La matière particulaire fine 2.5 régule à la hausse la mélanogenèse dans les cellules de mélanome humain A375
Jul 19, 2023
À l'éditeur : Des études épidémiologiques ont montré que l'exposition aux particules fines 2,5 (PM2,5) augmente le risque d'hyperpigmentation cutanée.[1] Une étude récente a prouvé que les PM2,5 pouvaient induire la mélanogénèse en régulant l'expression de la tyrosinase (TYR) et des protéines 1 (TYRP1) et 2 (TYRP2) liées à la tyrosinase via l'activation de la signalisation du récepteur d'aryl-hydrocarbure (AhR)/de la protéine kinase activée par les mitogènes. 2] L'AhR est répandu dans les cellules de la peau et sa ligature contrôle l'oxydation/anti-oxydation, la fonction de barrière épidermique, la réponse photo-induite, l'immunité innée et la mélanogénèse. Il peut être activé par la dioxine et les hydrocarbures aromatiques polycycliques (les constituants des PM2,5) et son activation induit la transcription de gènes codant pour les enzymes du métabolisme xénobiotique de phase I et de phase II (cytochromes P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 et CYP1B1). [3,4] Le BaP et les dioxines dangereuses activent AhR avec une génération robuste d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui est au moins en partie médiée par le CYP1A1. De plus, le stress oxydatif médié par le CYP1A1-est responsable de la production de cytokines pro-inflammatoires, telles que l'interleukine (IL)-1, IL-6 et IL-8 dans l'environnement. kératinocytes humains traités par des contaminants.[3,5] Cependant, il existe très peu d'études sur les effets toxiques des PM2,5 sur les cellules mélanogénétiques. Ici, nous avons traité des cellules de mélanome humain A375 avec diverses concentrations de PM2,5 pour déterminer si les PM2,5 peuvent favoriser la mélanogenèse et sa relation avec la signalisation AhR, le stress oxydatif et la réponse inflammatoire.
Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une forte capacité de piégeage des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et a la capacité de piéger les espèces réactives de l'oxygène et d'empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres, et a également un bon effet réparateur sur les dommages anioniques des radicaux libres thymine.
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Les PM2,5 ont été collectées pendant l'hiver (de décembre à janvier) à Pékin. L'échantillonneur intelligent de particules totales en suspension (TSP) à grand débit HY-1000 (outil de coupe PM2,5 en option, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, Chine) a été utilisé pour l'échantillonnage du filtre à quartz. La membrane de quartz a été immergée dans de l'éthanol à 75 % suivi d'une agitation par ultrasons. De l'eau stérile a été utilisée pour préparer une solution mère à haute concentration. Des cellules de mélanome humain A375 ont été cultivées dans 5% de CO2 à 37 degrés dans du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, USA) contenant du sérum bovin fœtal (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Les cellules A375 ont été traitées avec différentes concentrations de PM2,5 (0, 100, 200 et 400 ug/mL) pendant 24 heures, et les cellules ont été utilisées pour les études suivantes. Le test t de Student non apparié et l'analyse unidirectionnelle de la variance ont été utilisés pour l'analyse statistique, et P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.
Pour étudier l'influence des PM2,5 sur les cellules A375, la prolifération cellulaire a été détectée à l'aide d'un kit CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et l'apoptose cellulaire a été détectée à l'aide de l'annexine V fluorescéine isothiocyanate/ kit d'apoptose à l'iodure de propidium (FITC/PI) (Multisciences, USA), basé sur les instructions du fabricant. Les résultats ont indiqué que les PM2,5 présentaient une cytotoxicité dépendante de la concentration pour les cellules A375, mais n'affectaient pas l'apoptose [Supplementary Figure 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
La méthode NaOH a été utilisée pour déterminer la teneur en mélanine. Les cellules A375 traitées avec PM2.5-ont été lavées avec du tampon phosphate salin (PBS) et lysées avec de l'eau. Les lysats ont été centrifugés à 12, 000 tr/min pendant 5 minutes, lavés avec 10 pour cent d'acide trichloroacétique (500 mL) (Sigma, St. Louis , MO, USA) et 75 % d'éthanol (500 ml), puis clarifié à nouveau. Ensuite, 50 ml de NaOH à 1 mol/L contenant 10 % de diméthylsulfoxyde ont été ajoutés aux pastilles pendant 1 heure à 80 degrés. L'absorbance à 490 nm (DO 490) a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques. Comme TYR est l'enzyme mélanogénique la plus importante, nous avons ensuite détecté l'activité TYR en utilisant le dosage de la lévodopa (L-DOPA). Des plaques à six puits (Corning, USA) ont été ensemencées avec des cellules A375 à une densité de 3 105 cellules/puits. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS et lysées avec du désoxycholate de sodium à 0,5 % (Sigma). Le lysat a été divisé en trois groupes et 0,1 % de L-DOPA (Sigma) a été ajouté à chaque échantillon. Après 5 minutes, la DO 490 a été mesurée et 0,1 % de L-DOPA a été utilisé comme standard. Nous avons également mesuré les niveaux d'expression de l'ARNm et des protéines de TYR. L'ARN total a été extrait à l'aide d'un mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA). La transcription inverse a été réalisée à l'aide du kit ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Japon). Par la suite, une réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (qRT-PCR) a été réalisée sur Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japon). Les amorces d'Invitrogen sont présentées dans le tableau supplémentaire 1, http://links. lww.com/CM9/A917, et le niveau d'expression de chaque ARNm a été calculé à l'aide de la méthode 2*DDCT. Les niveaux d'expression des protéines ont été analysés par Western blot. Les cellules ont été lavées avec du PBS et lysées dans un tampon RIPA (Beyotime, Chine) contenant du fluorure de phénylméthylsulfonyle (mélange d'inhibiteurs de protéase, 20: 1, Sigma-Aldrich). Les concentrations de protéines ont été mesurées à l'aide d'un kit de dosage de protéines BCA (Beyotime, Chine). La protéine totale a été bouillie à 70 degrés pendant 10 minutes, séparée dans un gel de 4% à 12% à 200 V pendant 40 minutes, transférée sur une membrane à 4 degrés en utilisant 120 mA pendant 75 à 100 minutes, puis incubée avec 5% lait écrémé pendant 1 heure. Les membranes ont ensuite été sondées avec des anticorps anti-TYR, anti-AhR, anti-CYP1A1 et anti-CYP1B1 (Abcam) pendant une nuit à 4 degrés. Un anticorps IgG anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (Proteintech, USA) a été utilisé comme anticorps secondaire. Les résultats ont indiqué que les PM2,5 augmentaient la teneur en mélanine et l'activité TYR de manière dose-dépendante. Les niveaux d'expression de l'ARNm et des protéines de TYR ont été régulés à la hausse [Figure supplémentaire 2 A – D, http://links.lww.com/CM9/A917].
Les PM2,5 peuvent réguler positivement l'activité de TYR en activant la voie AhR. Pour déterminer si les PM2,5 affectent la signalisation AhR, nous avons détecté les niveaux de transcription de AhR et de ses gènes classiques en aval CYP1A1 et CYP1B1 par qRT-PCR et Western blot. Les résultats ont montré que les PM2,5 régulaient à la hausse les niveaux d'expression de l'ARNm de AhR et du CYP1A1, ainsi que l'expression des protéines du CYP1A1 [Figure supplémentaire 2 E–G, http://links.lww.com/CM9/A917].
L'activation d'AhR provoque la génération de ROS, qui peut également augmenter l'activité de TYR.[5] Par conséquent, nous avons évalué la production de ROS en utilisant le diacétate de 20,70 -dichlorofluorescéine (DCFHDA) et la cytométrie en flux. Après 24 heures de traitement avec PM2.5, les cellules A375 ont été incubées avec DCFH-DA (5 mmol/L) pendant 30 minutes à 37 degrés dans l'obscurité. Les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS et la fluorescence a été mesurée par un cytomètre en flux. L'intensité de fluorescence moyenne a été quantifiée à l'aide du logiciel FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, New York, NY, USA). Comme la production de ROS induite par le CYP1A1- est considérée comme responsable de la réponse inflammatoire,[5] les niveaux d'expression de l'ARNm des cytokines pro-inflammatoires (IL-1a, IL-6, IL{ {19}} et le facteur de nécrose tumorale [TNF]-a) ont été mesurés. Il a été constaté que les PM2,5 augmentaient la production de ROS, ainsi que les niveaux d'ARNm IL-1a, IL-6 et IL-8 dans les cellules A375 [Figure supplémentaire 2 H et I, http ://liens. lww.com/CM9/A917].
Les résultats de cette étude ont indiqué que les PM2,5 favorisaient la mélanogenèse et augmentaient à la fois l'activité et l'expression de TYR dans les cellules A375. De plus, les PM2,5 pourraient activer la signalisation AhR et induire un stress oxydatif et une réponse inflammatoire, qui pourraient être une cascade de signalisation mélanogénique responsable de l'hyperpigmentation.
Remerciements
Nous exprimons notre sincère gratitude aux personnes suivantes : Prof. Dr. Masutaka Furue et Prof. Dr. Tsuji Gaku de l'hôpital universitaire de Kyushu qui ont amélioré le manuscrit et aidé avec les informations relatives à l'AhR. Nous sommes également reconnaissants pour l'édition en anglais fournie par le professeur Dr Robert Schwartz de la Rutgers New Jersey Medical School.
Financement
Cette étude a été soutenue par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 2101000271).
Les conflits d'intérêts
Aucun.
Les références
Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. Exposition aux particules fines associées au lentigo sénile chez les femmes chinoises : une étude transversale. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi : 10.1111/jdv.13834.
Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q, et al. La matière particulaire favorise l'hyperpigmentation via l'activation de la signalisation AhR/MAPK et en augmentant les niveaux de paracrine a-MSH dans les kératinocytes. Environ Pollut 2021;278:116850. doi : 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. Rôle potentiel des PM2,5 dans la mélanogenèse. Environ Int 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Récepteur d'hydrocarbure arylique (AhR) une cible possible pour le traitement des maladies de la peau. Med Hypotheses 2018;116:96–100. doi : 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. Impact des particules en suspension dans l'air sur la peau : une revue systématique de l'épidémiologie aux études in vitro. Partie Fibre Toxicol 2020;17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-y.
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