Abstrait

Pour parvenir à une utilisation à haute valeur ajoutée des polysaccharides deCistanche désertiquerésidus, cette étude a utilisé le résidu restant après l'extraction des glycosides phényléthanoïdes (un procédé industriel basé sur la technologie brevetée de séparation par membrane,Brevet n° ZL200710102756.7, held by Hotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd., https://www.xjcistanche.com/about-us) as the raw material. We systematically investigated the differences in chemical structural characteristics and antioxidant activities among various polysaccharide fractions obtained through membrane separation. The results indicated significant variations in chemical composition and activity among polysaccharide fractions with different molecular weights. Utilising ultrafiltration membranes of varying molecular weight cutoffs (300 kDa, 50 kDa, 10 kDa) combined with alcohol precipitation, four distinct polysaccharide fractions were successfully prepared: >300 kDa (nommé CTP 1), 50 à 300 kDa (CTP 2), 10 à 50 kDa (CTP 3) et<10 kDa (CTP 4). Monosaccharide composition analysis indicated that all four fractions primarily contained mannose, rhamnose, galacturonic acid, glucose, galactose, and arabinose, but their proportional ratios differed. Fourier-transform infrared spectroscopy confirmed that all fractions exhibited typical characteristic polysaccharide absorption peaks. Scanning electron microscopy results demonstrated that ultrafiltration membranes with different pore sizes significantly altered the aggregation state and surface roughness of the polysaccharides by retaining components of varying molecular weights. This morphological difference may be related to intermolecular interactions and the sieving effect during ultrafiltration. In antioxidant activity assays, CTP 1 showed the optimal performance, achieving DPPH radical scavenging rates exceeding 61% and ABTS⁺ radical scavenging rates surpassing 95% at 8 mg/mL. All four fractions demonstrated appreciable antioxidant activity. This study confirms that membrane separation technology can effectively fractionate polysaccharides from Cistanche désertiquerésidu. La recherche fournit une base théorique et des données soutenant le recyclage des ressources des résidus de plantes médicinales et le développement à grande valeur de composants polysaccharidiques.

Mots-clés: Cistanche désertique; polysaccharides; activité antioxydante; technologie de séparation par membrane; analyse structurelle

 

Brevet de technologie de séparation par membrane détenu par le siège social de Wecistanche

 

 

 

 

 

 

Introduction

Cistanches Herba(Cistanche), la tige charnue séchée aux feuilles écailleuses deCistanche désertiqueYC Ma (cistanche du désert) ouCistanche tubuleuse(Schenk) Wight (CTP), est enregistré pour la première fois enShennong Bencao Jing (Le classique de la matière médicale de Shennong). En tant que représentant typique des médecines chinoises toniques traditionnelles en Chine et substance homologue de la médecine alimentaire, il est principalement produit dans les zones désertiques et désertiques du nord-ouest telles que le Xinjiang et la Mongolie intérieure, ce qui lui vaut la réputation de « ginseng du désert ». Il a pour effet de tonifier le yang des reins, de nourrir le yin des reins, de bénéficier à l'essence et au sang et d'humidifier les intestins pour soulager la constipation [2-3]. Les glycosides phényléthanoïdes qu'il contient ont des activités biologiques importantes et sont les principales substances extraites dans la production industrielle actuelle. Cependant, une grande quantité de substances utilisables reste dans les résidus après extraction, qui sont rejetés comme déchets, entraînant non seulement un gaspillage des ressources, mais pouvant également imposer une charge environnementale. Par conséquent, parvenir à un recyclage de grande valeur des résidus revêt une grande importance pour le développement efficace des ressources médicinales chinoises et un développement respectueux de l’environnement.

Les polysaccharides, en tant que composants actifs majeurs deCistanche, présentent diverses activités pharmacologiques telles que des effets antioxydants, anti-âge, hépatoprotecteurs, anti-inflammatoires, immunomodulateurs et antitumoraux [4-7], et peuvent être largement utilisés dans le développement de médicaments, ainsi que dans les produits alimentaires et de santé. Des études antérieures ont largement optimisé le processus d'extraction et mené des évaluations préliminaires de l'activité deCistanchepolysaccharides, mais la recherche systématique sur les polysaccharides dans les résidus après extraction des glycosides phényléthanoïdes reste rare, en particulier en raison du manque d'analyse approfondie des technologies efficaces de séparation et de fractionnement des polysaccharides résiduels et des différences d'activité entre les différentes fractions, ce qui limite considérablement l'amélioration de la valeur d'utilisation globale desCistancheressources.

Dans le domaine de la recherche sur les polysaccharides, les polysaccharides bruts non classés présentent des problèmes tels que des composants mixtes, des contributions d'activité peu claires et des cibles ambiguës, ce qui rend difficile la révélation précise de la base matérielle de leurs fonctions antioxydantes, immunomodulatrices et autres. Parallèlement, les impuretés telles que les protéines, les pigments et les sels inorganiques présents dans les polysaccharides bruts interfèrent également avec l'évaluation de leur activité et le développement de leurs applications. Les méthodes traditionnelles telles que la chromatographie sur colonne ont une haute résolution mais sont difficiles à mettre à l’échelle, tandis que le fractionnement par précipitation alcoolique est difficile et comporte des risques environnementaux. La technologie de séparation membranaire, avec ses avantages de haute efficacité, de respect de l'environnement et de fractionnement précis, présente un grand potentiel dans la séparation et la purification des polysaccharides. Il permet un fractionnement précis des composants polysaccharides à travers des membranes avec différents seuils de poids moléculaire, fournissant un support technique idéal pour révéler la relation structure-activité « poids moléculaire-activité » des polysaccharides [8]. Tang et coll. [9] ont purifié avec succès trois composants polysaccharidiques directement à partir deLentinus edodesextraits d'eau en utilisant une combinaison de membranes d'ultrafiltration de 2,5 kDa, 5 kDa et 10 kDa. Notamment, la technologie de séparation membranaire utilisée dans cette étude est protégée par un brevet d'invention (Brevet n° ZL200710102756.7) détenu par Hotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. (https://www.xjcistanche.com/about-us), qui se concentre sur la production de matières premières contenant des glycosides de phényléthanoïde à partir deCistancheen utilisant la séparation par membrane, fournissant ainsi une base industrielle solide pour nos recherches. Les produits développés par notre groupe de recherche basés sur des études systématiques des glycosides phényléthanoïdes deCistanche tubuleuse[10] sont entrés dans la phase de production pilote. Sur cette base, cette étude utilise le résidu deCistancheaprès l'extraction du glycoside phényléthanoïde comme matière première, utilise des membranes d'ultrafiltration combinées à une précipitation d'alcool pour fractionner et purifier les polysaccharides présents dans le résidu, et analyse systématiquement les différences dans les caractéristiques structurelles chimiques et les activités antioxydantes des fractions de polysaccharides de différents poids moléculaires. L’objectif est d’ouvrir de nouvelles voies pour le recyclage des ressources deCistancherésidus, améliorer la chaîne industrielle et jeter les bases théoriques et expérimentales pour le développement de nouveaux aliments fonctionnels ou antioxydants à base de polysaccharides naturels.

 

Suppléments d'extrait de cistanche d'échinacoside 50 % 10 % d'actéoside extraits par la technologie de séparation par membrane

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1 Matériels et méthodes

1.1 Matériels et instruments

Cistanche désertiquele résidu a été fourni parHotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. (Hotan, Chine), généré par l'extraction industrielle des glycosides phényléthanoïdes via la technologie brevetée de séparation par membrane (Brevet n° ZL200710102756.7; https://www.xjcistanche.com/about-us). L'étalon de glucose a été acheté auprès de l'Institut de recherche en chimie fine de Tianjin Guangfu. Le m-Hydroxybiphényle (98 %), le Coomassie Brilliant Blue G-250, les sacs de dialyse (MD44), le kit de test de capacité de piégeage des radicaux DPPH, le kit de test de capacité de piégeage des radicaux ABTS, le kit de test de capacité de piégeage des anions superoxydes et le kit de test de capacité antioxydante totale ont tous été achetés auprès de Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. L'acide galacturonique (98 %), l'albumine sérique bovine (98 %) et L'acide ascorbique (Vc) a été acheté auprès de Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. D'autres réactifs chimiques étaient de qualité analytique.

UV-19001 Spectrophotomètre UV-Vis (Simadzu Instruments Co., Ltd.) ; Balance électronique YP10002 (Shanghai Hengji Scientific Instruments Co., Ltd.) ; Balance électronique SQP (Sartorius Scientific Instruments Co., Ltd.) ; Bain-marie EYELA (SB-1200) ; CA-1111 dispositif de circulation d'eau de refroidissement (Shanghai Ailang Instruments Co., Ltd.) ; Pompe à vide à circulation d'eau SHZ-D (Shanghai Jinfu Experimental Instrument Equipment Co., Ltd.) ; N-1100 évaporateur rotatif ; XCLD-10FE lyophilisateur (Shanghai Xingchuang Scientific Instrument Equipment Co., Ltd.) ; Machine expérimentale de séparation par membrane organique BONA-GM-18C ; Membranes d'ultrafiltration de 300 kDa, 50 kDa, 10 kDa (polyéthersulfone, Jinan Bona Co., Ltd., Shandong) ; TGL-16A centrifugeuse (Changsha Pingfan Instruments) ; Balance analytique BT25S (Sartorius Scientific Instruments) ; Chromatographie liquide haute performance Dionex U3000 (Thermo Fisher Scientific, États-Unis) ; Souffleur d'azote LC-DCY-12GK (Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.) ; Système d'eau ultra pure UPH-I-10T (Chengdu Ultra Pure Technology Co., Ltd.) ; DF-101S spectromètre infrarouge (Simadzu Instruments Co., Ltd.) ; Microscope électronique à balayage Zeiss Supra55VP (Carl Zeiss (Shanghai) Management Co., Ltd.).

 

Spécifications du Cistanche

1.2 Méthodes expérimentales

1.2.1 Extraction du brutCistanchePolysaccharides

Selon le procédé d'extraction obtenu à partir de pré-tests préliminaires, 150 g deCistanche désertiqueLe résidu a été pesé, extrait à 100 degrés pendant 3 h avec un rapport solide-liquide de 1:20 g/mL, centrifugé à 4 000 tr/min pendant 10 min, et le surnageant (teneur en polysaccharide : 4,4 mg/mL) a été collecté pour obtenir l'extrait de polysaccharide.

1.2.2 Fractionnement et séparation desCistanchePolysaccharides

L'extrait aqueux deCistancheLes polysaccharides ont été soumis à un fractionnement par ultrafiltration en utilisant des membranes d'ultrafiltration de 300 kDa, 50 kDa et 10 kDa dans des conditions de pression de 0,18 MPa et de température de 40 degrés. Les rétentats et les perméats ont été collectés séparément, concentrés par évaporation rotative, et de l'éthanol à 95 % a été ajouté pour atteindre une concentration finale en éthanol de 80 %. Le mélange a été placé à 4 degrés pendant 24 h, puis centrifugé à 4 000 tr/min pendant 10 min et le surnageant a été jeté pour obtenir le précipité. Le précipité a été redissous dans l'eau, dialysé contre un sac de dialyse de 3 500 Da pendant 48 h et lyophilisé pour obtenirCistanche polysaccharides. Four fractions were obtained by collecting retentates and permeates: >300 kDa (nommé CTP 1), 50 à 300 kDa (CTP 2), 10 à 50 kDa (CTP 3) et<10 kDa (CTP 4).

1.2.3 Détermination des composants chimiques des polysaccharides

1.2.3.1 Détermination de la teneur totale en sucre

La méthode phénol-acide sulfurique a été utilisée pour déterminer la teneur en polysaccharides dans les échantillons [11]. Une courbe étalon a été préparée en utilisant du glucose, avec une solution étalon de glucose à 0,1 mg/mL. Des volumes précis de 0,4 ml, 0,8 ml, 1,2 ml, 1,6 ml et 2,0 ml de solution standard ont été transférés dans des tubes à essai bouchés de 10 ml et de l'eau a été ajoutée jusqu'à un volume total de 2,0 ml. Ensuite, 1,0 ml de solution de phénol à 6 % fraîchement préparée a été ajouté, bien mélangé, et 5,0 ml d'acide sulfurique concentré ont été rapidement ajoutés le long de la paroi du tube. Le mélange a été secoué, chauffé dans un bain-marie à 90 degrés pendant 15 minutes, puis retiré et refroidi à température ambiante. En utilisant de l'eau distillée comme blanc, l'absorbance a été mesurée à 490 nm avec un spectrophotomètre UV-Vis. La courbe standard obtenue était y=16.196x+0.0834, avec R2=0.999.. Une solution de polysaccharide à 0,1 mg/mL a été préparée et l'absorbance de chaque fraction de polysaccharide a été mesurée en utilisant la même méthode. La teneur totale en sucre de chaque fraction a été calculée en la substituant à la courbe standard.

1.2.3.2 Détermination de la teneur en protéines

La méthode Coomassie Brilliant Blue a été utilisée pour déterminer la teneur en protéines des échantillons [12]. Une courbe étalon a été préparée en utilisant de l'albumine sérique bovine, avec une solution protéique étalon à 0,1 mg/mL. La solution protéique standard a été diluée à des concentrations de 0,02, 0,03, 0,05, 0,07 et 0,09 mg/mL. Ensuite, 1 ml de chaque concentration de la solution protéique standard a été ajouté aux tubes à essai, suivi de 5,0 ml de réactif chromogène Coomassie Brilliant Blue et mélangé par agitation. En utilisant de l'eau distillée comme blanc, l'absorbance a été mesurée à 595 nm après 10 min de réaction. La courbe standard obtenue était y=0.0034x+0.7673, avec R2=0.996. L'absorbance de chaque fraction de polysaccharide a été mesurée en utilisant la même méthode et la teneur en protéines de chaque fraction a été calculée en la remplaçant dans la courbe standard.

1.2.3.3 Détermination de la teneur en acide uronique

La méthode m-hydroxybiphényle a été utilisée pour déterminer la teneur en acide uronique dans les échantillons [13]. Une courbe étalon a été préparée en utilisant de l'acide galacturonique, avec une solution étalon d'acide galacturonique à 0,1 mg/mL. La solution standard a été diluée à des concentrations de 0,01, 0,02, 0,03, 0,05 et 0,1 mg/mL. Ensuite, 1 ml de chaque concentration de la solution standard a été ajouté aux tubes à essai, et 6 ml de solution de tétraborate de sodium-acide sulfurique ont été ajoutés dans des conditions de bain d'eau glacée, mélangés par agitation, chauffés dans de l'eau bouillante pendant 5 min, refroidis à température ambiante, et 0,1 ml de réactif m-hydroxybiphényle ont été ajoutés, soigneusement mélangés et laissés au repos à température ambiante pendant 30 min. En utilisant de l'eau distillée comme blanc, l'absorbance a été mesurée à 525 nm. La courbe standard obtenue était y=7.5339x+0.0494, avec R2=0.995.. Une solution de polysaccharide à 0,1 mg/mL a été préparée et l'absorbance de chaque fraction de polysaccharide a été mesurée en utilisant la même méthode. La teneur en acide uronique de chaque fraction a été calculée en la remplaçant par la courbe standard.

 

Fabricant Wecistanche

1.2.4 Determination of Monosaccharide Composition

Conditions chromatographiques: Système de chromatographie liquide Thermo U3000, équipé d'une colonne Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). La phase mobile était un tampon acétonitrile/phosphate (12 g/L de dihydrogénophosphate de potassium, pH ajusté à 6,8 avec 2 mol/L de NaOH) dans un rapport volumique de 17:83, avec élution isocratique. Le débit était de 0,8 mL/min, la température de la colonne était de 30 degrés, la longueur d'onde de détection était de 250 nm et le volume d'injection était de 10 μL.

Préparation de la solution étalon: 5 mg chacun de rhamnose, arabinose, galactose, glucose, xylose, mannose, acide galacturonique, acide glucuronique, chlorhydrate de glucosamine et chlorhydrate de galactosamine, et 10 mg de fucose ont été pesés séquentiellement, dissous et complétés à 10 ml dans une fiole jaugée pour préparer la solution mère étalon.

Préparation de la solution échantillon: 5 mg de chacune des quatre fractions de polysaccharides ont été pesés, ajoutés à 1 ml de solution de TFA à 2 mol/L et chauffés à 121 degrés pendant 2 h. L'azote a été purgé pour sécher la solution. Ensuite, 3 ml de méthanol ont été ajoutés pour le lavage et la solution a été à nouveau séchée ; cette étape de lavage au méthanol a été répétée 2 à 3 fois. Le résidu a été dissous dans 1 ml d'eau stérile et transféré dans un flacon chromatographique pour test. Ensuite, 0,2 ml de l'hydrolysat de polysaccharide ont été ajoutés dans un tube à centrifuger conique bouché, suivi de 0,2 ml de solution d'hydroxyde de sodium à 0,5 mol/L et de 0,5 ml de solution de méthanol PMP à 0,5 mol/L. Le mélange a été vortexé et mis à réagir dans un bain-marie à 70 degrés pendant 1 h. Après la réaction, 0,2 ml d'acide chlorhydrique à 0,5 mol/L ont été ajoutés pour neutraliser l'hydroxyde de sodium, 1 ml de chloroforme a été ajouté et le mélange a été vortexé pour une extraction trois fois afin d'éliminer l'excès de PMP. La couche de chloroforme a été jetée, 0,3 ml de la couche aqueuse a été prélevée et de l'eau a été ajoutée pour compléter à 1 ml. Ensuite, 0,2 ml de chacun des 11 étalons de monosaccharides ont été dérivés en utilisant la même méthode [14-15].

1.2.5 Analyse par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR)

Une quantité appropriée de chacune des quatre fractions de polysaccharides a été placée sur la platine d'échantillonnage de l'accessoire ATR du spectromètre infrarouge, et des mesures FT-IR ont été effectuées à l'aide d'un spectrophotomètre infrarouge à transformée de Fourier dans la plage de fréquences de 4 000 à 400 cm⁻¹ [16].

1.2.6 Analyse par microscopie électronique à balayage (MEB)

La morphologie des quatre fractions polysaccharidiques a été analysée par SEM [17]. Une petite quantité de chaque fraction de polysaccharide a été uniformément fixée sur une fine plaque de cuivre et une couche de poudre d’or a été évaporée sur la surface de l’échantillon à l’aide d’une pulvérisation ionique. La morphologie de surface a été observée à 5,00 kV.

1.2.7 Détermination de l'activité antioxydante in vitro

1.2.7.1 Détermination de la capacité de piégeage des radicaux DPPH·

Les concentrations des quatre fractions de polysaccharides ont été réglées à 1, 2, 3, 4 et 8 mg/mL, et le groupe témoin positif (Vc) a également été réglé aux mêmes concentrations. La détermination a été effectuée conformément aux instructions du kit de test de capacité de piégeage des radicaux DPPH·.

1.2.7.2 Détermination de la capacité de récupération des anions superoxydes

Les concentrations des quatre fractions de polysaccharides ont été réglées à 0,5, 1, 2, 4 et 8 mg/mL, et le groupe témoin positif (Vc) a également été réglé aux mêmes concentrations. La détermination a été effectuée conformément aux instructions du kit de test de capacité de piégeage des anions superoxydes.

1.2.7.3 Détermination de la capacité antioxydante totale

Les concentrations des quatre fractions de polysaccharides ont été réglées à 0,5, 1, 2, 4 et 8 mg/mL, et le groupe témoin positif (Vc) a également été réglé aux mêmes concentrations. La détermination a été effectuée conformément aux instructions du kit de dosage de la capacité antioxydante totale.

1.2.7.4 Détermination de la capacité de récupération des radicaux ABTS⁺

Les concentrations des quatre fractions de polysaccharides ont été réglées à 0,5, 1, 2, 4 et 8 mg/mL, et le groupe témoin positif (Vc) a également été réglé aux mêmes concentrations. La détermination a été effectuée conformément aux instructions du kit de test de capacité de piégeage des radicaux ABTS.

1.3 Traitement des données

Chaque expérience a été répétée trois fois dans les mêmes conditions et les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart type. Le logiciel SPSS 21.0 a été utilisé pour l'analyse de signification, avec une ANOVA unidirectionnelle pour l'analyse monofactorielle ; P <0,05 était considéré comme statistiquement significatif. Origin 2024 et GraphPad Prism 10.1.2 ont été utilisés pour la création graphique.

 

Matières premières de haute qualité

Références

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