rénale à l'âge adulte, entraînant des maladies congénitales et une insuffisance rénale chronique.

4. Matériels et méthodes

4.1. Échantillons humains

Des échantillons de tissu rénal fœtal ont été prélevés après une perte de grossesse aux 14e, 15e, 16e, 22e et 38e GW au département de gynécologie et d'obstétrique du centre hospitalier universitaire de Split. Tout le matériel fœtal acquis a été examiné par un pathologiste, et seuls les tissus sans signes d'anomalies, de macérations ou de mort intra-utérine et avec un caryogramme normal ont été utilisés pour l'étude. Les dossiers médicaux des mères ont été examinés avant le prélèvement de l'échantillon et en cas de problèmes de santé susceptibles d'influencer l'issue de la grossesse, les tissus rénaux ont été exclus de l'étude. La maturité était déterminée par le périmètre crânien, le périmètre abdominal et la longueur du fémur [51] en corrélation avec les calendriers menstruels des patientes. Des échantillons de tissus rénaux âgés de 1,5- et 7- ans ont été prélevés après des décès accidentels. Les échantillons ont été obtenus au Département de Pathologie du Centre Hospitalier Universitaire de Split. Les échantillons de tissus rénaux dysplasiques multikystiques (MCDK) ont été obtenus après une perte de grossesse, une glomérulosclérose segmentaire focale (FSGS) et un syndrome néphrotique de type finlandais (CNF) ont été obtenus par néphrectomie. Tout le matériel acquis a été examiné et évalué par un pathologiste, qui a classé les diagnostics. Le protocole d'étude a été approuvé par le comité d'éthique de la faculté de médecine de l'université de Split (20 mai 2016) conformément à la déclaration d'Helsinki et à ses mises à jour (numéro de classification : 003-08/16-03/0001, n° de registre : 2181-198-03-04-16-0024, 20 mai 2016) [52].

4.2. Immunohistochimie

La fixation des échantillons de tissus collectés a été traitée avec du paraformaldéhyde à 4% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 24 h à 22 ◦C. Après déshydratation dans de l'éthanol à 100 %, les échantillons ont été inclus dans de la paraffine, comme décrit précédemment [53]. Les spécimens ont été découpés en sections de 5 µm d'épaisseur à l'aide d'un microtome et ensuite montés sur des lames de microscope. Afin de vérifier la préservation des tissus, une section sur 10 a été colorée à l'hématoxyline et à l'éosine [54]. La féminisation et l'immunohistochimie ont été effectuées comme décrit précédemment [2, 55, 56]. Après rinçage dans du PBS, les lames de microscope ont été incubées pendant une nuit avec des anticorps primaires dans une chambre humide à 22 ◦C (système de coloration de lames StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Les anticorps primaires utilisés étaient l'anticorps monoclonal de lapin anti-alpha tubuline (dilution 1:1000 ; ab179484, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), l'anticorps polyclonal anti-inversion de lapin (dilution 1:100 ; ab65187, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), le DVL monoclonal de souris -1 (dilution 1:150 ; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) et anticorps polyclonal de lapin anti-tubuline gamma (afin de vérifier la coloration primaire spécifique des cils avec alpha- tubuline, dilution 1:500 ; ab11321, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni). Après rinçage dans du PBS, des anticorps secondaires ont été administrés pendant une heure comme listés : âne anti-lapin IgG H&L, Alexa Fluor 488 (dilution 1:400 ; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) et chèvre anti-souris IgG H&L, TRITC (dilution 1:400 ; ab6786, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) 4',6-diamidino-2-dihydrochlorure de phénylindole (DAPI) a été utilisé pour la coloration des noyaux et après une incubation de 2-min, les lames ont été lavés dans du PBS et recouverts de milieu de montage et de lamelles. La coloration non spécifique a été empêchée en utilisant un bloc protéique (ab64226 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) avant l'application d'anticorps primaire. En tant que contrôle négatif, un test de pré-adsorption a été effectué, tandis que la spécificité des anticorps secondaires a été vérifiée en omettant les anticorps primaires des procédures de coloration.

4.3. Microscopie électronique

Fixation deun reintissus a été réalisée dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h, suivie d'une post-fixation dans du tétroxyde d'osmium à 1 % pendant 1 h. Le processus de déshydratation a été réalisé avec une série d'éthanol et terminé par un enrobage dans de la résine LX 112 [22]. Des sections minces d'un micromètre ont été colorées à l'aide de bleu de toluidine et étudiées pour sélectionner des sections ultrafines. Des coupes ultrafines d'une épaisseur de 0.05 micromètres ont été examinées après coloration avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb. Le microscope JEOL 1200 EX a été utilisé pour obtenir les microphotographies.

4.4. Analyse génétique

Comme décrit précédemment [19], en utilisant des leucocytes du sang périphérique, l'ADN génomique a été extrait. Une mutation homozygote faux-sens du gène NPHS1 a été retrouvée (c.1096A > C ; p.Ser366Arg) ce qui a confirmé le diagnostic de syndrome néphrotique congénital de type finlandais (CNF) [57].

CISTANCHE AMÉLIORE L'INFECTION RÉNALE/RÉNALE

4.5. L'analyse des données

L'analyse de section a été réalisée sur un microscope à fluorescence FL utilisant 3 canaux de fluorescence FL (Olympus BX51, Tokyo, Japon). Les images ont été capturées par un appareil photo numérique DP71 (Olympus, Tokyo, Japon) avec un grossissement à haute puissance (×40). Seulement lerénalcortex contenant des tubules contournés proximaux (pct), des tubules contournés distaux (dct) et des glomérules (g) étaient d'intérêt. Les images ont ensuite été traitées par le logiciel ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (consulté le 15 octobre 2018), 1997–2021. ) et Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Californie, États-Unis) pour une évaluation plus approfondie. Avant le comptage des cellules, l'outil ImageJ à canaux divisés a été utilisé. Ensuite, la photo microscopique d'immunofluorescence d'origine a été soustraite par le canal rouge ou vert (selon ce qu'était le canal d'origine) à l'aide de l'outil ImageJ du calculateur d'image pour éviter les fuites de signal. Les valeurs inférieures au seuil de 50 ont été considérées comme négatives. Nous avons compté les signaux immunoréactifs dans les cellules d'au moins 20 structures (pct, dct ou g) par stade ou nombre positif global de cellules par microphoto de dysplasie multikystiqueun reintissus, FSGS et CNF. Nous avons classé les cellules comme positives si le signal d'immunofluorescence s'accumulait à n'importe quel niveau de la membrane, du cytoplasme ou du noyau au-dessus de la valeur 50 mesurée sur le logiciel ImageJ à l'aide de la commande de seuil. Les cellules négatives ont été classées comme des cellules sans aucune immunoréactivité. Deux enquêteurs indépendants ont analysé les données.

4.6. Analyse semi-quantitative

L'intensité du signal de coloration -tubuline, inversion et DVL-1 a été évaluée par deux chercheurs indépendants à l'aide du logiciel ImageJ. L'intensité globale du signal a été mesurée après que l'image a été définie dans le type 8-bit ; ensuite, l'intensité de la coloration du marqueur a été évaluée en 20 pct, dct et g en mesurant la zone délimitée de la structure. Si les résultats entre les évaluateurs étaient différents, un troisième chercheur indépendant a clarifié le doute. L'intensité maximale du signal pour la -tubuline était de 84,125 ± 3,214 SD, pour l'inversion était de 71,50 ± 2,715 SD et pour DVL-1 80.916 ± 1,875 SD. La saturation la plus élevée de la couleur du signal sur les photographies au microscope a été marquée comme 3 (66,66 à 99,99 % de l'intensité globale de l'image du signal), suivie de 2 (33,33 à 66,66 %) pour l'intensité intermédiaire du signal et de 1 (0,33 % à 33,33 % ) pour une faible intensité de signal (tableau 1.).

4.7. Analyses statistiques

Pour la détermination des différences entre les étapes et les structures, le test de Kruskal-Wallis a été effectué, suivi du post hoc de Dunn à l'aide du logiciel GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego California, USA, www.graphpad.com (consulté le 15 octobre 2018.)). Le nombre de cellules positives a été exprimé en pourcentage sous forme de valeur moyenne ± écart type (SD), tandis que la signification statistique a été reconnue à p < 0,05.="" le="" nombre="" de="" structures="" analysées="" était="" de="" 4200="" dans="" 35="" échantillons,="" avec="" un="" nombre="" total="" de="" 135="" 256="" cellules="" comptées.="" nous="" avons="" utilisé="" 2-way="" anova="" avec="" le="" test="" post="" hoc="" de="" sidak="" pour="" tester="" les="" différences="" d'expression="" de="" -tubuline,="" d'inversion="" et="" de="" dvl-1="" à="" différents="" stades="" de="" développement.="" pour="" étudier="" l'expression="" des="" protéines="" concernant="" le="" temps="" de="" développement,="" nous="" avons="" utilisé="" la="" régression="" linéaire.="" l'anova="" unidirectionnelle="" suivie="" du="" test="" post="" hoc="" de="" tukey="" a="" été="" utilisée="" pour="" explorer="" les="" différences="" d'expression="" de="" la="" -tubuline,="" de="" l'inversion="" et="" de="" la="" dvl-1="" chez="" les="" sujets="">un reintissu par rapport aux tissus de MCDK, FSGS et CNF. Les différences d'expression des protéines entre MCDK, FSGS et CNF ont été étudiées avec 2-way ANOVA suivi du test post hoc de Sidak. Une ANOVA à une voie suivie du test post hoc de Tukey a été utilisée pour évaluer les différences de longueur des cils et de hauteur des cellules épithéliales du pct entre le contrôle sain et pathologique.un reintissus. Les données ont été présentées sous forme de valeur moyenne ± écart type (SD) avec une différence statistique reconnue à p <>