AbstraitLes activités anti-inflammatoires cutanées des extraits de pétales de rose ont été décrites dans notre précédente étude. Parce que l'inflammation cutanée est étroitement liée au vieillissement cutané, notre étude a étudié les effets des pétales de Rosa gallica sur les activités liées au vieillissement cutané telles que le blanchiment de la peau et les propriétés anti-rides. Chaque échantillon a été préparé par extraction en utilisant différents ratios d'éthanol pour évaluer les conditions d'extraction optimales pour les applications industrielles. L'extrait aqueux à 50 % (v/v) EtOH du pétale de R. gallica a supprimé de manière significative l'activité de la tyrosinase, la production de mélanine et la métalloprotéinase matricielle induite par les UV solaires -1, une caractéristique de la formation des rides. De plus, l'extrait aqueux à 50 % (v/v) d'EtOH a montré l'effet antioxydant le plus élevé et avait la teneur en flavonoïdes la plus élevée, ce qui correspond aux effets anti-âge rapportés. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent que les extraits de pétales de R. gallica présentent des effets anti-âge. De plus, l'extraction d'EtOH à 50%, en particulier, était optimale pour les effets anti-âge et antioxydants les plus élevés ainsi que pour obtenir la teneur en flavonoïdes la plus élevée.

Selon des études pertinentes, le cistanche est une herbe commune connue comme "l'herbe miracle qui prolonge la vie". Son composant principal est le cistanoside, qui a divers effets tels que la promotion de la fonction antioxydante, anti-inflammatoire et immunitaire. Le mécanisme entre le cistanche et le blanchiment de la peau réside dans l'effet antioxydant des glycosides du cistanche. La mélanine dans la peau humaine est produite par l'oxydation de la tyrosine catalysée par la tyrosinase, et la réaction d'oxydation nécessite la participation d'oxygène, de sorte que les radicaux sans oxygène dans le corps deviennent un facteur important affectant la production de mélanine. Cistanche contient du cistanoside, qui est un antioxydant et peut réduire la génération de radicaux libres dans le corps, inhibant ainsi la production de mélanine.

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Mots clésRosa gallica Vieillissement cutané Flavonoïde Effet antioxydant

Introduction

La peau joue un rôle vital en tant que barrière protectrice contre les facteurs nocifs associés à l'hérédité et à la génétique, les problèmes environnementaux, les changements hormonaux et les processus métaboliques (Mukherjee et al., 2006). Parmi ceux-ci, les facteurs environnementaux, tels que l'exposition aux rayons ultraviolets (UV) solaires, agissent comme des médiateurs clés qui contribuent au vieillissement prématuré (Laga et Murphy, 2009). Les principaux symptômes du vieillissement cutané, qui résultent du photo-vieillissement, comprenaient des rides profondes, une pigmentation anormale et une élasticité (Farage et al., 2013 ; Wlaschek et al., 2001).

La pigmentation est un symptôme du vieillissement, qui est causé par une production anormale de mélanine, entraînant une variété de troubles cutanés, notamment des taches de rousseur, du mélasma, des taches de vieillesse et d'autres syndromes d'hyperpigmentation (D'Mello et al., 2016 ; Seo et al., 2003). Dans la voie de la mélanogénèse, la tyrosinase est importante en tant qu'enzyme limitant la vitesse qui convertit la L-tyrosine en L-DOPA et oxyde la L-DOPA pour former la DOPA-quinone (Akhtar et al., 2015). Par conséquent, l'inhibition de la tyrosinase est fortement associée à la synthèse de mélanine. De plus, la formation de rides, causée par la perte de fibrilles de collagène et d'élastase, est une autre caractéristique du photovieillissement. La métalloprotéinase matricielle-1 (MMP-1), sécrétée par les fibroblastes cutanés humains, est principalement responsable de la dégradation du collagène au cours du processus de photovieillissement (Pandel et al., 2013). La régulation à la baisse de l'expression de MMP-1, qui inhibe la dégradation du collagène, peut améliorer les fonctions d'amélioration des rides.

Pour les raisons énoncées ci-dessus, l'utilisation d'inhibiteurs de tyrosinase ou d'inhibiteurs de MMP est considérée comme une stratégie prometteuse pour atténuer le photo-vieillissement cutané. Des études antérieures ont indiqué que le rétinol, l'extrait d'ail (acide de caféine et S-ally cystéine) et le phytocéramide, l'acide kojique, l'arbutine et la vitamine C peuvent agir comme inhibiteurs du vieillissement cutané (Couteau et Coiffard, 2016 ; Kim et al., 2013) . Cependant, l'utilisation de ces substances implique certaines limitations telles que divers effets secondaires dont la cytotoxicité, l'odeur et la coloration (Yamakoshi et al., 2003). Par conséquent, les études actuelles se concentrent sur le développement de composants plus sûrs, d'origine naturelle, qui confèrent une photoprotection cutanée efficace.

Les espèces de Rosa, cultivées dans le monde entier, sont considérées comme une bonne source de compléments alimentaires. Il a été rapporté que l'extrait de pétale de rose (RPE), qui contient des éléments tels que l'acide phénolique, les flavonols et les anthocyanes, présente de nombreux effets bénéfiques, tels que des activités anti-inflammatoires cutanées, en plus d'autres rôles biologiques (Bitis et al., 2 017 ; Lee et al., 2018 ; Masek et al., 2017 ; Navarro-Gonzalez et al., 2015). Parce que ces propriétés du RPE sont connues pour être liées au vieillissement cutané, il a été proposé comme candidat potentiel pour la protection de la peau. Cependant, on sait peu de choses sur l'effet de l'EPR sur le vieillissement cutané. De plus, l'eau et l'éthanol sont considérés comme les meilleurs solvants d'extraction en raison des différences de polarité et de la sécurité d'utilisation (Abarca-Vargas et al., 2016). Ainsi, des échantillons avec différents ratios d'eau et d'éthanol (0, 10, 30, 50, 70, 90 et 100 % d'éthanol RPE) ont été préparés par extraction.

Le but de cette étude était d'étudier l'effet de l'EPR sur le blanchiment de la peau et l'amélioration des rides. Des extraits de RPE avec différents ratios de solvants d'extraction (0, 10, 30, 50, 70, 90 et 100 % de solvants éthanol/eau) ont été testés pour déterminer le ratio de solvant optimal pour l'extraction.

Matériels et méthodes

Réactif

Les pétales de Rosa gallica ont été importés de Turquie via GN Bio (Gyeonggi, Corée). Le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), le sérum fœtal bovin (FBS), la pénicilline-streptomycine-néomycine et 0.5 % de trypsine-EDTA ont été achetés auprès de GIBCO Invitrogen (Auckland, Nouvelle-Zélande, États-Unis). Des anticorps spécifiques contre la tyrosinase et la b-actine ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA). L'anticorps primaire de MMP-1 a été obtenu à partir de systèmes de R&D. Tous les autres produits chimiques, y compris l'hormone de stimulation des alpha-mélanocytes (a-MSH), la tyrosinase de champignon et la L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphénylalanine) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Co., LLC (St .Louis, MO, États-Unis).

La préparation des échantillons

Des pétales de rose ont été mélangés avec 100 ml d'EtOH (éthanol absolu) à 0, 10, 30, 50, 70, 90 et 100 % (v/v). Les composants solubles ont ensuite été extraits dans de l'eau à 80 degrés en utilisant un condenseur à reflux. L'extrait a été filtré à travers du papier filtre numéro 2 (Whatman, Maidstone, Angleterre), concentré sous vide, puis dissous dans de l'eau distillée et lyophilisé, pour être utilisé comme échantillons pour le test d'analyse fonctionnelle.

Culture de cellules

Les cellules de mélanome B16F10 ont été achetées auprès de la Korean Cell Line Bank (Séoul, Corée). Des cellules de fibroblastes dermiques humains (HDF) ont été obtenues auprès du Dr Jin Ho Chung (Collège de médecine, Université nationale de Séoul, Séoul, Corée). Les deux cellules ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (v/v) et de 1 % (v/v) de pénicilline dans des conditions de 37 degrés et 5 % de CO2.

Viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été mesurée via MTS [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-({{7 }}sulfophényl)-2H-tétrazolium]. Les cellules ont été ensemencées sur des plaques 96-puits et cultivées jusqu'à confluence. Ensuite, les cellules ont été privées de DMEM sans sérum pendant une nuit et traitées avec les échantillons aux concentrations indiquées pendant 24 h. Après exposition aux échantillons, 20 ul de solution MTS ont été autorisés à réagir avec les cellules pendant 1 h. L'absorbance a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Sunrise-Basic Tecan, Tecan Austria GmbH Gro¨dig, Autriche) à 570 nm.

Activité tyrosinase de champignon in vitro

Le dosage in vitro de la tyrosinase a été effectué selon les méthodes décrites précédemment (Kim et al., 2015). En bref, 40 lL de chaque échantillon ont été ajoutés au tampon de dosage (20 lL de phosphate de potassium 0,1 M), suivis d'une incubation de 30 min avec 20 lL de tyrosinase de champignon (0,02 mg/mL). Ensuite, 40 ul de substrat (L-DOPA) ont été ajoutés à chaque mélange. La réaction a été laissée se dérouler à température ambiante pendant 15 minutes avant que la formation de dopachrome ne soit analysée en mesurant l'absorbance à 475 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Infinite 2000 PRO, Tecan, Suisse).

Évaluation de la production de mélanine

Le test de production de mélanine a été réalisé selon le protocole précédemment décrit (Friedmann et Gilchrest, 1987 ; Gordon et al., 1989). Des cellules B16F10 (8 9 103 cellules) ont été ensemencées sur des plaques 6-puits avec 2 ml de milieu de culture. Après 24 h, les échantillons ont été prétraités avec les cellules pendant 1 h, après quoi l'a-MSH (100 nM) a été exposée aux cellules. Les cellules ont été collectées après 72 h et la production de mélanine a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Infinite 2000 PRO, Tecan, Suisse) à 495 nm.

Western blot

Des échantillons de protéines ont été obtenus à partir de cellules, en utilisant du tampon de lyse cellulaire 19 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). La concentration en protéines a été estimée à l'aide d'un kit d'analyse de protéines PierceTM BCA (Thermo Fisher Scientific, San Jose´, CA, USA). Les échantillons de protéines ont été chargés sur un gel de polyacrylamide-SDS à 10 % (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Californie, États-Unis) pour l'électrophorèse, puis transférés sur une membrane Immobilon P (Millipore, Billerica, MA, États-Unis). La membrane PVDF a été bloquée avec du lait écrémé à 5 % pendant 1 h et la membrane a été traitée avec un anticorps primaire spécifique pendant une nuit à 4 degrés. Les bandes protéiques ont été détectées à l'aide d'un kit de détection par chimiluminescence (GE Healthcare, NJ, USA) après hybridation avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP (Cell Signaling).

Essai de piégeage des radicaux DPPH

L'activité de piégeage des radicaux DPPH a été mesurée comme suit; {{0}} 0,2 ml de chacun des extraits ont été ajoutés à 3 ml d'éthanol, auxquels 0,8 ml de DPPH 400 lM dissous dans de l'éthanol a été ajouté. Ce mélange a été vortexé pendant 10 s et maintenu à température ambiante pendant 10 min, et l'absorbance a été mesurée à 517 nm (Wang et al., 1999). L'activité de piégeage des radicaux DPPH a été exprimée en pourcentage de l'absorbance du groupe auquel aucun DPPH n'a été ajouté. Toutes les expériences ont été répétées au moins 3 fois.

Teneur totale en flavonoïdes

La teneur totale en flavonoïdes des extraits a été mesurée à l'aide de la méthode au chlorure d'aluminium (Jia et al., 1999) qui a été modifiée à l'aide de catéchine. A 100 ul de l'extrait, 500 ul d'eau distillée et 30 ul de NaNO2 ont été ajoutés, après quoi 60 ul d'AlCl3 ont été ajoutés 6 minutes plus tard. Au bout de 5 minutes, 200 ul de NaOH 1 M ont été ajoutés et portés à 1 ml avec de l'eau distillée. La solution a été bien mélangée et centrifugée à 15 928 g, à 4 degrés, pendant 5 min. Après centrifugation, 200 ul du surnageant ont été obtenus et l'absorbance a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Infinite 2000 PRO ; Tecan, Suisse) à 510 nm.

analyses statistiques

Les expériences ont été menées en triple exemplaire et les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart type (SD). Les tests t de Student ont été utilisés pour des comparaisons statistiques simples. La signification statistique a été fixée à (#) {{0}} p\ 0.05 et (##)=p\ 0.001 pour comparaison avec le témoin non traité; (*)=p \ 0,05 et (**)=p \ 0,001 pour comparaison avec le groupe traité par a-MSH.

Résultats et discussion

Extraction des pétales de Rosa gallica selon différents taux de solvant

Auparavant, le RPE était produit par extraction aqueuse à 70 % (v/v) d'EtOH (Lee et al., 2018). Cependant, si le RPE est destiné à des fins d'application industrielle, les conditions d'extraction doivent être optimales. Afin d'étudier les conditions d'extraction optimales du RPE pour l'activité anti-vieillissement de la peau, divers solvants ont été utilisés pour le RPE (Fig. 1A). Fait intéressant, la couleur de chaque extrait variait, en fonction de l'observation visuelle (Fig. 1B). La couleur des extraits EtOH, à 90 % ou plus, était claire, tandis que l'extrait EtOH à 50 % (v/v) semblait être le plus rougeâtre. Le résultat du colorimètre a révélé une valeur a * pour la rougeur pour EtOH à 50%, qui a montré le niveau le plus élevé parmi les extraits (Fig. 1C).

Effet des extraits de pétale de rose sur l'activité blanchissante de la peau

La tyrosinase étant une enzyme clé impliquée dans l'hyperpigmentation via la production de mélanine (Chang, 2009), nous avons analysé l'effet inhibiteur des extraits sur l'activité de la tyrosinase in vitro. La plupart des extraits, à l'exception de 100% EtOH, ont révélé une régression dose-dépendante sur l'activité de la tyrosinase in vitro (Fig. 2A). De plus, les extraits EtOH à 30% et 50% ont montré des effets inhibiteurs plus forts que l'acide ascorbique. L'acide ascorbique a été décrit comme agent de blanchiment de la peau dans la littérature précédente (Chang, 2009). Pour évaluer l'activité de blanchiment de la peau des extraits dans un modèle cellulaire, la production de mélanine a été évaluée dans les cellules de mélanome B16F10 après traitement avec chaque extrait. Une portion de 100 nM d'a-MSH a augmenté la production de mélanine et chaque extrait de pétale de rose a inhibé la production de mélanine (Fig. 2B). De plus, les extraits d'EtOH à 30% et 50% ont montré l'effet inhibiteur le plus fort sur l'activité de la tyrosinase et la production de mélanine in vitro, respectivement. Dans des conditions similaires, l'effet de chacun des extraits sur l'expression de la tyrosinase a été examiné. De plus, l'a-MSH a augmenté l'expression de la tyrosinase et 100 µg/mL de chacun des extraits ont atténué l'expression de la tyrosinase (Fig. 2C). Le traitement avec des extraits à 100 µg/mL n'a pas provoqué de cytotoxicité cellulaire dans les cellules de mélanome B16F10 (Fig. 2D). Ainsi, l'inhibition de la mélanine par le RPE est attribuée à la double fonction de l'activité tyrosinase et de l'expression de l'absence de cytotoxicité.

Effet du RPE sur l'expression de MMP -1 induite par les UV solaires (sUV) dans les fibroblastes dermiques humains

Les inhibiteurs de MMP-1 peuvent être considérés comme des agents anti-rides (Park et al., 2018 ; Yang et al., 2018). En effet, la MMP-1 est une enzyme clé, responsable de la formation des rides au cours du processus de vieillissement cutané (Pittayapruek et al., 2016). Pour déterminer les effets anti-rides de l'EPR, l'expression de MMP-1 a été évaluée dans des fibroblastes dermiques humains à l'aide d'une analyse Western blot. L'expression de MMP-1 a été considérablement augmentée par l'irradiation sUV (30 kJ/cm2) et tous les extraits ont inhibé l'expression de MMP-1 induite par sUV (Fig. 3A). Alors que les extraits à 100 % d'EtOH présentaient un effet doux, les extraits à 50 % d'EtOH présentaient l'activité de suppression la plus forte sur l'expression de MMP -1 induite par les UV. Ensuite, nous avons étudié les niveaux de production de MMP-1 dans les milieux de culture, car le MMP-1 est une protéine sécrétée pour la dégradation du collagène. Semblable à celui illustré à la Fig. 3A, le niveau de MMP -1 dans les milieux de culture a été supprimé par chaque extrait (Fig. 3B). En particulier, l'extrait d'EtOH à 50 % a montré l'activité suppressive la plus élevée sur l'expression de MMP-1 induite par les UV, et l'extrait d'EtOH à 100 % a montré un effet doux par rapport à celui d'autres extraits.

Activité anti-oxydante et teneur totale en flavonoïdes des extraits de pétales de rose

Les antioxydants qui inhibent la production de ROS sont connus pour réduire l'hyperpigmentation ou empêcher la production de mélanine induite par les UV (Yamakoshi et al., 2003). L'activité de piégeage des radicaux DPPH a été déterminée pour comparer l'activité antioxydante des extraits. Fait intéressant, chaque extrait a montré une activité radicale, dose-dépendante, de piégeage des radicaux. Les échantillons de 500 lg/mL ont montré une activité anti-oxydante similaire à la vitamine C. Parmi les extraits, l'extrait d'EtOH à 50 % a montré l'effet anti-oxydant le plus fort à la concentration la plus faible (50 lg/mL) (Fig. 4A).

Il existe de nombreux composés différents tels que les terpènes, les flavonoïdes et les anthocyanes dans les pétales de rose (Knapp et al., 1998 ; Kumar et al., 2008 ; Oka et al., 1998 ; Schieber et al., 2005). Ces produits chimiques représentent de nombreuses activités biologiques (Kumar et al., 2009). En particulier, les flavonoïdes ont été décrits comme le principal groupe de composés phénoliques responsables des propriétés biologiques des effets antioxydants et anti-inflammatoires (Du et al., 2016 ; Jung et al., 2015). Ensuite, la teneur totale en flavonoïdes de chaque extrait a été mesurée. De grandes quantités de flavonoïdes étaient présentes dans chaque extrait (Fig. 4B). Les résultats ont indiqué que l'extrait d'EtOH à 50 % contenait la teneur en flavonoïdes la plus élevée parmi les échantillons. Cette tendance était similaire à celle observée dans le résultat du dosage antioxydant.

La couleur rouge foncé du solvant EtOH à 50% des pétales de rose est supposée être liée à l'anthocyanine, un flavonoïde (Fig. 1). Ce résultat corrobore les conclusions d'une étude précédente (Oancea et al., 2012). Selon l'étude précédente, les anthocyanes du bleuet (Vaccinium orymbosum L.) étaient mieux extraites dans un solvant EtOH à 50 % que dans tout autre solvant, y compris 60 %, 70 % et 80 % EtOH (Oancea et al., 2012). Naturellement, les anthocyanes se présentent sous forme de glycosides. Ainsi, nous avons supposé que la polarité des anthocyanes pouvait avoir été accordée par le solvant EtOH à 50 %. La forte activité anti-oxydante des anthocyanes est bien démontrée dans divers systèmes modèles (Kalt et al., 2003 ; RiceEvans et al., 1995). Étant donné que l'extrait de pétale de rose à 50 % d'EtOH avait la teneur en anthocyanes la plus élevée, l'activité anti-oxydante de l'extrait à 50 % d'EtOH était la plus forte parmi les extraits à 50 lg/mL.

En résumé, notre étude a démontré le potentiel du RPE comme ingrédient anti-vieillissement cutané. A des fins d'application industrielle, l'optimisation des conditions d'extraction est essentielle afin de réduire les coûts de production. L'étude actuelle a étudié les solvants les plus appropriés pour l'extraction des pétales de rose, en se référant à l'activité anti-vieillissement de la peau. Les flavonoïdes des pétales de rose ont été mieux extraits par le solvant EtOH à 50 %. Cet extrait a montré la plus forte activité anti-oxydante ainsi qu'une activité anti-vieillissement de la peau telle que le blanchiment de la peau et l'activité de suppression des rides. Des études cliniques et des analyses de stabilité peuvent être nécessaires pour tester son aptitude à une application industrielle.

RemerciementsCette recherche a été soutenue par le programme de recherche principal (E0183112-02) du Korea Research Food Institute (KFRI) financé par le ministère des Sciences, des TIC et de la planification future et par le Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture , des forêts et de la pêche (IPET) par le biais du programme de développement des technologies alimentaires à haute valeur ajoutée, financé par le ministère de l'Agriculture, de l'Alimentation et des Affaires rurales (MAFRA) (118060-03-2- HD020).

Respect des normes éthiques

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