La gomisine N inhibe la mélanogenèse en régulant les voies de signalisation PI3K / Akt et MAPK / ERK dans les mélanocytes

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Abstrait: Gomisine N, l’un des composés lignanes trouvés dans Schisandra Chinensis a été montré posséder des activités anti-oxydantes, anti-tumorigènes et anti-inflammatoires dans diverses études. Ici, nous rapportons, pour la première fois, l’efficacité anti-mélanogène de Gomisin N dans les cellules de mammifères ainsi que dans les embryons de poisson zèbre. Gomisin N a considérablement réduit la teneur en mélanine sans toxicité cellulaire. Bien qu’il n’ait pas été capable de moduler l’activité catalytique du champignonTyrosinasein vitroGomisine Nrégulé à la baisse les niveaux d’expression des protéines clés qui fonctionnent dansmélanogenèse. Gomisin N récepteur de la mélanocortine 1 régulée à la baisse (MC1R), adénylyl cyclase 2, facteur de transcription associé à la microphtalmie (MITF), tyrosinase,Tyrosinase-protéine-1 apparentée (TRP-1) et la protéine 2 liée à la tyrosinase (TRP-2). De plus, les cellules Melan-A traitées par Gomisin N ont présenté une augmentation des niveaux de p-Akt et de p-ERK, ce qui implique que l’activation du PI3K/Akt et Les voies MAPK/ERK peuvent fonctionner pour inhibermélanogenèse. Nous avons également validé que Gomisin N réduction de la production de mélanine en réprimant l’expression de MITF,Tyrosinase, TRP-1 et TRP-2 dans les cellules de souris et d’hommes ainsi que dans le développement d’embryons de poisson-zèbre. Collectivement, nous concluons celaGomisine Ninhibe la synthèse de la mélanine en réprimant l’expression du MITF et du mélanogène enzymes, probablement en modulant les voies PI3K/Akt et MAPK/ERK.

Mots-clés:Schisandra Chinensis;Gomisine N; lignan;mélanogenèse;blanchiment de la peau

cistanche ont une fonction de blanchiment de la peau

1. Introduction

La mélanine est un pigment présent dans la plupart des organes animaux, y compris la peau, les cheveux, les yeux, l’oreille interne, les os, cœur et cerveau [1,2].Mélanogenèseest un processus complexe où plusieurs voies de signalisation sont impliqués. Le récepteur de la mélanocortine 1 (MC1R) est un régulateur clé dansmélanogenèseSignalisation grâce à ses ligands tels que l’hormone stimulant les mélanocytes (MSH) et l’hormone adrénocorticotrope (ACTH) [3]. La mélanine cutanée est biosynthétisée par des mélanocytes dans l’épiderme, puis transférée aux kératinocytes, où ils jouent un rôle important dans la protection de la peau en absorbant le rayonnement UV de la lumière du soleil et en piégeant les radicaux libres réactifs [4,5]. Synthèse et transfert de mélanine dans la peau et les cheveux les follicules sont régulés par la disponibilité de ses précurseurs [6]. L-tyrosine et L-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA), principaux substrats des enzymes mélanogènes, fonctionnent également comme régulateurs hormonaux dans la mélanogenèse [7]. D’autre part, la surproduction de mélanine entraîne une peau indésirable des préoccupations telles que les taches de rousseur et le mélasma [8,9]. La mélanogenèse peut affecter le comportement de la normale et mélanocytes malins en modulant les propriétés élastiques des cellules [10]. Bien que les récepteurs car la sérotonine et la mélatonine exprimées dans les cellules cutanées jouent un rôle clé dans le maintien cellulaire homéostasie, la production excessive de mélanine via des changements hormonaux incontrôlés peut causer conditions pathologiques de la peau [11].

Ainsi, il y a eu des efforts considérables pour élucider les mécanismes moléculaires qui contrôlent la mélanogenèse comme étape principale pour traiter les troubles cutanés hyperpigmentaires. En outre, divers types deblanchiment de la peaules agents qui inhibent la synthèse de la mélanine ont été identifiés à partir de la plante et les extraits non végétaux utilisés commercialement dans les cosméceutiques [12,13]. Le plus utilisé les agents blanchissants comprennent l’hydroquinone, le méquinol, l’arbutine, l’acide kojique, l’acide ascorbique et le rétinoïque acide [12,14]. Cependant, il existe diverses limites à leur utilisation dans le traitement des symptômes aigus ou chroniques. d’hyperpigmentation chez l’homme. Par exemple, l’hydroquinone, bien qu’elle ait longtemps été utilisée pour la dépigmentation depuis les années 1960, peut provoquer une irritation de la peau et une dermatite de contact [15,16]. Il mène également aux dommages causés à l’ADN en augmentant la production d’espèces réactives de l’oxygène et le développement de ochronose exogène dans les cellules de mammifères [17,18]. Autres bien connusTyrosinaseinhibiteurs tels que L’acide kojique et l’acide ascorbique ont non seulement une mauvaise pénétration cutanée, une stabilité et une efficacité blanchissante mais peut également provoquer une cytotoxicité, une dermatite et un érythème dus à une utilisation à long terme [19,20]. À cet égard, il est de plus en plus nécessaire de mettre au point des agents blanchissants plus sûrs et plus efficaces pour le traitement des humains hyperpigmentation cutanée. Les herbes naturelles utilisées en médecine traditionnelle peuvent fournir des sources alternatives pour identifier de nouveaux agents de blanchiment qui contrôlent les étapes clés demélanogenèseavec moins ou pas de côté effets [21].

Schisandra chinensis, également connu sous le nom de baie à saveur fine du nord, se trouve naturellement dans le nord-est Chine, Russie d’Extrême-Orient, Japon et Corée [22]. Cette plante a longtemps été utilisée pour le traitement de la cécité nocturne, des brûlures cutanées, de l’inflammation aseptique et des maladies du foie dans les régions orientales traditionnelles médecine [23,24]. Il a été démontré que l’extrait de fruit de S. chinensis et ses composés lignanes possèdent divers effets pharmacologiques dans les lignées cellulaires murines. Par exemple, Schisandra A et C ont un antioxydant effets, tandis que Schisandra B a anti-fibrotique, anti-inflammatoire, anti-oxydant, et anti-apoptotique [25]. Un autre composé lignanGomisine N(Figure 1A) a été signalé pour supprimer apoptose induite par le stress oxydatif en inhibant la libération du cytochrome C des mitochondries vers le cytoplasme, le clivage de la caspase 3 et du PARP, et la perméabilité mitochondriale induite par le Ca2+ transition dans les cardiomyocytes de rat H9c2 [7,8]. Fait intéressant, plusieurs études utilisant des modèles murins et les lignées cellulaires de la peau humaine ont révélé le potentiel thérapeutique de S. chinensis pour le traitement des troubles cutanés. Lee et al. ont rapporté que l’extrait de méthanol du fruit de S. chinensis soulageait les symptômes de la dermatite de contact en réduisant la production de cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α et l’IFN-γ lorsqu’elles sont topiques appliqué [8,24]. Kang et al. ont montré que l’extrait d’eau de Schisandra Fructus inhibait l’activation d’IκB, ce qui signifiait supprimer la production de TNF-α, d’IL-6 et de GM-CSF dans la lignée de mastocytes humains HMC-1 [26]. Ces résultats nous ont amenés à postuler que les lignanes de S. chinensis pourraient affecter les fonctions des cellules de la peau plus largement. Dans cette étude, nous avons cherché à étudier les rôles putatifs deGomisine N, l’un des principaux lignanes composés dans S. Chinensis, dans la régulationmélanogenèse, évaluant ainsi son utilisation potentielle en tant que agent cosméceutique. Ici, nous rapportons queGomisine Ninhibe la biosynthèse de la mélanine sans cellulaire toxicité dans les cellules humaines et de souris, ainsi que dans les embryons de poisson zèbre.

2. Résultats

2.1. Effets de la gomisine N sur la formation de mélanine et la viabilité cellulaire

Pour vérifier les effets de Gomisin N surmélanogenèse, nous avons traité des mélanocytes de souris avec différents concentrations deGomisine Npendant 72 h, puis évalué les changements dans la teneur en mélanine. Gomisine N le traitement a réduit la teneur en mélanine à la fois dans la lignée cellulaire mélanocytaire normale Melan-A et dans B16F10 les cellules du mélanome de manière dose-dépendante sans toxicité cellulaire (Figure 1B, C). Nous avons observé que La gomisine N a inhibé la production de mélanine induite par α-MSH dans les cellules B16F10, ce qui était comparable avec les résultats obtenus par traitement PTU [27] (Figure 1C). Évaluer si la réduction de mélanine surGomisine Nle traitement est dû à une diminution de l’activité de la tyrosinase, nous avons effectué une L-DOPA test de coloration dans les cellules mélanocytes épidermiques humaines normales (NHEM). Comme le montre la figure 1E, NHEM les cellules traitées avec Gomisin N ont présenté des niveaux réduits de L-DOPA par rapport aux cellules non traitées. Cependant, l’effet inhibiteur de la gomisine N sur la production de mélanine n’était pas significatif chez l’homme. cellules MNT-1 du mélanome (Figure 1D).

2.2. Effets de la gomisine N sur l’activité de la tyrosinase

Examiner siGomisine NInhibeTyrosinaseactivité in vitro, nous avons utilisé la tyrosinase de champignon et les lysats de cellules de mélanome B16. L’acide kojique, un inhibiteur bien connu de la tyrosinase, a été utilisé comme un positif contrôle. Lorsqu’il est traité à la tyrosinase de champignon, tandis que l’acide kojique a considérablement réduit l’enzymatique , la gomisine N n’a induit aucun changement dans la conversion de la L-DOPA en dopachrome (figure 2A). Cependant, lorsqu’il a été traité aux cellules de mélanome B16, Gomisin N a entraîné une diminution deTyrosinaseactivité de la cellule lyse de manière dose-dépendante (figure 2B). De plus, lorsqu’il est co-traité avec α-MSH dans Cellules B16,Gomisine Ninversé l’augmentation de la formation de dopachrome stimulée par α-MSH (Figure 3C). Notamment, la gomisine N semblait être plus efficace que l’acide kojique pour inhiber la celluleactivité de la tyrosinasede cellules B16 sur α-MSH. Ces résultats impliquent que l’effet inhibiteur de la gomisine La production d’azote sur la mélanine observée dans les cellules de souris et d’hommes (Figure 1) n’est pas due à sa fonction d’inhiber directement l’activité catalytique de la tyrosinase. Cependant, il est toujours possible que Gomisin N régule l’expression de la tyrosinase ou d’autres protéines qui jouent un rôle clé dansmélanogenèse.

2.3. Effets de la gomisine N sur l’inactivation de la voie de signalisation MC1R

Nous avons cherché à élucider le mécanisme sous-jacent responsable de l’effet inhibiteur de la gomisine N sur la production de mélanine. Nous avons raisonné queGomisine Npourrait réguler les protéines de signalisation qui sont impliqués dansmélanogenèseet inhibent ainsi la synthèse de la mélanine. Le récepteur de la mélanocortine 1 (MC1R) est un récepteur couplé à la protéine G mélanocytaire qui fonctionne comme un régulateur clé dans la synthèse de la mélanine. Le l’activation de MC1R par son ligand α-MSH ou hormone adrénocorticotrope (ACTH) entraîne une augmentation dans l’adénylyl cyclase, qui à son tour régule à la hausse les niveaux intracellulaires d’AMPc [2,3]. Par conséquent, l' le niveau transcriptionnel de MITF est augmenté via la liaison à la protéine kinase-C (PKA) / élément réactif voie protéique (CREB) [2,28]. Évaluer l’effet régulateur de Gomisin N sur la signalisation MC1R , nous avons vérifié les niveaux d’expression de MC1R et de ses molécules de signalisation en aval après traitement des cellules Melan-A avec Gomisin N. Nous avons observé que la gomisine N régulait significativement à la baisse les niveaux de protéines de MC1R et d’adénylyl cyclase 2 d’une manière dose-dépendante (figure 3A–C). Comme prévuGomisine N-les cellules traitées présentaient également une diminution des niveaux de protéines du MITF et de ses cible la tyrosinase, le TRP-1 et le TRP-2 (Figure 3A, D–G). Ces résultats suggèrent que Gomisin N inhibe enzymes productrices de mélanine en inactivant mitF via la voie de signalisation MC1R.

2.4. Effets de la gomisine N sur la phosphorylation de l’Akt et de l’ERK1/2 dans les cellules Melan-A

Les voies PI3K/Akt et MAPK/ERK sont connues pour être impliquées dans la mélanogenèse par MITF régulatrice transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle [29,30]. Pour évaluer si Gomisin N affecte ces voies de signalisation, nous avons évalué l’état de phosphorylation d’Akt et d’ERK1/2 par Analyse par transfert de Western. Comme le montre la figure 3H–J, traitement à forte dose (30 μM) deGomisine Nsignificativement amélioré la phosphorylation d’Akt et d’ERK. Ces données indiquent que l’effet inhibiteur de Gomisin N surmélanogenèseest susceptible d’être associé aux voies P13K/Akt et MAPK/ERK.

2.5. Mélanogenèse inhibée par la gomisine N chez les embryons de poisson-zèbre

Nous avons ensuite cherché à examiner si gomisin N est efficace pour inhibermélanogenèsein vivo. À à cette fin, nous avons traité des embryons de poisson zèbre avec de la gomisine N pendant 72 h à des concentrations de 1, 10, 20 et 30 μM, puis mesuré les niveaux d’expression des protéines mélanogènes. Nous avons observé que le traitement par Gomisin N a inhibé la formation de mélanine dans le développement d’embryons de poisson zèbre.Gomisine N-embryons traités montrés une réduction de la teneur en mélanine en fonction de la concentration par rapport à la teneur non traitée contrôle (figure 4). Nous avons également constaté que les niveaux de protéines deTyrosinase, MITF, TRP-1 et TRP-2 étaient diminué par le traitement par Gomisin N (Figure 5). Ces résultats démontrent que Gomisin N inhibe mélanogenèse in vivo en régulant le facteur de transcription MITF et ses ciblesTyrosinase, TRP-1, et TRP-2.

2.6. La gomisine N a inversé la mélanogenèse induite par la rapamycine chez le MNT-1 humain

Bien que Gomisin N ait significativement inhibémélanogenèsedans les cellules Melan-A et B16 ainsi que dans embryons de poisson zèbre, nous n’avons pas observé son effet sur les cellules humaines de mélanome MNT-1. Nous nous attendions à ce que l’effet de la gomisine N pourrait être détectable dans les cellules MNT-1 dans les conditions où la mélanogenèse est régulé à la hausse par un stimulus approprié. Il a été démontré que la rapamycine induit la mélanogenèse en augmentant l’activité de la tyrosinase et les niveaux de protéines de MITF, tyrosinase, TRP-1 et TRP-2 [31], en partie par l’activation de l’autophagie [32]. Nous avons surveillé les niveaux deTyrosinase, MITF, TRP-1 et TRP-2 dans les cellules MNT-1 par analyse par transfert western, après co-traitement avec Gomisin N et rapamycine. Le traitement à la rapamycine a induit de manière significative les niveaux de MITF, TRP-1 et TRP-2, mais n’a pas eu de effet surTyrosinase(figure 6). Cependant, le traitement par Gomisin N a significativement inversé les effets de rapamycine sur MITF, TRP-1 et TRP-2 en fonction de la concentration. L’effet inverse deGomisine Ncontre la rapamycine était plus prometteur à la concentration de 20 et 30 μM que 10 μM. Ces résultats suggèrent que Gomisin N inhibemélanogenèsedans les cellules humaines du mélanome MNT-1 en régulant le facteur de transcription MITF et ses cibles TRP-1 et TRP-2.

3. Discussion

La fonction principale de la mélanine est de protéger les cellules de la peau contre les rayons UV [33-35]. L’hyperpigmentation, résultat d’une surproduction de mélanine dans la peau, provoque des préoccupations esthétiques et est associé à la dermatite et au cancer de la peau. Plusieurs rapports ont suggérémélanogenèsecomme cible importante pour le traitement du mélanome métastatique [36,37]. Ainsi, il y a un besoin croissant de développer des agents anti-mélanogènes qui régulent la mélanogenèse sans cellulaire toxicité [38]. Il existe plusieurs voies impliquées dans la mélanogenèse cutanée [39,40]. Lors de la liaison du ligand, MC1R améliore l’activité de l’adénylyl cyclase, ce qui augmente par la suite les niveaux intracellulaires de l’AMPc [41,42]. L’activation de la voie PKA/CREB dépendante de l’AMPc a été largement a rapporté une augmentation des niveaux transcriptionnels de MITF, améliorant ainsi la synthèse de la mélanine [43]. Le MITF fonctionne comme un régulateur principal des trois principales enzymes mélanogènes tyrosinase, TRP-1 et TRP-2 chez les vertébrés [3,21,44]. Ces enzymes sont des protéines transmembranaires situées dans le mélanosmal membrane des mélanocytes. La tyrosinase régule l’étape de limitation de débit dansmélanogenèseen convertissant L-tyrosinase à L-DOPA [23]. Le TRP-1 et le TRP-2 jouent également un rôle important dans la synthèse de la mélanine, bien que leurs fonctions ne sont pas entièrement comprises.

Dans cette étude, Gomisin N, un composé lignan de S. chinensis a montré une activité dépigmentante sans toxicité cellulaire. La gomisine N a également inhibé la synthèse de la mélanine dans les lignées cellulaires de mammifères en culture comme dans les embryons de poisson zèbre. La gomisine N semblait être plus efficace que la PTU témoin positive dans inhiber la production de mélanine dans les cellules Melan-A (Figure 1B). La gomisine N a réduit la teneur en mélanine dans une manière dépendante de la concentration. Par rapport au groupe témoin non traité, 10 μM deGomisine Nréduit la teneur en mélanine d’environ 40%, sans toxicité cellulaire. L’activité anti-mélanogène de La gomisine N de 10 μM était comparable à celle de 100 μM de PTU dans les cellules Melan-A. De même, Gomisin N semblait être plus puissant que le PTU dans les cellules B16F10 activées par α-MSH, où les effets de 5- et La gomisine N de 10 μM était comparable à celle de la PTU de 10 et 100 μM, respectivement (figure 1C). Les cellules NHEM traitées avec Gomisin N ont présenté des niveaux réduits de L-DOPA, ce qui suggère que Gomisin N inhibeTyrosinaseactivité dans les cellules cultivées (Figure 1E). Ces résultats nous ont amenés à approfondir nos recherches. le mécanisme sous-jacent par lequel gomisine N inhibe la mélanogenèse.

Nous avons examiné siGomisine Nmodule directement l’activité catalytique deTyrosinasein vitro. Contrairement à l’acide kojique, la gomisine N n’a pas montré d’effets inhibiteurs sur l’activité de la tyrosinase des champignons. (Figure 2A). Cependant, l’activité de la tyrosinase cellulaire dans les lysats de cellules de mélanome B16 était significative régulé à la baisse par Gomisin N avec et sans traitement α-MSH (Figure 2B,C). Inhibition de l’activité cellulaire de la tyrosinase de la gomisine N lors du stimulus α-MSH s’est avérée plus importante que celle de l’acide kojique témoin positif (figure 2C).

Nous avons postulé que la fonction anti-mélanogène de la gomisine N pourrait se produire par régulation transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle de la tyrosinase et des protéines liées à la tyrosinase (PST). Pour valider cela, nous avons mesuré les niveaux d’expression des molécules de signalisation dans la voie MC1R, une déterminant de la quantité et de la qualité de la production de mélanine dans les mélanocytes. Comme on pouvait s’y attendre, nous a observé que la gomisine N réduisait les niveaux de MC1R et d’adénylyl cyclases 2 dans les cellules Melan-A (Figure 3A–C). En outreGomisine Nrégulé à la baisse l’expression du MITF et de ses protéines cibles y compris la tyrosinase, le TRP-1 et le TRP-2 (Figure 3A,D–G). Ces résultats suggèrent que les niveaux réduits de la teneur en mélanine sous traitement par Gomisin N résulte de la désactivation de la voie MC1R.

D’autre part, les voies PI3K/Akt et MAPK/ERK peuvent phosphoryler le MITF, et peut ainsi moduler son activité post-transcriptionnellement [45]. Cependant, l’effet global de l’activation des voies PI3K/Akt et MAPK/ERK dansmélanogenèseest controversé. Les deux les voies PI3K/Akt et MAPK/ERK sont activées de manière constitutive dans les mélanomes humains en raison de mutations accumulées [46]. La dépigmentation médiée par le C2-céramide dans les cellules Mel-Ab est connue pour se produisent par une réduction des niveaux de p-Akt [47]. Il existe plusieurs composés naturels qui s’activent mélanogenèse en régulant à la hausse les taux de p-ERK dans les cellules de mélanome B16 [28]. En revanche, il y a aussi des preuves que des taux élevés de p-ERK et de p-Akt inhibent la synthèse de la mélanine [28,48]. La complexité de la régulation de la mélanogenèse peut s’expliquer en partie par le fait que la phosphorylation améliore l’activité transcriptionnelle du MITF, mais induit simultanément une ubiquition dépendante du protéosome dégradation du MITF [26,49–51]. Nos données ont montré que les niveaux de p-Akt et de p-ERK étaient régulés à la hausse dans les cellules Melan-A traitées par Gomisin N (Figure 3H–J). Cela implique que les PI3K/Akt et MAPK/ERK peuvent contribuer à l’inhibition de la production de mélanine.

Nous avons ensuite validé l’activité anti-mélanogène de Gomisin N dans le modèle in vivo du poisson-zèbre. Les embryons de poisson zèbre traités à l’azote gomisin ont montré une réduction significative de la pigmentation de la mélanine (Figure 4). En outre, Gomisin N a nettement diminué les niveaux deTyrosinase, MITF, TRP-1, et TRP-2 dans le développement d’embryons de poisson zèbre. Ces résultats suggèrent collectivement queGomisine Ninduit la dépigmentation en régulant à la baisse l’expression du MITF et des enzymes mélanogènes in vivo. L’activité anti-mélanogène de gomisine N a été confirmée dans les cellules MNT-1 du mélanome humain stimulé par la rapamycine. Bien que Gomisin N n’ait entraîné que de petits changements dans la teneur en mélanine dans MNT-1 cellules (Figure 1D), il a été efficace pour inverser la régulation à la hausse induite par la rapamycine de MITF, TRP-1, et le TRP-2 en fonction de la concentration (figure 6A, C–E). Pris ensemble, l’effet réglementaire deGomisine Nsur MITF et des enzymes mélanogènes a été trouvé de manière reproductible dans des cellules de souris et d’hommes ainsi que dans les embryons de poisson zèbre.

Pour résumer, ce travail suggère que Gomisin N pourrait avoir un fort potentiel en tant que romanblanchiment de la peauagent. La gomisine N semble inhibermélanogenèseen réprimant l’expression de MITF via la voie MC1R, au lieu de moduler directement l’activité catalytique deTyrosinaseet Les PST. Bien que des mécanismes détaillés restent à élucider, la dépigmentation induite par Gomisin N est susceptibles d’être associés à l’activation des voies PI3K/Akt et MAPK/ERK (figure 7).

4. Matériaux et méthodes

4.1. Matériaux

RPMI1640 a été acheté auprès de Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA). Dulbecco modifié Le milieu d’Eagle (DMEM), le sérum bovin fœtal (FBS) et la pénicilline-streptomycine (PS) ont été achetés de Hyclone (Carlsbad, CA, États-Unis). Le milieu de croissance des mélanocytes a été acheté auprès de PromoCell (Heidelberg, Allemagne). Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 12-O-tétradecanoylphorbol-13-acétate (TPA), acide kojique, 1-phényl-2-thiourée (PTU), tyrosinase de champignon, 3,4-dihydroxy-l-phénylalanine (L-DOPA), α-MSH, diméthylsulfoxyde (DMSO) et paraformaldéhyde ont été achetés auprès de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, États-Unis).Gomisine Ncomposé a été fourni par Chul Young Kim (Université Hanyang, Ansan, Corée). Rapamycine a été acheté de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis).

4.2. Culture cellulaire

La lignée cellulaire B16F10 du mélanome de souris a été fournie par la Korean Cell Line Bank (Séoul, Corée). Les cellules Mélanocytes murines Melan-A [52] étaient un don généreux du Dr Byeong Gon Lee (le Skin) Research Institute, Amore Pacific Co., Yongin-si, Corée). Les cellules humaines de mélanome MNT-1 étaient généreusement fourni par Aeyeong Lee (Collage de médecine à l’Université Dongguk, Goyang-si, Corée). Les mélanocytes épidermiques humains normaux primaires (NHEM) ont été achetés auprès de PromoCell (Heidelberg, Allemagne). Les cellules Melan-A ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) complété par 10% FBS, 1% PS et 200 nM TPA. DMEM complété par 10% FBS et 1% PS a été utilisé pour maintenir les cellules Melan-A et les cellules NHEM. Toutes les cellules ont été incubées à 37 ◦C dans un taux de 5% Incubateur à CO2.

4.3. Mesure de la teneur en mélanine

Les cellules Melan-A ont été ensemencées dans une plaque de 24 puits (1 × 105 cellules/puits), traités avecGomisine Net puis incubé pendant 72 h. Après 72 h, la teneur en mélanine a été mesurée comme décrit précédemment [53]. Brièvement, après avoir retiré le milieu de culture, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Par la suite, une solution d’hydroxyde de sodium (1 mL, 1 N) a été ajoutée à chaque puits pour dissoudre la mélanine. L’absorbance à 405 nm a été mesuré à l’aide d’un lecteur de microplaques. Ce test a été répété avec des cellules B16F10 (2 × 104 cellules/puits) et les cellules MNT-1 suivant la même méthode.

4.4. Analyse western blot

Les cellules Melan-A ont été ensemencées dans des boîtes de 100 mm (1 × 106 cellules/plat) et traités avec 1, 5 ou 10 μMGomisine Npendant trois jours à 37 ◦C. Les cellules ont été lavées avec du PBS, puis récoltées à l’aide d’un grattoir. Les cellules détachées ont été placées dans 1 ml de PBS et centrifugées à 7500 tr/min pendant 5 min. Après avoir retiré la tige solution, les pastilles cellulaires ont été lysées avec un tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 1 % de NP-40, 0,02 % d’azoture de sodium, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 100 μg/mL de PMSF, 1 g/mL d’aprotinine) pendant 24 h à 4 ◦C. Les protéines totales ont été extraites à l’aide d’une ultracentrifugeuse à 12 000 tr/min pendant 30 minutes à 4 ◦C. La teneur en protéines a été mesurée à l’aide du test de Bradford. Les protéines (30 μg) ont été séparées à l’aide d’un 10% de sodium dodécylsulfate-polyacrylamide gel électrophorèse (SDS-PAGE) gel et transféré dans un membrane de nitrocellulose. La membrane a été bloquée pendant 1 h avec 5% de lait écrémé dans une solution saline tamponnée Tris avec Tween-20 (TBST), puis incubé pendant 12 h à 4 ◦C avec des anticorps primaires ciblant la α-tubuline (Santa Cruz, CA, ÉTATS-UNIS), MITF (Signalisation cellulaire, Danvers, MA, États-Unis), tyrosinase (Signalisation cellulaire), ERK (Signalisation cellulaire), phospho-ERK (Signalisation cellulaire), AKT (Signalisation cellulaire), phospho-AKT (Signalisation cellulaire), MC1R (Santa Cruz), adénylyl cyclases 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) et TRP-2 (Santa Cruz). Après avoir retiré les anticorps primaires, les membranes ont été lavées trois fois avec tbST et incubées avec des anticorps secondaires (IgG-HRP anti-chèvre de lapin; HRP anti-lapin de souris, Santa Cruz) pendant 1 h. Les membranes ont été traitées avec un réactif de chimiluminescence amélioré à l’aide du ChemiDoc XRS+ système d’imagerie (Bio-Rad, Hercules, CA, États-Unis). Une analyse densitométrique des bandes a été effectuée en utilisant le logiciel Image MasterTM 2D Elite (version 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, USA).

4.5. Dosage de l’activité de la tyrosinase

Estimer l’effet inhibiteur de la gomisine N sur les champignonsTyrosinaseactivité, la tyrosinase était incubé avec 1, 5 ou 10 μMGomisine Nou le contrôle positif de l’acide kojique. Chaque échantillon a été dissous dans le méthanol. La L-DOPA (8,3 mM) et la tyrosinase de champignon (125 U) ont été diluées dans 80 mM de phosphate tampon (pH 6,8). 40 μL de chaque échantillon et 120 μL de L-DOPA ont été mélangés dans une plaque de 96 puits, suivis par l’ajout de 40 μL de tyrosinase de champignon diluée. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 15 min, et l’absorbance a été mesurée à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Tyrosinasel’activité des lysats de cellules de mélanome B16 a été mesurée avec ou sans traitement α-MSH, comme décrit précédemment par Ohguchi et al. [54], avec de légères modifications. Le lysat cellulaire a été préparé comme décrit ci-dessus dans la partie analyse Western Blot. Les protéines totales du surnageant ont été mesurées par Dosage de Bradford utilisant l’albumine sérique bovine comme standard [55]. Une quantité égale de protéines était dilué et utilisé pour le dosage de l’activité de la tyrosinase.

inhiber l’activité de la tyrosinase

4.6. Coloration L-DOPA dans les cellules NHEM

Les cellules NHEM ont été ensemencées dans une plaque de 24 puits et incubées pendant 72 h avec Gomisin N. fixé avec 4% de paraformaldéhyde pendant 40 min, suivi d’un traitement avec 0,1% de Triton X-100 pendant 2 min. La L-DOPA (0,1 %) a été ajoutée à chaque puits, suivie d’une incubation de 2 h. Après avoir retiré la solution, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS. Les images ont été photographiées au microscope.

4.7. Expériences sur le poisson-zèbre

Les embryons de poisson-zèbre ont été obtenus à partir de la Banque de ressources de poisson-zèbre (Daegu, Corée). Embryons ont été traités par Gomisin N pendant 72 h. L’effet dépigmentant deGomisine Nsur les embryons de poisson zèbre a été observée sous le stéréomicroscope. Pour l’analyse par transfert Western, embryons traités par Gomisin N ont été lysés à l’aide d’un tampon de lyse, à partir duquel les protéines totales ont été préparées comme mentionné ci-dessus.

5. Conclusions

Notre résultat confirme l’idée que Gomisin N a un fort potentiel d’utilisation en tant qu’aliment fonctionnel etblanchiment de la peauagent.Gomisine Nest l’un des principaux composés lignanes de S. Chinensis. En fait S. Chinensis est un médicament à base de plantes utilisé pour la guérison de nombreuses maladies humaines. Cependant, d’autres des études épidémiologiques sont nécessaires pour prouver l’innocuité de Gomisin N sur la peau. Par conséquent les études in vivo et les essais cliniques seront en mesure de démontrer plus clairement l’efficacité de Gomisin N. En conclusion, cette étude suggère queGomisine Npeut être un agent hypopigmentaire potentiel et naturelblanchiment de la peaucandidat pour l’industrie cosmétique.

cistanche améliorer le blanchiment

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