Détermination de cinq composants dans Rehmannia Glutinosa et établissement de l'empreinte digitale HPLC

Abstrait:La méthode de détermination du contenu de cinq composants dansRehmannia glutineuse, à savoir,réhmannoside D, Léonurine,échinacoside,cistancheside Aetverbascoside, a été créée, et l'empreinte digitale par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) de Rehmannia glutinosa a été établie afin de fournir une base scientifique pour le contrôle de la qualité de Rehmannia glutinosa. La colonne Shiseido CAPCELL PAK C18 a été utilisée, avec une solution d'acide formique à 1 % d'acétonitrile -0 comme phase mobile, une élution par gradient, une température de colonne de 3 0 degrés, une détermination de longueur d'onde variable et un débit de 1,0. mL/min. L'empreinte HPLC de Rehmannia glutinosa a été analysée par le "Système d'évaluation de similarité d'empreintes digitales chromatographiques en médecine chinoise (2012 Edition)" software to evaluate its quality consistency. The results showed that according to the established content determination method, the five components had a good linear relationship within their respective concentration ranges (R2>{{0}}.999 0), le RSD du test de précision, du test de répétabilité et du test de stabilité était de 0,12 % ~ 1,58 %, et le taux de récupération moyen des échantillons était de 96,5 % ~98,6 % ; l'empreinte HPLC établie de Rehmannia glutinosa a identifié 23 pics communs, et la similarité entre l'échantillon de Rehmannia glutinosa et l'empreinte digitale de contrôle était de 0,904 ~ 0,950. Les résultats suggèrent que la méthode établie de détermination du contenu et l'empreinte digitale HPLC sont adaptées à l'évaluation de la qualité de Rehmannia glutinosa et à l'identification de Rehmannia glutinosa cru et de Rehmannia glutinosa cuit, avec une grande précision et une bonne reproductibilité, et peuvent fournir un support technique pour le contrôle de la qualité de Matières médicinales Rehmannia glutinosa.

Mots-clés :Rehmannia glutinosa; détermination du contenu ; empreinte digitale; évaluation de la qualité

NOUVELLE CISTANCHE AUX HERBES AVECÉCHINACOSIDE,CISTANCHES CÔTÉ AETVERBASCOSIDE

Rehmannia glutineuseest le tubercule de racine frais ou séché de la plante Scrophulariaceae Rehmannia glutinosa Libosch. En raison des différentes méthodes de transformation, il est principalement divisé en rehmannia frais, rehmannia cru et rehmannia cuit [1-2]. Les principales zones de production sont les terres du Henan, du Shanxi, du Shaanxi, etc. Parmi eux, le rehmannia glutinosa brut a pour effet d'éliminer la chaleur et de refroidir le sang, de nourrir le yin et de favoriser la production de fluides, et est principalement utilisé pour traiter la chaleur dans le sang, réchauffer les toxines et les taches, etc. La rehmannia glutinosa cuite a pour effet de nourrir le sang et le yin, de reconstituer l'essence et de reconstituer la moelle, et est principalement utilisée pour traiter la carence sanguine, la chlorose, etc. Palpitations, agitation, etc.[1-2]. Les deux ont des propriétés et des saveurs différentes, mais tous deux appartiennent aux méridiens du foie et des reins. Rehmannia glutinosa contient des composants chimiques complexes, notamment des iridoïdes, des ionones, des glycosides de phényléthanol, des flavonoïdes, etc. [3-5].

Une fois que Rehmannia glutinosa est traité par différentes méthodes de traitement, les types, le contenu et les proportions de composants chimiques dans chaque produit traité varient considérablement, ce qui entraîne des différences significatives dans son activité pharmacologique [6-10]. selon

Des études connexes[11-12] montrent que dans le processus de passage de Rehmannia glutinosa de « cru » à « cuit », la teneur en composants chimiques tels que le catalpol, l'agripaume, le stachyose et les acides aminés a toutes diminué de manière significative, et la teneur de fructose, de 5-hydroxyméthylfurfural, etc. Les teneurs en , isorébascoside, etc. ont été significativement augmentées. À l'heure actuelle, le contrôle qualité du rehmannia glutinosa cru et cuit utilise principalement la teneur en catalpol et en rehmanniaside D comme indicateurs d'évaluation. Les indicateurs du système d'évaluation sont relativement uniques, ce qui rend difficile le contrôle global de la qualité de Rehmannia glutinosa. De plus, des études ont montré que la teneur en rehmannia glutinosa D change avant et après la transformation. Il est petit et a une faible spécificité dans la caractérisation des changements de composition après traitement et du degré de traitement [12-13].

Par conséquent, afin d'évaluer la qualité de Rehmannia glutinosa de manière plus complète, cette étude a établi la relation entre le rehmanniaside D et Yimu dans Rehmannia glutinosa.

Méthodes de détermination de la teneur en cinq composants courants, dont le glucoside, l'échinacéaside, le cistancheoside A et le verbascoside, et établissement d'une empreinte HPLC de Rehmannia glutinosa pour analyser la teneur des principaux composants de Rehmannia glutinosa provenant de différentes zones de production et avant et après transformation, afin de fournir des informations pour le contrôle qualité de Rehmannia glutinosa. Assistance technique.

Instruments, réactifs et médicaments de test

Chromatographie liquide haute performance Agilent 1260 (le détecteur est un réseau de diodes) ; balance analytique électronique à plage variable (METTLER TOLEDO); nettoyeur à ultrasons numérique (Shanghai Ultrasonic Instrument Factory, KH-500DE). Le méthanol (Sinopharm Group) est de qualité analytique ; l'acétonitrile (Merck) est de qualité chromatographique ; l'eau est de l'eau en bouteille Watsons. Substance de référence Rehmannia glutinosa D (numéro de lot RFSD8401909016, pureté 98,0 %), substance de référence glycoside de Leonurus (numéro de lot RFS-Y22002208010, pureté 98,0 %), et substance de référence cistancheside A (lot numéro RFS-R05002009014, pureté 96,0 %) ont tous été achetés auprès de Chengdu Ruifensidedan Biotechnology Co., Ltd. ; La substance de référence échinacoside (numéro de lot 111670-201907, pureté 91,8 %) et la substance de référence verbascoside (numéro de lot 11530-201914, pureté 95,2 %) ont toutes été achetées auprès des instituts chinois d'inspection des aliments et des drogues. Des échantillons de Rehmannia (SX1 ~ SX4, HN1 et HN2) ont été collectés dans différentes zones de production (voir tableau 1), dont SX4 et HN2 ont été cuits à la vapeur par SX1 et HN1 respectivement, et SX2 et SX3 ont été collectés dans la même zone de production. Tous les échantillons ont été identifiés comme étant authentiques par Song Pingshun, praticien en chef de la médecine chinoise à l'Institut provincial de contrôle des drogues du Gansu.

Tableau 1 Informations sur les échantillons de sperme Rehmanniae

2.1 Conditions chromatographiques

La colonne Shiseido CAPCELL PAK C18 (250.0 mm × 4,6 mm, 5 μm) a été utilisée, de l'acétonitrile a été utilisée comme phase mobile A et une solution d'acide formique à 0,1 % a été utilisée comme phase mobile B. Les conditions d'élution en gradient étaient : 0-3 min, 1 % A ; 3-9 minutes, 1 % A → 5 % A ; 9-24 min, 5 % A → 35 % A ; 24-35 min, 35 % A → 65 % A ; 35-40 min, 65 % A → 90 % A. Détection de longueur d'onde variable (0-24 min, 203 nm ; 24-40 min, 330 nm). Le volume d'injection était de 15 μL de solution de référence et 20 μL de solution échantillon.

2.2 Préparation de la solution

2.2.1 Préparation de la solution de référence

Prenez des quantités appropriées des cinq substances de référence ci-dessus, ajoutez 70 % de méthanol pour préparer une solution de référence mixte avec une concentration massique de 0,4 mg/mL.

2.2.2 Préparation de la solution d'essai

Peser environ 1,0 g de poudre de Rehmannia (passée au tamis n°2), peser avec précision, placer dans une fiole conique bouchée, ajouter avec précision 25 mL de méthanol à 70 %, sceller, peser, traiter aux ultrasons (puissance 300 W, fréquence 50 kHz) pendant 30 min, laisser refroidir à température ambiante, peser à nouveau, combler la masse perdue avec 70% de méthanol, filtrer et prélever le filtrat à obtenir.

2.3 Enquête méthodologique

2.3.1 Enquête de spécificité

Prendre la solution de référence mixte sous « 2.2.1 » et la solution d'essai (échantillon SX1) sous « 2.2.2 », puis injecter et mesurer selon les conditions chromatographiques sous « 2.1 ». Les résultats montrent que le chromatogramme de l'échantillon de Rehmannia présente un pic chromatographique avec le même temps de rétention que les standards de référence de Rehmannia glutinosa D, Leonurin, Echinacoside, Cistanche deserticola A et Verbascoside (voir Figure 1), indiquant que cette méthode a une forte spécificité.

2.3.2 Enquête sur les relations linéaires

Ajoutez 70 % de méthanol à la solution de référence mixte, diluez 5 fois, 10 fois, 25 fois, 50 fois, 100 fois et 250 fois respectivement, puis injectez et mesurez selon les conditions chromatographiques sous « 2.1 ». Les courbes étalons ont été tracées avec la concentration massique de chaque référence comme axe horizontal (x) et la zone de pic chromatographique correspondante comme axe vertical (y). Les résultats sont présentés dans le tableau 2, indiquant que chaque composant a une bonne relation linéaire dans la plage de concentrations massiques correspondante.

1.rehmannioside D ; 2. Léonuride ; 3. échinacoside ; 4. castanoside A;5. acéoside

Figure 1 Chromatogrammes d’investigation de spécificité

Tableau 2 Relation linéaire de 5 composants dans Semen Rehmanniae

2.3.3 Enquête de précision

Prélever la solution d'essai (échantillon SX1) sous « 2.2.2 » et effectuer le test d'injection selon les conditions chromatographiques sous « 2.1 ». Injectez l'échantillon 6 fois en continu, enregistrez la surface maximale de chaque composant et calculez la surface maximale RSD de rehmannia glutinosa D, de glycoside d'agripaume, de glycoside d'échinacée, de glycoside de cistanche A et de verbascoside dans l'échantillon de test comme étant 0. 46 %, 0,12 %, 0,85 %, 0,48 % et 0,82 %, respectivement, ce qui indique que l'instrument a une bonne précision.

2.3.4 Étude de répétabilité

Six échantillons du même échantillon de racine de Rehmannia (SX1) ont été préparés en parallèle selon la méthode en « 2.2.2 » et injectés et déterminés selon les conditions chromatographiques en « 2.1 ». Les RSD des contenus en glycoside D de racine de rehmannia, glycoside d'agripaume, glycoside d'échinacée, glycoside de cistanche A et verbascoside dans les six échantillons étaient de 0,46 %, 0,69 %, 1,42 %, {{ 12}},48 % et 1,58 %, respectivement, ce qui indique que la méthode a une bonne répétabilité.

2.3.5 Étude de stabilité

Prélever la solution d'essai (échantillon SX1) sous « 2.2.2 », injecter et mesurer selon les conditions chromatographiques sous « 2.1 » à 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 1{{ 15}} h, 12 h, 18 h et 24 h, respectivement. La RSD des zones de pic de rehmannia glutinosa D, de glycoside d'agripaume, d'échinacoside, de cistanche glycoside A et de verbascoside était de 0,94 %, 1,04 %, 0,73 % , 0,83 % et 0,71 %, respectivement, ce qui indique que la solution d'essai présente une bonne stabilité dans les 24 h.

2.3.6 Taux de récupération des échantillons

{{0}},5 g d'échantillon de racine de Rehmannia (SX1) avec une teneur connue en 5 composants ont été pesés avec précision dans une fiole conique bouchée, et 6 portions parallèles ont été ajoutées, et 5 solutions de référence de certaines concentrations ont été ajoutées. respectivement. Les échantillons ont été préparés selon la méthode sous « 2.2.2 », et les échantillons ont été injectés et mesurés selon les conditions chromatographiques sous « 2.1 ». Le taux de récupération a été calculé et les résultats sont présentés dans le tableau 3. Le taux de récupération moyen de l'échantillon de chaque composant était de 96,5 % à 98,6 % et le RSD était de 0,73 % à 1,52 %, ce qui indique que la méthode a une bonne précision.