Empreinte digitale de la nature - Analyse de la pénétration cutanée d'une formulation de cristaux d'ortie piquante
Mar 27, 2023
Abstrait:
Contexte : Les cristaux végétaux sont un nouveau concept pour produire des formulations à base de plantes. Leur principe est basé sur la diminution de parties ou de plantes entières. Dans cette étude, l'effet d'un tensioactif sur PlantCrystals de feuille d'ortie a été étudié. Deuxièmement, le contenu du matériau en vrac et la formulation PlantCrystals ont été comparés. De plus, pour la toute première fois, la pénétration cutanée des PlantCrystals a été étudiée.
Méthodes : Des feuilles d'ortie piquante ont été broyées avec une homogénéisation à haute pression. Les tailles ont été analysées par microscopie optique et diffusion statique de la lumière. Pour étudier l'effet du broyage, la teneur en flavonoïdes et en caroténoïdes totaux a été déterminée, et la capacité antioxydante de la formulation a été mesurée via la teneur totale en polyphénols et le dosage DPPH (1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl) .
Enfin, l'impact sur la pénétration cutanée a été étudié. Résultats : L'analyse granulométrique a montré un effet stabilisant du surfactant, et l'analyse chimique a révélé des teneurs plus élevées en flavonoïdes et polyphénols pour les PlantCrystals. La pénétration de la formulation dans la couche cornée s'est avérée prometteuse ; PlantCrystals possédait une fluorescence et une homogénéité perçues visuellement plus élevées par rapport au matériau en vrac. Conclusion : Le concept de PlantCrystals a amélioré la disponibilité des constituants précieux et l'efficacité de pénétration. L'utilisation de la fluorescence naturelle de la chlorophylle pour l'analyse de la pénétration cutanée des formulations à base de plantes s'est avérée très efficace.
La peau est l'un des plus grands organes du corps humain et ses signes de vieillissement se révèlent progressivement avec l'âge. Le vieillissement cutané se caractérise par une peau sèche, des rides accrues et une diminution de l'élasticité. Cistanche contient un grand nombre de flavonoïdes et de polysaccharides, ces ingrédients ont des effets anti-oxydants, anti-inflammatoires, anti-oxydants et autres, et peuvent prévenir et inverser le vieillissement cutané.
Les flavonoïdes contenus dans Cistanche peuvent inhiber la génération et la piégeage des radicaux libres, réduire les dommages causés par le stress oxydatif aux cellules de la peau, protéger les cellules de la peau et retarder le processus de vieillissement de la peau. Des études ont montré que les polysaccharides contenus dans Cistanche peuvent stimuler la croissance et la division des cellules de la peau et améliorer l'élasticité et l'éclat de la peau.
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Mots clés:
antioxydants; anti-âge; PlantCrystals ; urtica dioica; pénétration cutanée.
1. Introduction
La jeunesse et la beauté éternelles ont toujours été désirables pour l'humanité, et les tentatives pour les atteindre ont eu lieu depuis l'Antiquité. Aujourd'hui, l'idée a été traduite en stratégies anti-âge. L'objectif n'est plus la conservation de la santé globale pour toujours, mais plutôt le soutien global d'un corps sain et le retardement des mécanismes métaboliques liés à l'âge [1,2]. D'un point de vue cosmétique, l'anti-âge est principalement lié à la perception visuelle de la peau humaine, car le vieillissement peut être facilement reconnu, par exemple les rides ou le relâchement de la peau [1,3].
Néanmoins, la peau ne doit pas être considérée uniquement d'un point de vue cosmétique ; c'est le plus grand organe et la barrière entre le corps et le monde extérieur [4]. Une peau intacte et saine est donc également importante d'un point de vue médical. Le photo-vieillissement (exposition aux rayons UV) est le plus souvent connu comme un facteur exogène responsable du vieillissement cutané avec d'autres facteurs, par exemple le tabagisme ou la pollution de l'air [5]. Ces facteurs sont souvent des oxydants eux-mêmes ou induisent des processus fréquemment liés à la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), respectivement [1,6].
De plus, une couche cornée (SC) altérée avec une fonction de barrière perdue peut provoquer la génération de ROS, endommageant ainsi les couches cellulaires sous-jacentes, ce qui entraîne, par exemple, un vieillissement important, une inflammation ou un cancer de la peau. Par conséquent, l'apport d'antioxydants à la peau peut retarder ou prévenir l'effet néfaste des ROS, renforcer le SC et augmenter sa fonction protectrice [7,8]. De nos jours, l'effet anti-âge des antioxydants a augmenté sa popularité, et les exigences des consommateurs ne se concentrent pas seulement sur l'efficacité et le prix d'un produit, mais aussi sur la durabilité [9]. Des études récentes ont montré que les matières végétales pouvaient être durablement raffinées par anodisation, ce qui peut stimuler un potentiel non découvert [10-12].
Sur la base de ces résultats, PlantCrystals est un nouveau concept pour le traitement des plantes en réduisant la taille de l'ensemble du matériau dans la gamme inférieure micro ou même nanométrique sans avoir besoin de solvants organiques ni de production de déchets organiques. Un autre avantage de PlantCrystals par rapport aux extraits ordinaires est la rupture cellulaire de la matière organique. Cela conduit à la libération de tous les actifs du matériau utilisé et à leur rétention à l'intérieur de la formulation. Au contraire, un extrait est limité à un seul ou à une fraction d'ingrédients ayant des propriétés chimiques similaires (par exemple, soluble dans l'eau ou l'éthanol). En conséquence, dans cette étude, des feuilles d'ortie piquante (SN) (Urtica dioica), également appelées la "reine des herbes", ont été utilisées pour la production de PlantCrystals et appliquées sur la peau [13].
Habituellement, le SN est connu comme un diurétique, mais l'effet pharmaceutique ne se limite pas à cela. De nombreux avantages pour la santé peuvent être attribués au SN et il est toujours à l'étude pour de nombreux effets pharmacologiques, par exemple, antioxydant, antimicrobien, antimitotique, analgésique, anti-inflammatoire et anticancéreux [14,15]. Considérant la peau comme une cible, le SN possède une grande variété de constituants aux effets bénéfiques, par exemple la chlorophylle, les caroténoïdes et les polyphénols [15,16]. La littérature rapporte plusieurs propriétés pharmacologiques favorables après application cutanée d'extraits de SN, par exemple anti-inflammatoires et anti-oxydantes [17].
Jusqu'à présent, PlantCrystals n'a jamais été appliqué et analysé sur la peau. Comme PlantCrystals peut être produit avec un nombre incalculable de plantes, une analyse sans avoir besoin d'une méthode individualisée pour chaque échantillon serait bénéfique. L'approche pour surmonter ce problème était l'utilisation d'une chose que la plupart des plantes ont en commun : la chlorophylle (a et b) (Figure 1). La fluorescence de la chlorophylle est bien connue et a été étudiée [18]. Si les coupes histologiques présentent une quantité suffisante de chlorophylle pénétrée, qui peut être reconnue par microscopie à fluorescence, la pénétration cutanée des formulations à base de plantes pourrait facilement être analysée.
L'objectif principal de cette étude était le développement d'une formulation de SN PlantCrystals pour l'application cutanée et l'estimation de la pénétration du SC. SN n'avait pas été transformé en PlantCrystals dans le passé; par conséquent, le premier objectif était la mise en place d'un processus qui peut réduire la taille du matériau grossier dans le micromètre inférieur ou même dans une plage de taille plus petite. De plus, l'impact d'un tensioactif supplémentaire a été évalué sur les tailles obtenues et l'agglomération de la formulation. Deuxièmement, une suspension en vrac et les SN PlantCrystals ont été étudiés avec différents dosages pour comparer la teneur en polyphénols, flavonoïdes et caroténoïdes et la capacité antioxydante. Abraham et al. ont déjà montré que l'impact de la diminution sur l'activité dépend de l'usine choisie et du processus de production [11]. Par conséquent, une comparaison du matériau traité et du matériau en vrac est inévitable pour prouver que le procédé appliqué est bénéfique pour la plante formulée. Après avoir atteint ces prérequis, l'application cutanée a été vérifiée avec le nouveau concept de "l'empreinte digitale de la nature" en détectant la fluorescence naturelle de la chlorophylle pour estimer la pénétration du SC. Cela conduirait à une méthode qui permet une possibilité rapide, facile et rentable d'estimer la pénétration des formulations à base de plantes dans la peau.
2. Matériels et méthodes
2.1. Production de PlantCrystal
Les feuilles séchées de SN de qualité biologique ont été gracieusement fournies par Blank's GmbH and Co. KG (Uplengen, Allemagne) (figure 2A). Le matériau grossier a été réduit avec un moulin à café (CM) (CG9100, AICOK, Guangdong, Chine) pour obtenir un échantillon en poudre pour un traitement ultérieur. Par la suite, l'échantillon en poudre (figure 2B) a été dispersé dans de l'eau à une concentration de 3 % (p/p). De plus, un échantillon contenant 3 % (p/p) du tensioactif TPGS approuvé par la FDA (-tocophérol polyéthylèneglycol succinate, Gustav Parmentier GmbH, Francfort a.M., Allemagne) a été produit. Les deux échantillons ont été agités pendant une nuit à température ambiante pour laisser les particules gonfler pour une meilleure aptitude au traitement et pour s'assurer qu'aucun changement de taille ne se produira plus tard (CM plus S).
Dans l'étape suivante, les échantillons ont été désagglomérés avec un Ultra-Turrax (T 25 digital, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Allemagne) pendant une minute avec une vitesse de rotation croissante de 3000 à 25,{ {11}}. L'étape suivante de pré-broyage a été réalisée avec un Miccra D27 (MICCRA GmbH, Heitersheim, Allemagne) pour réduire davantage la taille des particules plus grosses. Les échantillons ont été traités quatre fois avec une vitesse de rotation croissante pendant 5 min à 7000, 12, 000, 18 000 et 24 000 tr/min.
La diminution finale des particules a été effectuée par homogénéisation à haute pression (HPH) avec un LAB 40 (APV Gaulin, Lübeck, Allemagne) à 500, 750, 1000 et 1500 bar cinq fois chacun (figure 2C). Pour l'analyse du contenu, les échantillons sans TPGS ont été analysés pour exclure l'impact du TPGS lors des mesures ou une éventuelle extraction supplémentaire ou protection des principes actifs due à la formulation des micelles de TPGS [19]. Pour les études de pénétration cutanée, les échantillons contenant du TPGS ont été utilisés pour garantir une bonne mouillabilité et étalement de la formulation PlantCrystals. Comme témoin, pour montrer l'effet de la diminution, une suspension en vrac de feuilles SN gonflées pendant la nuit (figure 2A) avec la même concentration a été utilisée.
2.2. Analyse de la taille des particules
La microscopie optique (Olympus BX53, Olympus Cooperation, Tokyo, Japon) a été utilisée pour l'examen visuel des échantillons. Une analyse plus poussée de la taille des particules a été effectuée par diffusion statique de la lumière (SLS, Mastersizer 3000, Malvern Instruments, Kassel, Allemagne), avec un indice de réfraction de 1,47 et un indice d'absorption de 0,01. Les résultats ont été calculés sous forme de distribution volumétrique (D(v)) et numérique (D(n)). La distribution de taille basée sur le volume est D(v)0.x signifie que x pour cent du volume total (volume résumé de toutes les particules) est représenté par des particules d'une taille égale ou inférieure au nombre donné.
Par conséquent, la valeur D(v) met l'accent sur les particules de plus grande taille à la puissance trois et est importante pour vérifier les gros agglomérats et particules. Une distribution de taille numérique D(n)0,x signifie que x pour cent des particules est égal ou inférieur à la valeur donnée. La valeur D(n) est d'une grande importance en ce qui concerne l'étude de la peau, car elle met l'accent sur la fraction principale des tailles de particules présentes dans l'échantillon, qui sont principalement impliquées dans le processus de pénétration. Une combinaison de résultats volumétriques et numériques devrait donner des informations supplémentaires sur le traitement de l'échantillon et l'impact du surfactant sur les fractions de particules de grande taille (D(v)) et la fraction granulométrique principale (D(n)).
2.3. Teneur totale en polyphénols
Le test colorimétrique de Folin-Ciocalteu a été utilisé pour évaluer la teneur totale en polyphénols et par la suite la capacité antioxydante des échantillons [20]. Tout d'abord, 100 µL de la suspension SN ont été mélangés avec 200 µL de réactif de Folin – Ciocalteu (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) et 2 mL d'eau purifiée, puis incubés à température ambiante pendant 5 min. Après cela, 1 ml de Na2CO3 à 20 % (p/v) a été ajouté et incubé dans l'obscurité pendant 1 h. Enfin, le mélange réactionnel obtenu a été mesuré par spectroscopie à 765 nm (Multiskan GO, Thermo Scientific, Dreieich, Allemagne). Le calcul de la teneur a été fait concernant l'acide gallique comme standard, et les résultats sont exprimés en équivalent acide gallique (mg GAE).
2.4. Teneur en flavonoïdes
Pour la détermination de la teneur en flavonoïdes, une réaction de formation de complexe d'aluminium a été utilisée, qui est une méthode spectrophotométrique largement utilisée pour déterminer les différents composés flavonoïdes dans les échantillons d'aliments et de plantes [21]. De plus, 100 µL de chaque suspension diluée ont été ajoutés à 100 µL de solution d'éthanol AlCl3 à 2 % (p/v) dans une plaque à puits 96- et incubés dans l'obscurité pendant 1 h. Après cela, l'absorbance des échantillons a été mesurée à 420 nm. Le calcul de la teneur a été fait concernant la quercétine (Biomol GmbH, Hambourg, Allemagne) en standard et les résultats sont exprimés en équivalent quercétine (µg QE).
2.5. Teneur totale en caroténoïdes
La teneur en caroténoïdes des échantillons a été déterminée en mesurant l'absorption spectrale du caroténoïde à une longueur d'onde spécifique, en utilisant la méthode d'après Rodriguez-Amaya [22]. L'absorbance de chaque échantillon a été mesurée à 450 nm. Le calcul a été effectué sur la courbe standard du -carotène (TCI Deutschland GmbH, Eschborn, Allemagne), et les résultats sont exprimés en µg équivalent -carotène (µg CE).
2.6. Capacité antioxydante
La capacité antioxydante a été évaluée à l'aide du test DPPH, qui utilise les radicaux libres 1,1-diphényl2-picrylhydrazyle (DPPH) comme indicateur [23]. En bref, une solution méthanolique 0.2 mM de DPPH (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA) a été préparée et 100 µL des échantillons dilués ont été ajoutés dans une plaque à puits 96- et mélangé avec 100 µL de la solution DPPH. La plaque a été incubée dans l'obscurité pendant 30 min et l'absorbance a été mesurée à 517 nm [23]. L'activité de piégeage des radicaux libres a été calculée selon l'équation suivante :
où le pourcentage RSA est l'activité de piégeage des radicaux en pourcentage, ADPPH est l'absorbance DPPH et A échantillon est l'absorbance de l'échantillon. Les concentrations d'échantillon et leur pourcentage correspondant de RSA ont été tracés sur un graphique pour calculer la valeur IC50.
2.7. Analyses statistiques
L'analyse statistique des données a été effectuée à l'aide du logiciel GraphPad Prism® (v. 8.3, GraphPad Software, Inc., La Jolla, Californie, États-Unis), et un test t apparié a été appliqué à des fins de comparaison, où les valeurs p <{{4 }}.05 ont été considérés comme statistiquement significatifs.
2.8. Détermination de la pénétration cutanée
L'étude de pénétration cutanée a été menée sur des oreilles de porc fraîches, obtenues d'un abattoir local en tant que sous-produits de la production de viande. Les oreilles de porc sont utilisées comme modèle de peau ex vivo, en raison de la similitude entre la peau de porc et la peau humaine [24–26]. Après nettoyage à l'eau purifiée et séchage soigneux avec des serviettes en papier, 50 mg de chaque échantillon ont été appliqués sur une zone d'examen de 2 × 2 cm. Ensuite, les formulations ont été massées dans la peau pendant 1 min à l'aide d'un gant saturé [27]. Tous les échantillons ont été incubés à 32 ◦C pendant 6 h et la surface de la peau a été soigneusement essuyée avec des serviettes en papier humides pour éliminer tout résidu d'échantillon.
Par la suite, des biopsies à l'emporte-pièce de 15 mm de diamètre ont été prélevées, incluses dans du Tissue-Tek® (Sakura Finetek Europe BV, Alphen aan den Rijn, Pays-Bas) et immédiatement congelées à -80 ◦C. La cryosection en coupes verticales de 20 µm d'épaisseur a été réalisée avec un cryomicrotome (Mod. 2700, Reichert-Jung, Nußloch, Allemagne). L'imagerie par fluorescence de toutes les coupes a été réalisée avec l'Olympus CKX53 (Olympus, Japon), équipé d'une source de lumière Olympus U-HGLGPS et d'un grossissement 200- fois. L'intensité de la source de lumière fluorescente a été fixée à 50 %. Le temps d'exposition a été maintenu constant à 50 ms pour toutes les images. Le filtre sélectionné pour l'analyse était le système de bloc de filtre DAPI HC (filtre d'excitation : 540–560 nm, miroir dichroïque : 570 nm, filtre d'émission : à partir de 580 nm (LP)).
3. Résultats et discussion
3.1. Production de PlantCrystals et analyse granulométrique
La production de PlantCrystals à partir de feuilles grossières de SN a été couronnée de succès. HPH a entraîné de très petites particules et aucune cellule intacte n'a été observée par microscopie optique. Une différenciation distincte des échantillons traités sans stabilisation supplémentaire (figure 3A) et TPGS (figure 3B) en tant que tensioactif n'a pas pu être observée visuellement après un examen au microscope optique. Seule une tendance légèrement inférieure à l'agglomération a pu être perçue pour l'échantillon avec TPGS comme tensioactif.
L'analyse volumétrique de la taille des particules via SLS a révélé que le processus de broyage était capable de réduire les tailles de plusieurs 100 µm à une plage de tailles inférieure à deux chiffres en µm (D(v){{8 }}.50). Une comparaison des échantillons a montré que le tensioactif avait un impact reconnaissable sur l'échantillon broyé et gonflé (CM plus S). On pouvait reconnaître que l'échantillon sans tensioactif avait la même valeur D(v)0.10-que l'échantillon stabilisé avec TPGS (Figure 4), mais pour les valeurs D(v) plus élevées, les tailles étaient à peu près doublées . Comme les deux échantillons étaient composés et traités de manière identique à l'exception de l'ajout de tensioactif, cela montre que TPGS était capable d'empêcher des agglomérations d'échantillons plus importantes pendant le gonflement. Les échantillons traités ont montré des résultats similaires pour toutes les valeurs D(v) à l'exception du D(v)0,99, qui pourrait être interprété comme le signe d'une agglomération prononcée pour l'échantillon stabilisé avec TPGS (Figure 4). Néanmoins, il faut considérer que le D(v)0,99 est considérablement variable et n'est pas toujours le paramètre le plus fiable, car une ou très peu de particules de plus grande taille pourraient avoir une influence majeure, par exemple en raison de la préparation de l'échantillon [28].
Les tailles obtenues sont très prometteuses par rapport aux résultats pour le matériel foliaire obtenus par Abraham et al. [11]. Les mesures SLS ont donné presque les mêmes tailles et distributions de tailles pour la formulation finale de PlantCrystals. Un inconvénient possible de cette étude par rapport à Abraham et al. est que le pré-broyage n'a pas été aussi efficace dans la présente étude et que le Miccra D27 a été utilisé, ce qui a introduit beaucoup de chaleur et d'air dans l'échantillon. En revanche, la diminution finale des particules par HPH a été plus douce dans cette étude, puisque le nombre de cycles HPH a été réduit de 18 à 15 cycles avec des pressions inférieures ou égales à 1000 bar et de 10 à 5 cycles avec une pression de 1500 bars [11]. Les tailles similaires obtenues pour PlantCrystals dans les deux études conduisent par conséquent à une théorie intéressante : deux processus extrêmement différents ont été appliqués, et en plus de cela, deux tensioactifs différents ont été utilisés (ou aucun), mais au final, des tailles similaires ont été obtenues. Cela conduit à l'hypothèse que la diminution du matériel végétal via HPH est limitée dans une certaine mesure. Au moins pour les feuilles de SN (cette étude) et les feuilles de sauge/laura (Abraham et al.), les indications semblent être très fortes et devraient être investiguées dans de futures études [11].
Dans l'ensemble, les deux études montrent que HPH est très efficace dans la production de PlantCrystals, mais le pré-broyage est inévitable pour éviter un blocage de l'espace du piston. Il existe encore un potentiel d'optimisation du processus de production, qui devrait, d'une part, être le plus efficace, mais aussi introduire le moins de chaleur et d'air possible dans l'échantillon pour préserver autant d'ingrédients que possible, d'autre part .
L'analyse numérique de la distribution de taille a montré à nouveau que l'échantillon gonflé comprenait des tailles légèrement plus grandes pour les échantillons sans tensioactif par rapport aux échantillons contenant du TPGS (Figure 5). L'échantillon traité possédait des tailles similaires pour les valeurs D inférieures (D(n)0.10 et D(n)0.50), et de grandes différences pouvaient être reconnues pour les valeurs D supérieures ( D(n)0,99.
Pour avoir une meilleure idée du processus, de l'effet du surfactant et des échantillons traités qui en résultent, toutes les analyses de taille (D(v), D(n), microscopie optique) doivent être considérées et combinées. En général, la configuration de mesure pour SLS ne peut pas faire la distinction entre une particule de grande taille et une agglomération de particules. Il est possible de faire une Figure 5 supplémentaire. Distribution de taille numérique des échantillons de SN non traités et traités. En haut à gauche : Sans tensioactif. En bas, à gauche : avec tensioactif. À droite : résultats remis à l'échelle pour les échantillons PlantCrystals correspondants pour une meilleure visualisation et comparaison. Pour avoir une meilleure idée du processus, de l'effet du surfactant et des échantillons traités qui en résultent, toutes les analyses de taille (D(v), D(n), microscopie optique) doivent être considérées et combinées. En général, la configuration de mesure pour SLS ne peut pas faire la distinction entre une particule de grande taille et une agglomération de particules. Il est possible de faire des mesures supplémentaires pour vérifier les agglomérations, si l'agglomération n'est pas trop forte et peut être décomposée, par exemple en modifiant la vitesse d'agitation ou la sonication [29,30].
Néanmoins, ces procédures ne sont pas couramment utilisées et il est possible qu'elles n'aient pas l'effet escompté. Une solution rapide et facile est l'utilisation de la microscopie optique, qui permet une hypothèse rapide, même pour les agglomérations serrées. Concernant l'analyse microscopique, on a pu reconnaître que pour l'échantillon sans TPGS, les agglomérations étaient plus sombres, et globalement, l'échantillon semblait plus trouble. D'autre part, les particules individuelles des deux échantillons semblaient être dans la même gamme de taille (Figure 3). Cela signifie que les différences dans la taille des mesures SLS sont très probablement liées à l'agglomération et non aux tailles "réelles" des particules.
Pour une interprétation des données SLS, il est important de savoir que les valeurs D(v) représentent et accentuent les particules de plus grande taille de manière exponentielle à la puissance trois, alors que la valeur D(n) représente la quantité de particules [ 28]. Pour comparer les résultats, un rapport des valeurs D a été effectué en divisant la valeur D(v)- ou D(n)-la valeur de l'échantillon sans tensioactif par la valeur D correspondante avec tensioactif supplémentaire (tableau 1). Un ratio supérieur à 1.{{10}} signifierait que le tensioactif a un effet stabilisant, alors qu'un ratio inférieur à 1.0 indiquerait un effet déstabilisant, et un ratio de 1,0 précisément indique aucun effet.
Pour l'échantillon broyé à sec et gonflé (CM plus S), la forte augmentation du rapport de la valeur D(v)- montre que les gros agglomérats préférentiels pourraient être évités par TPGS, alors que le rapport constant de la valeur D(n)- révèle que la stabilisation avec TPGS n'a eu qu'un impact mineur sur les agglomérats plus petits ou les particules individuelles. Pour les échantillons traités, on peut observer l'inverse ; le rapport de la valeur D(v) est presque constant, mais le rapport de la valeur D(n) augmente avec des valeurs D(n) plus élevées. Cela signifie que dans le cas des échantillons traités, des agglomérats plus gros se produisent avec et sans TPGS (D(v)). D'autre part, le tensioactif a inhibé l'agglomération des particules individuelles, et aussi, les grandes agrégations pourraient au moins être réduites dans une certaine mesure (D(n)).
Dans l'ensemble, on peut résumer que le TPGS en tant que tensioactif n'a pas eu d'impact majeur sur la taille ou la distribution de taille, mais un effet peut être reconnu. Aucun effet auto-stabilisant de la formulation PlantCrystals n'a pu être observé. Au contraire, la formulation PlantCrystals a bénéficié de l'ajout du tensioactif. HPH s'est une fois de plus avéré être une technique très efficace pour produire des formulations PlantCrystals et il a été capable de réduire la taille des particules principales à la plage souhaitée autour ou en dessous de 1 µm. Cependant, il nécessite de nombreuses étapes de pré-fraisage pour éviter le blocage de la machine et ne peut pas être utilisé comme technique autonome [11].
3.2. Analyse du contenu et études sur la capacité antioxydante (AOC)
Dans cette section, l'analyse a été effectuée sur l'échantillon initial non traité (suspension en vrac) et les PlantCrystals pour étudier l'impact du broyage sur les bioactifs SN, en particulier les antioxydants. Le SN est bien connu pour sa teneur en polyphénols, flavonoïdes et caroténoïdes, qui présentent de grands avantages pour la santé. Ils ont des activités antioxydantes, anti-inflammatoires et antitumorales, ainsi que de nombreuses autres activités [23,31,32].
De plus, il contient de grandes quantités de chlorophylle, qui possède une activité antioxydante et antimutagène marquée ; de plus, il peut être utilisé comme agent anti-acnéique et stimulant tissulaire [33,34]. Tous ces bio-actifs peuvent servir de support naturel supérieur pour renforcer la fonction barrière du SC. Plusieurs études spectrophotométriques ont été menées pour étudier l'effet des techniques de broyage sur la teneur en SN et les antioxydants. Les teneurs en flavonoïdes et en caroténoïdes ont été mesurées avant et après le broyage. De plus, la teneur totale en polyphénols et le dosage du DPPH ont été utilisés pour estimer la capacité antioxydante. Tous les résultats de l'analyse du contenu et des dosages sont présentés dans le tableau 2.
On s'attendait à ce que la diminution améliore la disponibilité des constituants végétaux par la destruction des cellules végétales, ce qui devrait entraîner une libération supplémentaire des composés actifs, améliorant ainsi le potentiel pharmacologique de la formulation. Parallèlement à cela, une amélioration significative a été observée pour la teneur en flavonoïdes (valeur p=0.0165). Pour le matériau en vrac, la valeur était de 107 ± 2 µg QE et pouvait être améliorée à 288 ± 38 µg QE pour la suspension PlantCrystals.
Par conséquent, on peut affirmer que HPH conduit à une disponibilité en flavonoïdes doublée des SN PlantCrystals par rapport au vrac. Cette amélioration est particulièrement importante pour souligner l'efficacité de la technique PlantCrystals car les flavonoïdes SN comme l'acide ursolique et la quercétine sont considérés comme les actifs les plus importants responsables de l'effet anti-âge SN sur la peau. Cet effet repose sur la capacité des constituants à inhiber l'élastase et la collagénase [17]. De plus, l'amélioration de la teneur en flavonoïdes a été soutenue par l'utilisation du milieu hydrophile dans la formulation PlantCrystals comme Bourgeois et al. ont montré la supériorité d'un extrait hydrophile sur les activités antioxydantes et anti-âge [17].
Les résultats obtenus pour la teneur totale en caroténoïdes n'ont révélé aucune amélioration significative après le processus d'homogénéisation. Une raison possible à cela est l'exposition à la chaleur, à l'air et à la lumière pendant la production, en plus de la nature hydrophile de la formulation, qui peut ne pas supporter la libre disponibilité d'actifs lipophiles comme les caroténoïdes [22].
Les polyphénols sont bien connus pour leur gamme étendue d'avantages pour la santé en tant qu'antioxydants, antimicrobiens, anti-inflammatoires, antiulcéreux, antitumoraux et de nombreux autres effets [35–37]. Le SN est considéré comme une riche source de différents types de polyphénols, tels que l'acide gallique, l'acide caféique, l'acide férulique, la quercétine et la rutine [36,38]. L'analyse de la teneur en polyphénols a été faite pour permettre une meilleure compréhension de la formulation. Ce test est également considéré comme un test de capacité antioxydante et il peut mesurer simultanément les polyphénols hydrophiles et lipophiles [39]. Comparable aux résultats des teneurs en flavonoïdes, la teneur en polyphénols totaux pourrait être améliorée de manière significative (p-value=0.0013). L'échantillon PlantCrystals a montré une teneur supérieure de 65% par rapport au matériau en vrac. Cette forte augmentation n'était pas attendue, car les études précédentes d'Abraham et al. ont montré une augmentation de 1,1 % après homogénéisation pour les graines d'arganier uniquement [11]. L'explication pourrait être les différents antioxydants des plantes : c'est-à-dire que le SN est riche en antioxydants hydrophiles et en chlorophylle, alors que les graines d'argan contiennent principalement des antioxydants lipophiles.
Les résultats du test DPPH ont montré que la valeur IC50 de la formulation ne pouvait pas être améliorée par la technologie PlantCrystals. Le dosage DPPH est un dosage antioxydant efficace qui est couramment utilisé dans la littérature, mais il présente un inconvénient majeur concernant les formulations riches en caroténoïdes et en chlorophylle. La présence de ces constituants chevauche photométriquement la mesure du DPPH, conduisant à une lecture faussement positive. Ce chevauchement pourrait expliquer la valeur IC50 étonnamment élevée pour la formulation PlantCrystals. Cela n'était pas prévu, car les formulations précédentes de PlantCrystals obtenaient toujours une amélioration de l'AOC analysé via le test DPPH [10, 11, 40].
Pour résumer, HPH a pu augmenter la teneur en flavonoïdes et l'AOC via des mesures de polyphénols mais pas la teneur en caroténoïdes et la mesure d'AOC via le dosage DPPH. D'une part, des améliorations possibles peuvent être attribuées à la réduction de la taille des particules, ce qui conduirait à une plus grande surface et par conséquent une diffusion et une disponibilité améliorées des actifs. La destruction des cellules végétales avec HPH conduit également à une meilleure libération des principes actifs.
En revanche, la technique de diminution a un impact sur la stabilité physico-chimique des constituants. Les procédés utilisés dans cette étude introduisaient dans une certaine mesure de la chaleur et de l'air dans la formulation, ce qui pouvait entraîner une perte de constituants sensibles, par exemple en raison de l'oxydation. La protection contre la lumière, un refroidissement approprié et la stérilisation de l'échantillon pourraient être d'autres améliorations pour produire des PlantCrystals dans les études futures et garantir une meilleure protection des précieux ingrédients.
3.3. Détermination de la pénétration cutanée
Dans la dernière partie de cette étude, une comparaison du comportement de pénétration des suspensions SN vrac et PlantCrystals a été étudiée. La microscopie à fluorescence a permis de visualiser l'échantillon de feuille de SN sur la peau, en suivant la pénétration des types de chlorophylle a et b. Le SN est connu pour ses grandes quantités de ces colorants naturels, qui sont responsables de la couleur verte de la plante. Les deux substances peuvent absorber la lumière bleue (400–420 nm) et la lumière rouge (640–680 nm), ce qui entraîne une fluorescence de la chlorophylle à environ 690 et 740 nm [41]. Cette lumière rouge fluorescente par la chlorophylle peut être suivie par microscopie à fluorescence.
Les résultats de l'étude de pénétration cutanée des échantillons de feuilles SN sont affichés à la figure 6. Initialement, l'autofluorescence de la peau a été ajustée au minimum (figure 6A). Il faut mentionner que même la chlorophylle dérivée du matériau en vrac non traité a montré une fluorescence visuellement détectable dans le SC. Cependant, la pénétration cutanée est incohérente et inhomogène (figure 6B). La formulation PlantCrystals a indiqué une fluorescence supérieure plus cohérente et perçue visuellement dans le SC (figure 6C).
Il faut souligner que la concentration du matériel végétal est la même, et la principale différence est la taille des particules et le nombre de cellules végétales détruites. Cela signifie que les différences de pénétration peuvent s'expliquer par deux effets. Premièrement, la perturbation des cellules conduira à une teneur plus élevée en chloroplastes libres, entraînant une concentration plus élevée et par conséquent un gradient de concentration plus élevé et une meilleure pénétration [42,43]. Deuxièmement, le matériau et les constituants insolubles sont beaucoup plus petits pour la formulation PlantCrystals, et cela serait comparable aux effets connus des nanocristaux, par exemple, une adhérence et une efficacité de pénétration améliorées. De plus, l'homogénéité serait améliorée en raison de la taille plus petite des particules et de la surface de contact totale plus élevée des particules.
Néanmoins, la pénétration dans le SC était la cible de cette étude, et on peut reconnaître qu'un effet distinct sur la profondeur de pénétration n'a pas pu être observé visuellement dans les PlantCrystals par rapport au matériau en vrac. Le fait que la chlorophylle ait montré une pénétration transdermique dans les lavements cutanés vivants, même après HPH, peut être expliqué en appliquant la règle de Lipinski de cinq à la molécule. Cette règle est à l'origine utilisée pour prédire le comportement d'absorption ou de perméabilité des médicaments après administration orale. L'application de cette règle concernant la prédiction de la pénétration cutanée d'un médicament est actuellement en discussion (46).
Il stipule qu'une mauvaise perméabilité d'un médicament peut être prédite si plus d'un critère s'applique à la molécule : plus de cinq groupes donneurs de liaisons hydrogène, groupes accepteurs de liaisons hydrogène, un poids moléculaire supérieur à 500 Da ou un octanol-eau coefficient de partage (valeur log P) supérieur à 5 (47. Les chlorophylles a et b correspondent toutes deux à tous les critères mentionnés en plus des groupes donneurs de liaisons hydrogène (Figure 1). Cela indique de mauvaises propriétés de pénétration en soi pour les molécules. Ainsi, PlantCrystals peut n'améliorent que dans une certaine mesure la consistance et la profondeur de pénétration cutanée de la chlorophylle. Néanmoins, la production de PlantCrystals via HPH a augmenté la quantité de chlorophylle a et b dans le SC. On peut supposer que si la chlorophylle pénètre de manière plus homogène et est prononcée dans le SC, d'autres actifs végétaux avec une perméabilité plus élevée seront délivrés dans la peau dans une large mesure.
Étant donné que le SC était la cible visée de cette étude, la technologie PlantCrystals est une approche de formulation très prometteuse et polyvalente pour exploiter les avantages de nombreuses herbes naturelles sur les propriétés de la peau. Ainsi, par exemple, de nombreuses plantes possèdent un effet hydratant cohérent avec les principes de la cornéothérapie pour générer une peau plus saine [48,49]. De plus, des composants tels que les acides gras essentiels possèdent également des effets positifs, par exemple, renforcent et réparent la barrière cutanée, et peuvent même être utilisés comme activateurs de pénétration [50,51]. Tous ces effets positifs des actifs et excipients d'origine végétale sont naturellement incorporés dans une formulation PlantCrystals sans produire de déchet.
De manière générale, il a pu être démontré que la microscopie à fluorescence peut détecter la pénétration cutanée des formulations à base de plantes. Ce n'est pas seulement intéressant d'un point de vue scientifique, mais aussi pour le marketing et la satisfaction des clients, car l'effet d'une formulation à base de plantes (par exemple, un remède ménager ou des masques pour la peau) peut être simplement prouvé, par exemple, avec une lampe UV spéciale après traitement dans les studios cosmétiques. D'un point de vue scientifique, cette méthode est une méthode très rapide et rentable pour estimer l'efficacité d'une formulation sans l'ajout de marqueurs de fluorescence. Outre l'inconvénient que seuls les composants de fluorescence actifs (pour la plupart la chlorophylle, mais d'autres ne peuvent pas être exclus) peuvent être analysés, une hypothèse générale sur l'homogénéité et la quantité peut être faite. De plus, pour les études cutanées avec des PlantCrystals ou des matériaux à base de plantes, le concept de "l'empreinte de la nature" permet d'analyser l'effet d'une formulation (par exemple, base utilisée (gels, crèmes, etc.) ou activateurs de pénétration) sans altérer la formulation d'origine ou l'ajout de(s) produit(s) chimique(s).
4. Conclusions
Le concept d'« empreinte digitale de la nature » a fait ses preuves dans cette étude. La détection de la chlorophylle fluorescente naturelle dans la couche cornée a été réalisée pour les PlantCrystals, ainsi que pour les matériaux en vrac. L'objectif principal de développer une formulation SN PlantCrystals avec une pénétration SC améliorée a été atteint et la pénétration SC de la formulation PlantCrystals était homogène par rapport à la pénétration inhomogène du matériau en vrac. Le concept de "l'empreinte de la nature" devrait être bénéfique pour d'autres formulations végétales riches en chlorophylle en tant que technique simple et rapide pour estimer leur pénétration.
Au cours de la préparation de SN PlantCrystals, décrite ici pour la première fois, la granulométrie principale du matériau grossier a pu être réduite à la plage micrométrique inférieure. Le TPGS en tant que tensioactif supplémentaire a empêché l'agglomération dans une certaine mesure. La clé pour activer le plein potentiel de PlantCrystals est la perturbation des cellules végétales, qui a été obtenue selon l'analyse de taille. Cette théorie a été soulignée par la libération améliorée d'actifs et une activité antioxydante prononcée. Des valeurs plus élevées de teneur en flavonoïdes et une meilleure AOC mesurée en utilisant la teneur totale en phénol font des SN PlantCrystals une formulation prometteuse pour la thérapie anti-oxydante de la peau.
Des études futures doivent prouver que ces résultats ne sont pas seulement réalisables avec "la reine des herbes". Des méthodes supplémentaires pour mesurer l'AOC devraient également être testées pour leur applicabilité aux cristaux de plantes riches en chlorophylle. Le test DDPH couramment utilisé, également utilisé dans cette étude, n'a malheureusement pas pu être utilisé dans cette étude, en raison du chevauchement spectrophotométrique entre les réactifs utilisés et le caroténoïde et la chlorophylle de l'échantillon.
Contributions d'auteur:
Conceptualisation, DK et CMK ; méthodologie, DK, RMA et SW ; analyse formelle, DK, RMA et SW ; enquête, DK, RMA et SW ; ressources, CMK ; conservation des données, DK, RMA et SW ; rédaction - préparation du brouillon original, DK, RMA et SW ; rédaction—révision et édition, DK, RMA et JB ; visualisation, DK, RMA et SW ; supervision, JB ; gestion de projet, CMK ; financement acquisition, CMK Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.
Financement:
Les travaux ont été en partie financés par le projet ZIM : KF ZF4114903AJ8.
Déclaration du comité d'examen institutionnel :
N'est pas applicable.
Déclaration de consentement éclairé :
N'est pas applicable.
Déclaration de disponibilité des données :
Toutes les données incluses dans le manuscrit.
Remerciements :
Les auteurs tiennent à remercier Blank's GmbH & Co.KG pour le don des échantillons d'ortie piquante, utilisés dans cette étude. Nous tenons également à remercier Udo Bakowsky qui a accordé l'utilisation gratuite du microscope à fluorescence. Les auteurs remercient également Soma Sengupta pour son aide dans la révision des ébauches. Reem M. Alnemari tient à remercier l'Université de Taif en Arabie Saoudite pour son soutien financier.
Les conflits d'intérêts:
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.
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