FGIN-1-27 est un récepteur inhibiteur de liaison au diazépam mitochondrial synthétique (MDR)agoniste qui a démontré une activité pro-apoptotique, anti-anxiété et stéroïdogènedans diverses études. Nous rapportons ici, pour led'abordtemps, l'efficacité anti-mélanogéniquedeFGIN-1-27in vitroetin vivo. FGIN-1-27 de manière significativebasale inhibée et -hormone stimulant les mélanocytes ( -MSH)-, 1-Oléoyl-2-acétyl-sn-glycérol (OAG)-et mélanogénèse induite par l'endothéline-1 (ET-1) sans toxicité cellulaire.Le test d'activité de la tyrosinase des champignons a montré que la FGIN-1-27 n'inhibait pas directementactivité de la tyrosinase, suggérant que FGIN -1-27 n'était pas un inhibiteur direct de la tyrosinase. Bien qu'il ne puisse pas moduler l'activité catalytique detyrosinase de champignonin vitro, FGIN-1-27 a régulé à la baisse les niveaux d'expression deprotéines clés qui fonctionnent dans la mélanogénèse. FGIN-1-27 a joué ces fonctionsen supprimant les PKA/CREB, PKC- , et voies MAPK. Une fois inactivé, ildiminue l'expression de MITF, tyrosinase, TRP-1 et TRP-2, et inhibe laactivité tyrosinase,enfininhibant la mélanogénèse. Pendantin vivoexpériences,FGIN-1-27 a inhibé la pigmentation corporelle du poisson zèbreet réduit induite par les UVBhyperpigmentation de la peau de cobaye, mais pas une réduction d'un certain nombre de mélanocytes.Notrerésultatsont indiqué que FGIN-1-27 ne présentait aucune cytotoxicité et inhibaitmélanogenèse dans les deuxin vitroetin vivodes modèles. Cela peut s'avérer très utile en tant queagent de blanchiment de la peau plus sûr.

Selon des études pertinentes,cistancheest une herbe commune qui est connue comme "l'herbe miracle qui prolonge la vie". Son composant principal est le cistanoside, qui a divers effets tels queantioxydant, anti-inflammatoire, et la promotion de la fonction immunitaire. Le mécanisme entre cistanche etblanchiment de la peauréside dans l'effet antioxydant des glycosides de cistanche.Mélaninedans la peau humaine est produit par l'oxydation de la tyrosine catalysée partyrosinase, et la réaction d'oxydation nécessite la participation d'oxygène, de sorte que les radicaux sans oxygène dans le corps deviennent un facteur important affectant la production de mélanine. Cistanche contient du cistanoside, qui est un antioxydant et peut réduire la génération de radicaux libres dans le corps, ainsiinhibant la production de mélanine.

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INTRODUCTION

La mélanogenèse est la fonction la plus importante des mélanocytes dans la peau. Plusieurs facteurs critiques impliquant la mélanogénèse ont été clarifiés (Raposo et Marks, 2007 ; Noguchi et al., 2014). L'enzyme clé qui régule la mélanogénèse est la tyrosinase et elle agit avec la protéine 1 liée à la tyrosinase (TRP1) et la protéine 2 liée à la tyrosinase (TRP2) pour favoriser la synthèse de mélanine (Zhu et al., 2015). Un autre facteur important impliqué dans la pigmentation est un facteur de transcription associé à la microphtalmie (MITF), qui régule non seulement la prolifération et la survie des mélanocytes, mais régule également l'expression de la tyrosinase, de TRP1 et de TRP2 (Kawasaki et al., 2008 ; Levy et Fisher, 2011 ). Les stimuli environnementaux, tels que l'irradiation ultraviolette (UV), jouent un rôle crucial dans la mélanogénèse (Abdel-Naser et al., 2003). Lors de l'exposition aux rayons UV, les kératinocytes et les mélanocytes activés produisent une hormone stimulant les mélanocytes (-MSH), du diacylglycérol (DAG) et de l'endothéline-1 (ET-1) (D'Mello et al., 2016 ; Bae Harboe et Park, 2012). Lorsque l'hormone stimulant les mélanocytes (-MSH) se lie au récepteur de la mélanocortine-1 (MC1R) dans les mélanocytes, elle pourrait augmenter les niveaux intracellulaires d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et activer la protéine kinase A (PKA)/(CREB ), favorisant finalement la mélanogénèse (Corre et al., 2004 ; Rzepka et al., 2016). Le diacylglycérol (DAG) est essentiel à l'activation de la protéine kinase C- (PKC- ) dans les mélanocytes, ce qui augmente l'activité de la tyrosinase et induit la pigmentation (Kim et al., 2006 ; Kawaguchi et al., 2012 ; Yuan et Jin, 2018 ). L'1-oléoyl-2- acétyl-sn-glycérol (OAG) est un analogue DAG synthétique perméable à la membrane qui a été largement utilisé comme activateur pharmacologique de la PKC- (Rainbow et al., 2011). L'endothéline-1 (ET- 1) induit la mélanogenèse dans les mélanocytes via l'activation de la voie de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) (Park et al., 2015 ; Regazzetti et al., 2015).

La mélanine joue un rôle important dans la protection de la peau contre les effets nocifs des rayons ultraviolets, tels que le cancer de la peau et le vieillissement (Slominski et al., 2004). Néanmoins, une production excessive et une accumulation anormale de mélanine entraînent des troubles esthétiques de la peau, tels que le mélasma, les taches de rousseur et les taches brunes (Jadotte et Schwartz, 2010). Plusieurs des composés blanchissants actifs, dont l'acide kojique et l'arbutine, ont déjà été approuvés comme additifs cosmétiques (Kim et al., 2008). Mais il a été rapporté que l'arbutine a des effets cytotoxiques et que l'acide kojique peut induire le cancer (Singh et al., 2016). Ainsi, la découverte d'agents de blanchiment de la peau plus efficaces et plus sûrs est primordiale.

Le récepteur mitochondrial inhibiteur de liaison au diazépam (MDR) joue un rôle central dans la régulation de la synthèse des lipides et des stéroïdes et est largement distribué dans les tissus périphériques, y compris la peau (Alho et al., 1993). Dans nos études précédentes, le diazépam, un agoniste MDR, régulait la pigmentation via la voie PKA/CREB (Lv et al., 2019). De plus, des découvertes récentes suggèrent que l'activation du MDR augmente légèrement le nombre de nouveaux mélanocytes chez le poisson zèbre (Allen et al., 2020). En comparaison avec le diazépam, le FGIN-1-27 (N, N-Dihexyl-2-(4-fluorophényl)indole-3- acétamide) présente une affinité et une spécificité relativement plus élevées pour le MDR (Freeman et Young, 2000). FGIN-1–27 a démontré une activité pro-apoptotique et stéroïdogène (Lacapère et Papadopoulos, 2003). Récemment, il a été rapporté que le FGIN-1-27 produisait des effets anti-anxiété et anti-panique in vivo (Lima-Maximino et al., 2018). Cependant, l'effet de FGIN-1-27 sur la pigmentation in vitro et in vivo n'a pas été rapporté.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Matériaux

FGIN-1-27(N, N-Dihexyl-2-(4-fluorophényl)indole-3-acétamide), OAG (1-Oléoyl-2-acétyl-sn -glycérol), et les anticorps anti-PKC- (1:200), p-PKA cat (phospho T197)(1:200), chat PKA (1:500), p-CREB (1:200), CREB(1:200), p-ERK(1:200), ERK (1:200), p-p38 (1:200), p38 (1:200), p-JNK (1:200),et JNK (1:200) ont été obtenus auprès de Santa Cruz Biotechnology(Californie, États-Unis). Tyrosinase de champignon, -MSH, ET-1 (endothéline -1) et PTU (N-phénylthiourée) ont été obtenusd'Aladdin (Shanghai, Chine). Les anticorps contretyrosinase (1:1,000), TRP-1(1:1,000), TRP-2 (1:1,000), MITF(1:2000), et -actine (1:3,000) ont été obtenus auprès d'Abcam(Cambridge, Royaume-Uni). Solution de coloration à la mélanine Masson-Fontanaa été acheté auprès de SenBeiJia Biological Technology (Nanjing,Chine). Les kits RT-qPCR ont été achetés auprès de Takara BiomedicalTechnologie (Pékin, Chine). Tampon de lyse cellulaire et protéine BCAkit de test ont été obtenus auprès de Beyotime Biotechnology (Shanghai,Chine).

Culture de cellules

Test de viabilité cellulaire

La viabilité des cellules SK-MEL-2 et des HEM a été mesurée par le test MTT (Zhou et al., 2014). Les cellules SK-MEL-2 et HEM ont été respectivement étalées dans des plaques à puits 96- à une densité de 2 × 104 cellules par puits. FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4, 8, 16 μM) a été appliqué sur des cellules SK-MEL-2 et HEM pendant 48 h. Une solution de MTT (20 μL) a été ajoutée à chaque puits d'une plaque à puits 96- pendant 4 h supplémentaires. Après avoir retiré la solution, du DMSO (200 μL) a été ajouté à chaque puits et l'absorbance a été examinée à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre à microplaque (BioTek Instruments).

Dosage de la mélanine

Les cellules SK-MEL-2 et HEM ont été respectivement étalées dans des plaques 6-puits à une concentration de 5 × 105 cellules par puits. Après 24 h d'incubation à 37 degrés, FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4 μM) a été appliqué sur des cellules SK-MEL-2 et HEM. Les cellules ont été incubées pendant 48 h supplémentaires, lavées avec du PBS, suivies d'une lyse avec un tampon de lyse cellulaire pendant 20 min à 4 ° C, et les lysats ont été centrifugés à 13, 000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. La mélanine totale du culot cellulaire a été dissoute dans 100 μL de solution de NaOH (1 mol/L, contenant 10 % de DMSO) à 80 °C pendant 1 h (Lv et al., 2015). L'absorbance optique a été mesurée à 405 nm à l'aide d'un spectrophotomètre à microplaques (BioTek Instruments).

Test d'activité tyrosinase

L'activité tyrosinase cellulaire a été menée comme décrit précédemment (Lv et al., 2020). Les cellules SK-MEL-2 ont été incubées avec différentes concentrations de FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4 μM) ou OAG (200 μM) pendant 12 h ou 48 h puis lysées avec un tampon de lyse cellulaire. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à 13,000 rpm pendant 10 min à 4 °C afin d'obtenir le surnageant pour le dosage de l'activité de la tyrosinase. Les concentrations de protéines ont été déterminées par un kit BCA avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) comme standard. 100 μL de PBS (0,1 M, pH 6,5) contenant 30 μg de protéines mélangées à 100 μL de L-DOPA (0,1 pour cent) puis incubées à 37 degrés C pendant 1h. L'absorbance optique a été mesurée à 475 nm à l'aide d'un spectrophotomètre à microplaque (BioTek Instruments).

L'effet direct de FGIN{{0}} sur l'activité de la tyrosinase a été réalisé conformément à une méthode précédente (Tomita et al., 2010 ; Lv et al., 2020). 100 μL de PBS (0,1 M, pH 6,5) contenant différentes concentrations de FGIN-1-27 mélangées à de la tyrosinase de champignon (10 unités) et 50 μL de L-tyrosine (0,05 %) puis incubées à 37 degrés pendant 10 min. L'absorbance optique a été mesurée à 475 nm à l'aide d'un spectrophotomètre à microplaque (BioTek Instruments).

Coloration à l'argent ammoniacal Masson–Fontana

Pour la détection du pigment de mélanine, des cellules SK-MEL-2 ont été étalées sur une plaque à puits 6- contenant des lamelles de verre de 13- mm dans 2,0 ml de milieu de culture (10 pourcentage de sérum bovin fœtal) dans chaque puits. 48 h après l'administration, les cellules ont été fixées avec du formol (tampon neutre à 10 %) pendant 20 min.

Les cellules et les lames de peau ont été colorées selon la méthode de coloration à l'argent ammoniacal Masson-Fontana (Lee et al., 2013). Les cellules et les lames de peau ont été incubées avec une solution de coloration à la mélanine Masson-Fontana pendant 16 h à température ambiante. Ensuite, les cellules et les lames de peau ont été rincées à l'eau distillée 3 fois et ont été incubées avec une solution hypo pendant 7 min. Après un lavage soigneux à l'eau distillée, les cellules et les lames de peau ont été contre-colorées avec une coloration rouge neutre pendant 7 min. Les cellules et les lames de peau ont été observées à l'aide d'un microscope Nikon Ti2-U.

Immunohistochimie pour S-100

L'immunohistochimie S-100 a été réalisée comme décrit précédemment (Lee et al., 2013). Les lames ont été bloquées avec 5 % de BSA pendant 1 h à température ambiante, puis incubées dans un anticorps primaire anti-S-100 (Dako, Carpentaria, CA) dilué dans une solution de blocage pendant une nuit à 4 °C. Le lendemain, les lames ont été lavés avec du TBST 4 fois et incubés avec un anticorps secondaire (Dako, Carpentaria, CA). Ensuite, les lames ont été traitées avec de l'aminoéthyl carbazole pour développer les coupes. Des lames de peau ont été observées à l'aide d'un microscope Nikon Ti2-U.

Transcription inverse-PCR quantitative (RT-qPCR)

La RT-qPCR a été réalisée comme décrit précédemment (Lv et al., 2020). En bref, l'ARN total des cellules SK-MEL -2 a été extrait à l'aide du réactif TRIzol et quantifié par spectrophotométrie. L'ADNc simple brin a été synthétisé à l'aide de la transcriptase inverse SuperScript II conformément aux instructions du fabricant. L'analyse PCR quantitative SYBR-Green a été réalisée avec un système de détection de séquence ABI PRISM (Applied Biosystems) et des jeux d'amorces pré-validés. Tous les échantillons ont été analysés en triple exemplaire. Les cycles de seuil ont été placés dans la partie logarithmique de la courbe d'amplification et les résultats ont été normalisés à GAPDH. La différence de pli entre les deux échantillons a été déterminée par la méthode delta-delta Cq. Les séquences d'amorces du gène Mitf sont 5′-AGAGCAGGGCAGAGAGTGAGTG-3′, 5′-AACTTGATT CCAGGCTGATGATGTC-3′.

Analyse Western Blot

La suspension de protéines a été obtenue selon le procédé mentionné ci-dessus. Les protéines intracellulaires extraites (30 ug) ont été séparées par SDS-PAGE (10 pour cent) puis transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène L (PVDF), suivant un protocole standard de transfert humide. La membrane a été bloquée à l'aide de 2,5 % de BSA à température ambiante pendant 1 h, exposée à des anticorps primaires appropriés à 4 °C pendant une nuit et lavée avec du TBST 4 fois. Les membranes ont été exposées à de l'IgG de chèvre anti-lapin (1:1,000) ou de l'IgG de chèvre anti-souris (1:1,000) à température ambiante pendant 1 h et lavées avec TBST 4 fois (Liao et al., 2017). Les membranes ont ensuite été visualisées à l'aide d'un système d'imagerie multifonctionnel par chimiluminescence (Tanon 4600). Les contrôles internes du même blot ont été sondés avec de l'anti-actine.

Évaluation basée sur le phénotype et détermination de la teneur en mélanine chez le poisson zèbre

Des poissons zèbres adultes ont été conservés dans un aquarium dans les conditions suivantes : 28,5 degrés, avec un cycle lumière/obscurité de 14/10 h. Les embryons ont été obtenus à partir d'un frai naturel induit le matin en allumant la lumière. La collecte des embryons a été achevée en 30 min. L'évaluation basée sur le phénotype a été menée comme décrit précédemment (Choi et al., 2007). En bref, les embryons synchronisés ont été collectés et disposés à la pipette (3-4 embryons par puits dans des 96-plaques à puits contenant 200 ul de milieu embryonnaire). Le FGIN-1-27 et le PTU ont été dissous dans du DMSO à 0,1 %, puis ajoutés au milieu embryonnaire de 35 à 60 h (exposition de 25 h). Les effets sur la mélanogénèse du poisson zèbre ont été observés au stéréomicroscope.

Modèle de cobaye d'hyperpigmentation induite par les UVB

Huit cobayes bruns (6 semaines, environ 300 g) ont été obtenus auprès de l'Institute of Laboratory Animal Science (Beijing, Chine). Les cobayes ont été logés individuellement dans une pièce à température contrôlée dans des conditions de laboratoire standard, avec un cycle de lumière de 12 h/12 h d'obscurité (lumières allumées de 9 h 00 à 9 : 0 0 h 00) avec température constante (23 ± 3 degrés) et humidité (50 ± 10 pour cent). Les zones séparées (cercle diamétral de 1 cm) du dos de chaque animal ont été exposées à 500 mJ/cm2 d'UVB (Sigma SH-4, Shanghai, Chine) une fois par jour pendant 1 semaine (Fujimoto et al., 1988 ; Lee et al., 2013). Ensuite, le véhicule (PEG400/EtOH 7 : 3) et le FGIN-1-27 (1 %) ont été administrés aux zones hyperpigmentées (20 ul de solution par cercle) deux fois par jour pendant 3 semaines. Le degré de pigmentation a été mesuré par le spectrophotomètre (YS3010, 3nh, Shenzhen, Chine). La valeur ΔL a été déterminée en fonction de la valeur L mesurée par le spectrophotomètre, comme suit : ΔL L (à chaque jour mesuré) - L (au jour 0). Toutes les procédures animales pour cette étude ont été menées conformément au "Guide des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire" et approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Changzhou.

Analyses statistiques

RÉSULTATS

FGIN-1-27 inhibe -MSH, OAG ou ET-1- synthèse de mélanine induite dans les cellules SK-MEL-2

Avant d'étudier les effets de FGIN-1-27 (figure 1A) sur la pigmentation, un test de viabilité cellulaire a été effectué pour examiner les effets de FGIN-1-27 sur la croissance des cellules SK-MEL-2. Comme le montre la figure 1B, FGIN -1-27 n'a eu aucun effet sur la croissance des cellules SK-MEL - 2 à une plage de dosage de 1 à 16 μM après 48 h. Dans le dosage de la teneur en mélanine, FGIN-1-27 a inhibé la mélanogénèse basale (Figure 1C). -MSH est un ascenseur de l'AMPc intracellulaire, qui induit significativement la mélanogénèse (Rzepka et al., 2016 ; Corre et al., 2004 ; Lee et al., 2013). FGIN -1-27 a également inhibé la synthèse de mélanine induite par la MSH (Figure 1C). De manière constante, la coloration à l'argent ammoniacal Masson – Fontana a indiqué que FGIN-1-27 diminuait de manière significative la concentration de mélanine dans les cellules SK-MEL-2 avec ou sans -MSH (Figure 1D). De plus, OAG est un ascenseur de PKC et ET-1 est un activateur de la voie MAPK, qui peuvent tous deux favoriser la synthèse de mélanine (Kim et al., 2006 ; Park et al., 2015 ; Regazzetti et al., 2015). Comme le montrent les figures 1E et 1F, le FGIN-1-27 a également inhibé de manière marquée la mélanogénèse induite par l'OAG ou l'ET-1-.

FGIN-1-27 a supprimé l'expression de la tyrosinase, du TRP-1, du TRP-2 et a diminué l'activité de la tyrosinase cellulaire

La mélanogénèse est contrôlée par trois enzymes essentielles : la tyrosinase, le TRP-1 et le TRP-2 (Zhu et al., 2015). -MSH et ET-1 ont favorisé la synthèse de mélanine en augmentant l'expression de trois enzymes mélanogènes cruciales (Regazzetti et al., 2015 ; Lee et al., 2013). Pour déterminer si les effets blanchissants de FGIN-1-27 sont liés à l'expression de ces protéines, nous avons étudié l'effet de FGIN-1-27 sur l'expression de la tyrosinase, TRP-1 et TRP{{10 }} via une analyse western-blot. Comme le montre la figure 2A, FGIN-1-27 a supprimé l'expression de la tyrosinase, TRP-1 et TRP-2 avec ou sans -MSH. FGIN -1-27 a également inversé de manière cohérente l'augmentation de l'expression de la tyrosinase induite par l'ET -1-, TRP -1 et TRP -2 (Figure 2B). Contrairement à -MSH et ET-1, l'OAG a favorisé la mélanogénèse en augmentant directement l'activité de la tyrosinase cellulaire (D'Mello et al., 2016). Comme le montrent les figures 2C et 2D, le traitement par FGIN-1-27 pendant 12 h a inhibé l'augmentation de l'activité de la tyrosinase cellulaire induite par l'OAG et n'a pas affecté l'expression de la tyrosinase. En outre, un test d'activité de la tyrosinase de champignon a été effectué pour examiner les effets directs de FGIN-1-27 sur l'activité de la tyrosinase. Comme le montre la figure 2E, FGIN -1-27 n'a pas affecté les activités enzymatiques de la tyrosinase de champignon. Ces résultats suggèrent que FGIN-1-27 supprime l'expression de la tyrosinase, TRP-1 et TRP-2 et diminue l'activité de la tyrosinase cellulaire, mais n'a aucun effet direct sur les activités enzymatiques de la tyrosinase.

FGIN-1-27 Diminution de l'expression MITF

Le MITF est le facteur de transcription maître qui induit l'expression de la tyrosinase, du TRP-1 et du TRP-2 (Kawasaki et al., 2008 ; Levy et Fisher, 2011). Comme le montre la figure 3A, FGIN-1-27 a inhibé la transcription de MITF. Nous avons également mesuré l'expression de MITF après que les cellules SK-MEL-2 ont été traitées avec -MSH en présence ou en l'absence de FGIN-1-27. Comme le montre la figure 3B, -MSH a favorisé de manière significative l'expression de MITF. Fait intéressant, l'expression de MITF a considérablement diminué en présence de FGIN-1-27. FGIN-1-27 a également supprimé de manière cohérente l'augmentation de l'expression de MITF induite par l'ET-1- (Figure 3C). Ces résultats suggèrent que FGIN-1-27 inhibe l'expression de MITF.

FGIN-1-27 a diminué l'expression de PKC-, p-PKA Cat, p-CREB, p-p38 et p-ERK

PKA, PKC et MAPK sont des voies de transduction critiques dans la mélanogénèse (D'Mello et al., 2016). Le second messager cAMP pourrait activer la PKA, qui phosphoryle CREB, favorisant finalement l'expression de MITF (Corre et al., 2004 ; Rzepka et al., 2016). La voie dépendante de la PKC- - régule la mélanogénèse par l'activation de la tyrosinase (Kim et al., 2006 ; Kawaguchi et al., 2012 ; Yuan et Jin, 2018). Il a été rapporté que MAPK, y compris p38, la protéine kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) et la kinase N-terminale c-jun (JNK), régulait la pigmentation (Zhou et al., 2014). Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation de la mélanogénèse par FGIN-1-27, nous avons mesuré les voies de transduction impliquées dans la pigmentation. Comme le montre la figure 4, FGIN -1-27 a nettement diminué l'expression de PKC-, p-PKA cat, p-CREB, p-p38 et p-ERK.

FGIN-1-27 a inhibé la mélanogénèse dans les mélanocytes humains

L'inhibition de FGIN-1-27 sur la mélanogénèse a été évaluée dans les mélanocytes de l'épiderme humain (HEM). Comme le montre la figure supplémentaire S1, FGIN -1-27 n'a eu aucun effet sur la croissance de HEM à une plage de dosage de 1 à 16 μM après 48 h. Comme le montre la figure 5A, FGIN -1-27 a inhibé de manière significative la mélanogénèse dans HEM. L'analyse Western blot a suggéré que FGIN -1-27 diminuait les niveaux d'expression de la tyrosinase, TRP -1 et TRP -2 dans HEM (Figure 5B). Comme le montre la figure supplémentaire S2, le traitement FGIN - 1-27 pendant 12 h a inhibé l'augmentation de l'activité de la tyrosinase cellulaire induite par l'OAG dans HEM. De plus, nous avons mesuré l'expression de MITF après HEM traité avec -MSH en présence ou en l'absence de FGIN-1-27. Comme le montre la figure 5C, l'expression de MITF a diminué de manière significative en présence de FGIN-1-27. En outre, comme dans les cellules SK-MEL -2, l'implication de PKC-, PKA et MAPK dans FGIN -1-27- anti-mélanogène à médiation a également été confirmée dans HEM (Figure 5D).

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