Extraction de glycosides phényléthanoïdes de Cistanche Tubulosa par extraction d'homogénéisation par cisaillement à grande vitesse

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Wenjing Pei et Ruili Guo

Arrière plan:

Cistanche tubulosaest une médecine traditionnelle chinoise bien connue originaire du Xinjiang. Il est largement distribué en Afrique du Nord, en Inde, etc. Objectif : Le principal composant bioactif deC. tubulosasont des glycosides phényléthanoïdes (PhG). L'échinacoside et l'actéoside sont les composants indicatifs pour la détermination des PhG et sont principalement utilisés pour la protection du foie, la protection immunitaire, etc. Par conséquent, il est très important d'extraire les PhG de C. tubulosa. Méthodes : Dans cette étude, les méthodes d'extraction assistée par ultrasons (UAE), d'extraction assistée par micro-ondes (MAE) et d'extraction par homogénéisation par cisaillement à grande vitesse (HSHE) ont été comparées. De plus, les conditions d'extraction de la méthode HSHE ont été optimisées. Résultats : les résultats ont montré que la méthode HSHE était meilleure que les méthodes UAE et MAE, et les paramètres d'extraction optimaux de HSHE étaient une concentration d'éthanol de 50 %, une température d'extraction de 70 degrés, une vitesse de rotation de 16000 tr/min, un temps d'extraction de 2 min, un rapport solide-liquide de 1:9 et un cycle d'extraction. Les rendements de l'échinacoside et de l'actéoside étaient de 1,366 et 0,519 %, respectivement, et les taux de transfert de l'échinacoside et de l'actéoside ont atteint 87 et 94 %, respectivement. Conclusions : On peut conclure que la méthode HSHE est une technique simple, rapide et efficace pour extraire les PhG de C. tubulosa. Faits saillants : Une méthode HSHE efficace et respectueuse de l'environnement a été étudiée pour l'extraction des PhG de C. tubulosa. Les conditions optimales de la méthode HSHE pour l'extraction des PhG de C. tubulosa ont été obtenues. Cette recherche fournit une nouvelle méthode pour l'extraction industrielle des PhG à partir deC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaest une médecine traditionnelle chinoise courante originaire du Xinjiang. Il est largement distribué en Afrique du Nord, dans la péninsule arabique, au Pakistan et en Inde et a été officiellement enregistré dans la pharmacopée chinoise en 2010. Le principal composant bioactif deC. tubulosasont des glycosides phényléthanoïdes (PhG), une classe de produits naturels solubles dans l'eau comprenant l'échinacoside, l'actéoside, l'isoactéoside et le 2-acétylactéoside (1, 2). La structure des PhG consiste en des fragments d'acide cinnamique et d'hydroxyphényléthyle, qui sont tous deux attachés à un -glucopyranose par des liaisons ester et glycosidique, respectivement (3). Des études pharmacologiques ont montré que les PhG de C. tubulosa ont de nombreuses fonctions médicinales, telles que des effets antifatigue (4), neuroprotecteurs (5–7), protecteurs du foie (8–10) et immunoprotecteurs (11). Par conséquent, l'extraction efficace des PhG de C. tubulosa est d'une grande importance pour le développement et l'utilisation de produits naturels.

Les méthodes d'extraction traditionnelles actuelles des PhG sont l'extraction par reflux chaud, l'extraction assistée par ultrasons (UAE) et l'extraction assistée par micro-ondes (MAE ; 12-16). Ces méthodes présentent différents inconvénients, tels qu'une faible efficacité, de longs temps d'extraction et des coûts élevés. Par rapport aux méthodes traditionnelles, la méthode d'extraction par homogénéisation par cisaillement à grande vitesse (HSHE) est une nouvelle méthode d'extraction émergente et présente les avantages de temps d'extraction plus rapides, de moins de déchets de solvant, de rendements plus élevés, d'un dispositif plus simple et d'une opération plus facile (17). Le principe de fonctionnement de la méthode HSHE est basé sur une fraise intérieure rotative entraînée par un moteur à grande vitesse. Une puissante force de cisaillement est produite par les couteaux intérieur et extérieur pour perturber et mélanger les échantillons. Pendant ce temps, le couteau à rotation à grande vitesse provoque des différences de pression entre les cavités interne et externe du couteau, entraînant un transfert de masse entre les échantillons et les solvants. Avec la combinaison d'une force de cisaillement élevée, d'une force de collision, d'une pression et d'autres forces, un équilibre soluble entre les échantillons solides et les solvants peut être rapidement atteint (18). Ainsi, le processus d'extraction de HSHE peut être achevé en quelques minutes, voire en quelques dizaines de secondes (19-22).

Récemment, HSHE a été exploré dans l'extraction de composants bioactifs à partir de divers produits naturels (23-25). Cheng et al. utilisé HSHE pour extraire cinq lignanes du fruit de Schisandra Chinensis (26). Les résultats ont montré que les conditions optimales étaient une concentration d'éthanol de 75 %, un temps d'extraction de 1 min, un rapport solide-liquide de 1:19, une tension d'extraction de 18 0 V et une particule d'échantillon taille de 120 mailles. Le rendement total des cinq lignanes était de 13,89 ± 0,014 mg/g dans les conditions optimisées. Tang et al. utilisé HSHE pour obtenir de l'huile bioactive à partir de graines de périlla (27). Les conditions optimales étaient un temps d'extraction de 2 min, un rapport solide-liquide de 1:10, une tension d'extraction de 150 V et deux cycles d'extraction. Le rendement en huile de graine de périlla a atteint 59,3 pour cent. Les résultats ci-dessus indiquent que HSHE présente les avantages de temps d'extraction courts, de faibles coûts et de rendements élevés. Cependant, il y a un manque de recherche sur l'extraction des PhG par HSHE.

Dans la présente étude, HSHE a été utilisé pour explorer son application potentielle dans l'extraction de PhG à partir deC. tubulosa. Le rendement en PhG a été déterminé par HPLC. Les trois méthodes d'extraction, HSHE, UAE et MAE, ont été comparées dans les mêmes conditions. Les effets de la concentration d'éthanol, de la température d'extraction, de la vitesse de rotation, du temps d'extraction, du rapport solide-liquide et du nombre de cycles d'extraction du rendement ont été étudiés. Les avantages et les inconvénients de ce travail et des références sont comparés et discutés.

Matériaux et méthodes

Matériel et réactifs chimiques

C. tubulosaa été acheté auprès de Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, Chine). Les étalons d'échinacoside (puresté supérieure ou égale à 98 %) et d'actéoside (pureté supérieure ou égale à 98 %) ont été achetés auprès de Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Shanghai, Chine). L'acétonitrile, le méthanol et l'acide acétique étaient de qualité HPLC (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). L'éthanol de qualité analytique a été acheté auprès de Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, Chine). De l'eau déminéralisée a été utilisée tout au long des expériences.

Analyse CLHP

Une analyse HPLC a été réalisée sur une chromatographie liquide Waters e2695 (Waters, Milford, MA) équipée d'un détecteur UV/Visible 2489 et d'une colonne Symmetry C18 (Waters), 250 × 4,6 mm, granulométrie 5 μm. Les concentrations d'échinacoside et d'actéoside ont été analysées par la méthode HPLC. La phase mobile consistait en (1) de l'acétonitrile et (2) une solution aqueuse d'acide acétique glacial à 2 %. Le programme d'élution par gradient est présenté dans le tableau 1.

La longueur d'onde détectée était de 330 nm, le débit était de 1 mL/min, le volume d'injection était de 10 μL et la température du four était fixée à 30 degrés. Le pic chromatographique de l'analyte a été confirmé en comparant son temps de rétention avec celui des étalons. La quantification a été réalisée en intégrant le pic à l'aide d'une méthode d'étalon externe.

Le test de précision a été réalisé en injectant cinq fois les mêmes échantillons d'extraction. Pour le test de stabilité, les mêmes échantillons ont été analysés par incréments de 0, 1, 2, 4, 12, 24 et 48 h. Les tests de récupération de l'échinacoside et de l'actéoside ont été réalisés en ajoutant les standards dans les échantillons d'extraction. Toutes les aires des pics et les temps de rétention de l'échinacoside et de l'actéoside ont été enregistrés. Les résultats des courbes d'étalonnage pour l'échinacoside et l'actéoside sont répertoriés dans le tableau 2.

Calcul du rendement

L'échinacoside et l'actéoside ont été utilisés comme composants indicatifs pour la détermination des PhG. Le rendement en échinacoside ou en actéoside a été calculé à l'aide de l'équation suivante :

Y=CV/W×100 % (1)

où Y=rendement d'échinacoside ou d'actéoside (pourcentage) ; C=concentrations d'échinacoside ou d'actéoside (mg/mL); V=volume de la solution d'extraction (mL) ; et W=poids de la poudre de C. tubulosa (mg).

Méthodes d'extraction des PhG

Les tiges de C. tubulosa ont d'abord été broyées par un broyeur électrique (JC-500g ; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Chine) et filtrées par un tamis filtrant (environ 380 μm). Ensuite, la poudre de C. tubulosa a été séchée au four à 70 degrés jusqu'à ce que le poids soit constant. Cinq grammes de poudre de C. tubulosa ont été mélangés avec le solvant d'extraction et placés dans une bouteille d'extraction. Ensuite, le mélange liquide a été préchauffé (de 30 à 80 degrés) pendant 5 minutes dans un bain-marie à température constante (DF-101S ; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Chine).

(a) Méthode HSHE.—HSHE a été réalisée par un système FA25 (FLUKO Co., Ltd, Shanghai, Chine), composé d'un couteau rotatif, d'un moteur à grande vitesse et d'un contrôleur. La vitesse de rotation du couteau interne a été régulée dans la plage de 10 000 à 28 000 tr/min et les temps d'extraction ont été ajustés dans la plage de 2 à 15 min.

(b) Méthode UAE.—Cinq grammes d'échantillon séché et 300 ml de méthanol ont été pesés avec précision et ajoutés dans une bouteille d'extraction. La bouteille d'extraction a été immergée dans un bain à ultrasons et réalisée à une puissance ultrasonore de 300 W pendant 10 min. La température d'extraction a été fixée à 30 degrés.

(c) Méthode MAE.—Cinq grammes d'échantillon séché et 300 ml de méthanol ont été pesés avec précision et ajoutés dans une bouteille d'extraction. La bouteille d'extraction a été placée dans le réacteur à micro-ondes et réalisée à 180 W pendant 10 min. La température d'extraction a été fixée à 30 degrés.

La méthode HSHE a été comparée aux méthodes UAE et MAE avec le même solvant d'extraction, le même temps d'extraction, la même température d'extraction, le rapport solide-liquide et le même nombre de cycles d'extraction. La solution d'extraction a été filtrée par une membrane 0.22 μm et analysée par HPLC pour déterminer les concentrations d'échinacoside et d'actéoside. Tous les processus d'extraction ont été répétés trois fois

Détermination des taux de transfert

Sur la base de la méthode standard de la pharmacopée chinoise 2015, les teneurs en échinacoside et en actéoside de la poudre de C. tubulosa ont été déterminées (28). Un gramme de poudre de C. tubulosa et 50 ml de méthanol à 50 % ont été pesés avec précision et ajoutés dans une fiole jaugée brune de 50 ml. Le mélange liquide a été pesé et trempé pendant 30 min. Ensuite, la fiole jaugée marron a été immergée dans un bain à ultrasons et réalisée à une puissance ultrasonore de 250 W et une fréquence de 35 kHz pendant 40 min. Le mélange liquide a été pesé à nouveau et 50 % de méthanol ont été ajoutés pour fournir la perte de solvant. La solution d'extraction a été filtrée par une membrane de 0,22 µm et a été analysée par HPLC pour déterminer les concentrations d'échinacoside et d'actéoside. Les processus d'extraction ont été répétés trois fois.

Les taux de transfert de l'échinacoside ou de l'actéoside ont été calculés à l'aide de l'équation suivante :

X= M1/M2 × 100 % (2)

où X=taux de transfert de l'échinacoside ou de l'actéoside (pourcentage) ; M1=qualité de l'échinacoside ou de l'actéoside dans l'extrait (mg) ; et qualité M2=de l'échinacoside ou de l'actéoside dans la poudre de C. tubulosa (mg).

Résultats et discussion

Validation de la méthode HPLC

Les profils HPLC de l'échinacoside et de l'actéoside de C. tubulosa à l'aide de HSHE sont illustrés à la figure 1. La RSD des zones de pic de l'échinacoside et de l'actéoside était de 1,89 et 1,40 %, respectivement. Les résultats ont montré que la méthode HPLC a une bonne précision dans l'analyse quantitative de l'échinacoside et de l'actéoside. À divers moments (0–48 h), les RSD des zones de pic d'échinacoside et d'actéoside étaient de 1,71 et 1,70 %, respectivement, indiquant que l'échantillon était stable en 48 h. La récupération de l'échinacoside et de l'actéoside était de 99,3 et 99,1 %, respectivement, et leur RSD était de 0,70 et 0,67 %, respectivement, ce qui a confirmé la fiabilité de la méthode HPLC.

Comparaison des différentes méthodes d'extraction

Une comparaison de la méthode HSHE avec les méthodes MAE et UAE concernant les rendements en échinacoside et en actéoside a été réalisée, dont les résultats sont présentés sur la figure 2. Il a été observé que les rendements en échinacoside et en actéoside obtenus par HSHE étaient supérieurs à ceux obtenus par le MAE et les EAU. Par rapport au MAE, les rendements en échinacoside et en actéoside obtenus par HSHE étaient supérieurs de 20,5 et 20,8 %, respectivement. Et par rapport aux EAU, les rendements en échinacoside et en actéoside obtenus par HSHE étaient supérieurs de 6,6 et 7,4 %, respectivement. Ces résultats indiquent que HSHE peut augmenter de manière significative les rendements en PhG.

Optimisation de la méthode HSHE

Les paramètres d'extraction des PhG par HSHE comprennent la concentration d'éthanol, la température d'extraction, la vitesse de rotation, le temps d'extraction, le rapport solide-liquide et le nombre de cycles d'extraction (26, 29).

Effet de la concentration d'éthanol sur l'extraction des PhG

La concentration en éthanol est un facteur important qui affecte les rendements en PhG. Comme le montre la figure 3, les rendements d'échinacoside et d'actéoside de C. tubulosa sous différentes concentrations d'éthanol ont été étudiés. Il a révélé que le rendement en échinacoside augmentait de 0 à 30 %, puis diminuait de 30 à 90 % avec l'augmentation des concentrations d'éthanol. Le rendement en actéoside a augmenté de 0 à 70 %, puis a diminué de 70 à 90 % avec l'augmentation des concentrations d'éthanol. Lorsque la concentration en éthanol était de 50 %, la somme des rendements en échinacoside et en actéoside était à son maximum. Les différentes concentrations d'éthanol ont des polarités différentes, ce qui conduit à des solubilités différentes de l'échinacoside et de l'actéoside. Ainsi, la concentration optimale d'éthanol était de 50 %.

Effet de la vitesse de rotation sur l'extraction des PhG

La figure 5 montre les effets de différentes vitesses de rotation sur les rendements de PhG. Les rendements en échinacoside et en actéoside augmentent avec l'augmentation des vitesses de rotation. L'augmentation de la vitesse de rotation peut augmenter la force de cisaillement de la fraise intérieure et extérieure, augmentant ainsi les rendements en PhG. La vitesse de rotation optimale était de 16 000 tr/min.

Effet du temps d'extraction sur l'extraction des PhG

Les rendements d'échinacoside et d'actéoside sous les différents temps d'extraction sont présentés à la figure 6. Les rendements d'échinacoside et d'actéoside étaient stables avec l'augmentation des temps d'extraction. On peut donc conclure que les PhG peuvent être complètement extraits de C. tubulosa en 2 min, et le temps d'extraction optimal était de 2 min.

Effet du rapport solide sur liquide sur l'extraction des PhG

Comme le montre la figure 7, les rendements de l'échinacoside et de l'actéoside sous les différents rapports solide-liquide ont été discutés. Les rendements en échinacoside et en actéoside sont passés de 1:3 à 1:9 et se sont stabilisés de 1:9 à 1:24. Parce qu'une petite quantité de solvant d'extraction ne peut pas dissoudre complètement l'échinacoside et l'actéoside, les taux de transfert de masse ont été réduits. L'extraction excessive de solvants provoquait des déchets inutiles. Par conséquent, le rapport solide/liquide optimal était de 1:9.

Effet du nombre de cycles d'extraction sur l'extraction des PhG

La figure 8 montre les effets d'un certain nombre de cycles d'extraction sur les rendements en PhG. Les rendements en échinacoside et en actéoside augmentent avec le nombre croissant de cycles d'extraction. Cependant, les temps d'extraction augmentaient remarquablement avec l'augmentation des cycles d'extraction, et plus d'énergie était consommée. Le nombre optimal de cycles d'extraction était de un.

Comparaison de la méthode HSHE avec d'autres méthodes d'extraction pour l'extraction des PhG

Les résultats de la méthode HSHE en comparaison avec d'autres méthodes d'extraction pour extraire les PhG de C. tubulosa sont répertoriés dans le tableau 3. HSHE est plus simple et plus facile que les méthodes de couplage telles que l'extraction aqueuse en deux phases assistée par ultrasons et la technologie d'extraction par micro-ondes ultrasonique. méthodes. De plus, la pression d'extraction de HSHE est inférieure à la méthode d'extraction liquide sous pression, et les conditions de fonctionnement de la première sont plus sûres. Plus important encore, on peut voir dans le tableau 3 que HSHE montre le temps d'extraction le plus court et la moindre consommation de solvant parmi toutes les méthodes d'extraction. On peut conclure que la méthode HSHE présente de nombreux avantages tels qu'un rendement élevé, des conditions de fonctionnement douces, de faibles niveaux de consommation, un équipement simple et une opération facile pour l'extraction de produits naturels.

conclusion

Dans cette étude, une méthode HSHE efficace et respectueuse de l'environnement a été étudiée pour l'extraction des PhG de C. tubulosa. Par rapport aux méthodes UAE et MAE, la nouvelle méthode HSHE produit un rendement plus élevé de PhG dans les mêmes conditions. Par rapport à la méthode MAE, les rendements en échinacoside et en actéoside ont été augmentés de 20,5 et 20,8 %, respectivement. Et par rapport aux Émirats arabes unis, les rendements en échinacoside et en actéoside ont été augmentés de 6,6 et 7,4 %, respectivement. Les paramètres d'extraction de HSHE de PhGs de C. tubulosa ont été optimisés. Selon les paramètres optimisés, les rendements d'échinacoside et d'actéoside ont atteint 1,366 et 0,519 %, respectivement, et les taux de transfert d'échinacoside et d'actéoside ont atteint 87 et 94 %, respectivement. La méthode HSHE présente les avantages d'une efficacité élevée, de conditions de fonctionnement douces, de faibles niveaux de consommation, d'un équipement simple, d'une utilisation facile et de faibles coûts. Cette recherche fournit une nouvelle méthode pour l'extraction industrielle des PhG de C. tubulosa.