Synthèse verte et caractérisation de nanoparticules de fer synthétisées à partir d'extrait aqueux de feuille de Vitex Leucoxylon et ses applications biomédicales

Abstrait:La méthode d'extraction à froid a été utilisée pour obtenir l'extrait aqueux deVitex leucoxylonfeuilles dans un rapport de 1:10. Des nanoparticules de fer (FeNPs) ont été synthétisées à partir d'extrait aqueux de feuilles deV.leucoxyloncomme agent réducteur. L'approche phytomédicale a été utilisée pour fabriquer des FeNPs en mélangeant 1 ml d'extrait de plante avec 1 mM de sulfate ferrique. La microscopie électronique à balayage (SEM), la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR), la spectroscopie ultraviolette visible (UV-Vis) et la spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie ont été utilisées pour examiner les FeNPs synthétisés. La réaction de réduction a été montrée par un changement de couleur de la solution, et la formation de couleur noire confirme que des FeNPs ont été formés. Le plus grand pic d'absorption (max) a été trouvé à 395 nm dans l'analyse spectrale UV-Vis. Les spectres FTIR deV.leucoxylonl'extrait aqueux de feuilles a montré des décalages dans certains pics, à savoir 923,96 cm−1 et 1709,89 cm−1, avec des groupes fonctionnels acides carboxyliques, aldéhydes insaturés et cétones, qui manquaient dans les spectres FTIR des FeNPs et sont responsables de la formation des FeNPs. Des FeNP de diamètres compris entre 45 et 100 nm ont été observés sur des images SEM. La création de FeNPs a été confirmée par EDX, qui montre un signal fort dans la région du fer métallique à 6-8 Kev. La DRX a révélé une nature cristalline et un diamètre moyen de 136,43 nm.Antioxydant,anti-inflammatoire, cytotoxique etcicatrisationdes tests in vitro ont rapporté une activité significative des FeNPs. Les résultats cumulés de la présente étude indiquent que la synthèse verte des FeNPsrenforce son activité biologiqueet peut servir deun possible agent de cicatrisation cutanéeetagent cytotoxique contre le cancer. Une étude future est nécessaire sur l'identification des mécanismes impliqués dans la synthèse des FeNPs parV.leucoxylonet ses applications biomédicales.

Mots clés:Vitex leucoxylon; nanoparticules de fer; SEM ; cicatrisation des plaies; cytotoxique

LES AVANTAGES DE CISTANCHE POURANTIOXYDANT,ANTI-INFLAMMATOIRE, CYTOTOXIQUE ETGUÉRISON DES BLESSURES

1. Introduction

L'application de la nanotechnologie dans la science et la technologie pour fabriquer de nouveaux matériaux à l'échelle nanométrique est un domaine en pleine croissance [1]. La nanotechnologie traite de la fabrication de matériaux au niveau atomique pour obtenir des propriétés distinctives, qui peuvent être manipulées pour des applications préférées. Ce domaine se développe rapidement avec ses applications scientifiques et technologiques pour fabriquer de nouveaux matériaux à l'échelle nanométrique [2]. Divers secteurs industriels ont adopté la nanotechnologie ces dernières années en raison de ses applications dans les domaines des systèmes de stockage électroniques [3], de la biotechnologie [4], de la séparation magnétique et de la préconcentration des analytes cibles, de l'administration ciblée de médicaments [5] et des véhicules pour les gènes et les médicaments. livraison [3,5,6]. Par conséquent, ces particules ont le potentiel d'avoir un impact substantiel sur la société en raison du large éventail d'applications pour lesquelles elles peuvent être utilisées. Les nanoparticules (NP) sont des masses de particules d'une taille inférieure à cent nanomètres et sont considérées comme des masses structurelles clés dans le domaine des nanotechnologies. L'activité supérieure des NP est à la fois leur caractéristique déterminante et la qualité pour laquelle elles se distinguent le plus [7]. Les NP organiques et inorganiques sont les deux principales classifications applicables aux nanoparticules. Les nanoparticules inorganiques peuvent inclure des NP magnétiques, des NP de métaux nobles (comme l'or et l'argent) et des NP semi-conducteurs (comme le dioxyde de titane et l'oxyde de zinc). Les nanoparticules organiques peuvent comprendre des NP de carbone. Les nanoparticules inorganiques attirent énormément l'attention car elles offrent des propriétés matérielles supérieures ainsi qu'une polyvalence fonctionnelle. Ils ont été étudiés comme des outils possibles pour l'imagerie médicale ainsi que pour le traitement des maladies en raison des caractéristiques de taille qu'ils possèdent [8]. Les diverses propriétés chimiques, physiques et biologiques des NP sont fortement influencées par une variété de paramètres, notamment la taille et la morphologie des nanoparticules, ainsi que le revêtement de surface, qui sont normalement déterminés lors de la synthèse des nanoparticules. La perte d'activité biologique prévue est causée par une diminution de la stabilité colloïdale. Le pH, la force ionique et un grand nombre de protéines qui interagissent avec les AgNPs dans des circonstances pertinentes ont tous un impact sur la stabilité colloïdale. Par conséquent, la sélection d'une technique de synthèse appropriée est essentielle pour obtenir les caractéristiques de particules souhaitées pour des applications spécifiques [9].

Actuellement, il existe une grande variété de NP qui peuvent être synthétisées en utilisant une variété de processus physiques, chimiques, biologiques et hybrides. Selon les résultats d'un grand nombre d'études de recherche, les processus physiques et chimiques de production de nanoparticules incluent l'utilisation de solvants organiques, de composés dangereux, de quantités importantes d'énergie et d'agents stabilisants non biodégradables [10]. Par conséquent, dans le domaine des nanotechnologies vertes, la synthèse de NP utilisant des matériaux naturellement disponibles tels que des extraits de plantes, divers micro-organismes, leurs métabolites et quelques substances humiques naturelles [11,12] comme agents réducteurs et coiffants devient de plus en plus populaire. Des méthodes de synthèse respectueuses de l'environnement ont été utilisées pour produire une grande variété de nanoparticules métalliques, notamment l'argent, l'or, le fer, le cuivre et le zinc. Le développement de méthodes simples et écologiquement acceptables pour la synthèse de NPs est l'un des axes clés de la nanotechnologie. Des biomatériaux tels que des micro-organismes et des extraits de plantes peuvent être utilisés dans le processus de préparation d'une grande variété de NP [13,14]. Cependant, certains organismes étant pathogènes, il est dangereux de les manipuler. Pour prospérer, les micro-organismes doivent être maintenus en culture et soumis à des conditions soigneusement contrôlées, notamment la température, le pH et d'autres paramètres. Parce qu'elle élimine le processus laborieux de maintien de la culture microbienne, la synthèse de NP à partir de parties de plantes peut parfois s'avérer plus avantageuse que d'autres procédés biologiques [15]. En conséquence, il a suscité beaucoup d'attention en raison de ses caractéristiques inhérentes, qui incluent l'utilisation des ressources naturelles, la rapidité, le respect de l'environnement et la bienveillance. Ces caractéristiques séduisantes sont absolument nécessaires pour une utilisation dans des applications médicales. Les nanoparticules produites par synthèse verte ont une taille bien définie et maîtrisée, elles sont exemptes de polluants et le procédé est simple à mettre à l'échelle. Ce sont quelques-uns des avantages supplémentaires de la synthèse verte [16]. L'activité biologique des nanoparticules synthétisées est largement déterminée et affinée par les matériaux verts utilisés pour la stabilité et la réduction des ions métalliques. L'une des propriétés idéales des NP devrait être qu'elles doivent avoir une capacité exceptionnelle à discriminer les cibles potentielles (pathogènes) et les cellules de mammifères (hôtes) [17].

Pour cette raison, l'extrait aqueux de feuilles de V. leucoxylon a été étudié pour son potentiel à faciliter la formation de nanoparticules de fer (FeNPs) dans la recherche actuelle. Le fer est l'un des éléments que l'on trouve en plus grande abondance sur Terre. Récemment, il a été reconnu comme une nouvelle classe de NP importantes en raison du fait qu'il possède une variété de propriétés uniques, notamment une coercivité élevée et un superparamagnétisme. La catalyse, les appareils électroniques, le stockage d'informations, les capteurs, la technologie d'administration de médicaments, la biomédecine, les appareils d'enregistrement magnétique et le nettoyage de l'environnement ne sont que quelques-unes des nombreuses applications intrigantes qui ont utilisé les FeNPs [18]. De plus, selon un certain nombre d'études, les FeNPs peuvent être créés à partir de divers extraits de plantes. Ces extraits de plantes comprennent la feuille d'eucalyptus globulus [19], la feuille de grenade [20] et la cendre de peau de banane [21]. La plante V. leucoxylon, qui a été utilisée dans la présente étude, fait partie de la famille des Verbenaceae. Il est également connu sous le nom de gattilier à cinq feuilles ( Kannada : Sengeni , Holenekki , Hollalakki ) et peut être trouvé dans la région le long des berges des rivières dans les forêts sempervirentes et semi-sempervirentes et les forêts de feuillus humides le long des ruisseaux. Il peut atteindre une hauteur de 20 m et est classé comme un arbre à feuilles caduques modeste à grand. Le long des forêts des Ghâts occidentaux de l'Inde, on peut le trouver en grand nombre. Il a été rapporté que l'infusion d'extrait de feuille de V. leucoxylon possède une grande variété d'activités pharmacologiques telles que des activités anti-inflammatoires, antioxydantes, antipsychotiques, antidépressives, antiparkinsoniennes et antihyperlipidémiques [22]. Les produits naturels ont, à travers l'histoire et en particulier dans la médecine traditionnelle, été utilisés pour le traitement d'une grande variété de maux et de maladies. Cette pratique remonte à l'Antiquité. Les méthodes de chimie des produits naturels qui existent depuis longtemps ont permis de trouver une grande variété de métabolites secondaires bioactifs provenant de sources terrestres et marines. Un nombre important de ces substances naturelles sont maintenant envisagées pour une utilisation en tant que produits pharmaceutiques potentiels [23].

Il existe un grand nombre de produits chimiques et de nutriments naturels qui n'ont pas encore été découverts et qui sont utiles à l'humanité. En conséquence, il existe une demande immédiate pour la recherche et le développement d'options thérapeutiques innovantes qui peuvent être utilisées avec succès dans des interventions thérapeutiques tout en créant un minimum d'effets indésirables.

Le processus de synthèse verte actuellement suggéré pour les FeNP est distinct et rentable. Dans l'étude actuelle, une tentative a été faite pour créer des nanoparticules à température ambiante sans l'utilisation de produits chimiques ou de techniques physiques. La plante Vitex leucoxylon a été choisie dans le but de synthétiser des nanoparticules de fer, et des modèles in vitro systématiques complets ont été réalisés pour évaluer la puissance des nanoparticules de fer. Seul un nombre limité de travaux de recherche sur le concept des nanoparticules et leurs applications biomédicales ont été publiés sur cette plante. En conséquence, nous avons décidé qu'il serait avantageux de mener cette recherche avec les objectifs suivants à l'esprit : dépistage des composés phytochimiques et mesure du nombre de métabolites secondaires chez V. leucoxylon ; synthèse verte et caractérisation des FeNPs de V. leucoxylon ; étude comparative des effets antioxydants et anti-inflammatoires de V. leucoxylon et de ses FeNPs in vitro ; activité cytotoxique in vitro de l'extrait aqueux de feuilles de V. leucoxylon et de ses FeNPs contre le cancer de la peau, le cancer du poumon et le cancer de la bouche ; activité cicatrisante in vitro de l'extrait aqueux de feuilles de V. leucoxylon et de ses FeNPs synthétiques par essai de grattage.

2. Matériels et méthodes

2.1. Collecte de matériel végétal

Au mois de mars 2022, des feuilles fraîches de V. leucoxylon ont été cueillies dans la zone forestière d'Anshi des Ghâts occidentaux dans le district d'Uttar Kannada de l'État du Karnataka en Inde. Les feuilles ont été identifiées et authentifiées par le Dr Kotresha K., taxonomiste, département de botanique, Karnataka Science College, Dharwad ; Karnataka, en se référant au spécimen de référence déposé au Département de botanique, Karnataka Science College, Dharwad, Karnataka. Après avoir été collecté, le matériel de feuilles de plantes fraîches a été lavé sous l'eau du robinet, séché au soleil, puis broyé en une poudre grossière à l'aide d'un broyeur mécanique. La poudre était conservée dans des récipients scellés à température ambiante afin de pouvoir être utilisée ultérieurement dans le processus d'extraction par solvant brut.

2.2. Préparation d'extrait de plante

À l'aide d'un appareil Soxhlet, 25 g de poudre de feuilles ont été extraites pendant 48 h avec 250 mL d'eau distillée. L'extrait aqueux a été concentré davantage à l'aide d'un roto-évaporateur, puis a été séché dans des dessiccateurs avant d'être conservé dans une bouteille fermée à 4 ◦C jusqu'à son utilisation. Pour la synthèse des FeNPs, l'extrait aqueux a été utilisé comme agent réducteur et stabilisant.

2.3. Solvants et réactifs

Tous les produits chimiques et solvants utilisés étaient de qualité analytique et ont été achetés chez Hi-media (Hubli, Inde).

2.4. Analyse Phytochimique

Suivant la procédure décrite par Deepti et al. (2012), l'extrait aqueux brut de feuilles V. leucoxylon a été testé qualitativement pour la présence de divers constituants phytochimiques tels que les flavonoïdes, les alcaloïdes, les phénols, les glycosides, les stérols, les lignines, les saponines, les anthraquinones, les tanins et les sucres réducteurs [24].

2.5. Synthèse de nanoparticules de fer

Tout d'abord, 1 ml d'extrait aqueux de feuilles de V. leucoxylon a été ajouté à 1 0 ml de solution aqueuse de FeSO4 0, 05 mM et le mélange a été secoué. A température ambiante et dans un environnement sombre, le processus de mélange réactionnel complet a été réalisé. La réaction d'oxydation/réduction était clairement visible après que le mélange réactionnel incolore ait été incubé et mis à réagir pendant la durée requise [25]. Afin d'éliminer toute trace d'extrait aqueux des FeNPs fraîchement synthétisés, que l'on a laissé sécher en poudre après centrifugation à 10,000 rpm pendant dix 10 min pendant la période de réaction souhaitée, le mélange aqueux contenant les FeNPs a été centrifugé une seconde fois et redispersé dans de l'eau bidistillée et séché [26].

2.6. Caractérisation des FeNPs

Plusieurs méthodes, telles que la spectroscopie ultraviolette visible (UV-Vis), la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR), la microscopie électronique à balayage et la spectroscopie de rayons X à dispersion d'énergie, la diffraction des rayons X (XRD), l'analyseur de taille de particules et zeta potentiels, ont été utilisés pour caractériser les FeNPs.

2.6.1. Analyse basée sur la spectroscopie UV-Visible

Tout d'abord, une aliquote de 1 ml de solution colloïdale de FeNPs dans des cuvettes en quartz a été évaluée par spectroscopie UV-visible (U-3310, Hitachi, Tokyo, Japon), en utilisant de l'eau distillée comme référence et 0.05 mM FeSO4 à blanc, pour valider la réduction des ions ferriques dans la solution colloïdale [27].

2.6.2. Analyse basée sur FTIR

Les groupes fonctionnels (groupes) liés à la surface du fer et impliqués dans la synthèse des FeNPs ont été identifiés à l'aide de la spectroscopie FTIR (S700, Nicolet, MA, USA), [28]. Après 72 h d'incubation, les FeNPs ont été isolés par centrifugation répétée (3 à 4 fois) des mélanges réactionnels à 10,000 rpm pendant 15 min. Le surnageant a été remplacé par de l'eau déminéralisée et le culot a été stocké sous forme de poudre. Après avoir été séchés, les FeNP ont été soumis à une analyse FTIR en utilisant le procédé de granulation au bromure de potassium dans un rapport de 1:100.

2.6.3. Analyse basée sur la microscopie électronique à balayage

La microscopie électronique à balayage (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, USA) a été utilisée pour examiner les nanoparticules et établir leur forme de surface. Les substrats ont été préparés sur un substrat Si propre de 5 mm × 5 mm clivé d'une tranche de 100 mm de diamètre. Le substrat a été laissé réagir pendant 2 h à 6 h et l'échantillon a été préparé en centrifugeant une solution colloïdale à 10,000 tr/min pendant 5 min. Le culot a été séché après avoir été recentrifugé plusieurs fois, après quoi il a été redispersé dans de l'eau désionisée et la procédure a été répétée. Enfin, le culot sec a été obtenu, qui a ensuite été soumis à la caractérisation structurelle par analyse SEM selon la procédure décrite par le National Institute of Standards and Technology, NIST-2007 [29].

2.6.4. Rayons X à dispersion d'énergie

Après séchage sur une grille de cuivre revêtue de carbone, les FeNPs réduits ont été analysés par EDX (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, USA), ce qui a également permis de déterminer la composition élémentaire.

2.6.5. Potentiel Zeta

Observations des NP Le potentiel zêta est un outil utile pour obtenir des informations supplémentaires sur la stabilité des NP colloïdales. L'amplitude du potentiel zêta fournit une indication sur la stabilité possible du colloïde. Selon Meléndrez et al. (2010), les particules sont considérées comme stables si leurs valeurs de potentiel zêta sont soit plus positives que plus 30 mV, soit plus négatives que 30 mV [30]. Ce fait doit être pris en considération. Le zêta-mètre laser a été utilisé pour acquérir des lectures des potentiels zêta de surface (Malvern zeta seizer 2000, Malvern, Royaume-Uni). Les échantillons liquides des nanoparticules, totalisant 5 millilitres, ont été dilués avec 50 millilitres d'eau bidistillée et 2 mm par mètre carré de chlorure de sodium ont été utilisés comme solution d'électrolyte en suspension. Après cela, le pH a été modifié jusqu'à ce qu'il atteigne le niveau souhaité. Les échantillons ont été agités pendant un total de 30 minutes. Après agitation du récipient, le pH à l'équilibre a été noté et le potentiel zêta des particules métalliques a été déterminé. Afin de déterminer le potentiel de surface des FeNP, le potentiel zêta a été utilisé. Dans chaque cas, la valeur indiquée était la moyenne des résultats de trois mesures individuelles. Lorsque les valeurs du potentiel zêta variaient de plus de plus 30 mV à moins de 30 mV, les critères de stabilité des NP ont été déterminés [31].

2.6.6. Analyseur de taille de particules

Afin de déterminer la taille des particules de l'échantillon, un test PSA a été effectué après qu'il ait été lyophilisé puis dispersé à l'aide d'un ultrasonateur (SZ-100, Horiba, Kyoto, Japon).

2.6.7. Analyse par diffraction des rayons X (XRD)

Les nanoparticules de fer synthétisées à partir d'extrait aqueux de feuilles de V. leucoxylon ont été soumises à une analyse XRD (Smart Lab SE, Rigaku, Tokyo, Japon) pour déterminer la nature ainsi que la taille moyenne des nanoparticules.

2.7. Détermination de l'activité antioxydante à l'aide de méthodes in vitro

2.7.1. Dosage du pouvoir antioxydant réducteur d'ions ferriques (FRAP)

Selon Oyaizu (1986), avec une modification mineure, le pouvoir réducteur des ions ferriques a été évalué [32]. Pendant 30 min à 50 ◦C, 2,5 mL de tampon phosphate 20 mM et 2,5 mL de ferricyanure de potassium à 1 % ont été ajoutés à 2,5 mL d'extrait de feuille de V. leucoxylon et ses FeNPs synthétisés mélangés avec la combinaison. Après la période d'incubation, le mélange a été additionné de 2,5 ml d'acide trichloroacétique à 10 % p/v et de 0,5 ml de chlorure ferrique à 0,1 % p/p avant d'être incubé pendant 10 minutes supplémentaires. Enfin, un spectrophotomètre UV-V a été utilisé pour détecter l'absorbance à 700 nm. Comme standard, l'acide ascorbique a été utilisé. Chaque échantillon a été testé trois fois.

2.7.2. Essai de piégeage du peroxyde d'hydrogène

Sur la base de la capacité de l'extrait aqueux de feuilles de V. leucoxylon et de ses FeNP synthétiques à piéger le peroxyde d'hydrogène, l'activité antioxydante de ces composés a été évaluée. Tout d'abord, {{0}}.6 mL de tampon phosphate (pH—7,4) contenant 4 mM H2O2 a été ajouté à 0,5 mL d'acide ascorbique standard à une concentration connue, ainsi que des tubes contenant des extraits de plantes à différentes concentrations allant de 100 µL à 500 µL (pH - 7,4). À l'aide d'un tampon phosphate et d'une solution à blanc sans peroxyde d'hydrogène, nous avons évalué l'absorbance de la solution à 230 nm après 10 min. Un tampon phosphate a été utilisé pour créer le contrôle au lieu de l'échantillon ou de l'étalon [33]. Chaque échantillon a été testé trois fois. L'approche de la formule a été utilisée pour calculer le pourcentage d'inhibition.

2.7.3. DPPH anti-radicaux libres

L'extrait de feuille de V. leucoxylon et les FeNP synthétisés ont été testés pour leur capacité à piéger les radicaux libres en utilisant le radical DPPH comme réactif [34]. Les échantillons ont été combinés avec une solution de radicaux DPPH (60 M) dans de l'éthanol (100 µL) à différentes concentrations (p/v). Un spectrophotomètre UV-Vis a été utilisé pour mesurer l'absorbance du mélange à 517 nm après 30 min d'incubation dans l'obscurité à température ambiante. L'acide ascorbique a été utilisé comme standard pour l'expérience. L'équation suivante a été utilisée pour déterminer l'activité de piégeage du DPPH de chaque échantillon :

où Ac représente l'absorbance de la réaction témoin, qui est réalisée en mélangeant 100 L d'éthanol avec 100 L de la solution DPPH, et At représente l'absorbance de l'échantillon à tester. Des expériences ont été menées en triplets. La valeur IC50 a été calculée pour chaque échantillon. Un niveau plus élevé d'activité de radicaux libres a été indiqué par le mélange réactionnel ayant une absorbance plus faible.

2.7.4. Dosage du phosphomolybdène (PM)

L'activité antioxydante totale a été déterminée en utilisant la technique standard de Prieto et al., 1999. Chaque tube à essai contenant 3 ml d'eau distillée et 1 ml de solution de réactif au molybdate a reçu un extrait aqueux de feuilles de V. leucoxylon et de ses FeNPs à des concentrations variées allant de 100 µL à 500 µL. Ces tubes ont été incubés pendant 90 min à 95 ◦C. L'absorbance du mélange réactionnel a été mesurée à 695 nm après que ces tubes ont été ajustés à température ambiante pendant 20 à 30 min après incubation. L'étalon de référence était l'acide ascorbique [35].

2.8. Évaluation de l'activité anti-inflammatoire in vitro

L'effet anti-inflammatoire de l'extrait aqueux de feuilles de V. leucoxylon et de ses FeNPs générés a été évalué à l'aide de la méthode de dénaturation des protéines décrite par Elias et al., 1988, avec de légères modifications [36]. Comme médicament standard, le diclofénac sodique a été utilisé. Un mélange réactionnel comprenant 2 mL de concentration connue de FeNPs fabriqués (100 g/mL) avec du diclofénac sodique standard (100 g/mL) et 2,8 mL de solution saline tamponnée au phosphate (pH 6,4) a été mélangé avec 2 mL d'œuf de poule frais. albumine (1 mM) et incubé à 27 ± 1 ◦C pendant 15 min. La dénaturation a été induite en plaçant le mélange réactionnel dans un bain-marie à 70 ◦C pendant 10 min. Après refroidissement, l'absorbance à 660 nm a été mesurée en utilisant de l'eau bidistillée comme blanc. Chaque test a été réalisé trois fois. La formule suivante a été utilisée pour calculer le pourcentage d'inhibition de la dénaturation des protéines :

où, à=absorbance de l'échantillon d'essai ; Ac=absorbance du contrôle.

2.9. Détermination de l'activité cytotoxique et anticancéreuse des nanoparticules de fer à l'aide du test MTT

L'effet de V. leucoxylon et de ses FeNPs synthétisés sur la viabilité des cellules fibroblastes non cancéreuses L292 et son activité anticancéreuse sur le cancer de la peau (A375), le cancer du poumon (A549) et le cancer de la bouche (KB-3-1) a été évalué en utilisant le test MTT standard, selon Carmichael et al., (1987) [37]. Toutes les lignées cellulaires ont été obtenues auprès du National Center for Cell Science (NCCS), Pune, Inde. Les valeurs de pourcentage d'inhibition de la croissance cellulaire (IC50) ont été dérivées en utilisant des courbes dose-réponse pour chaque lignée cellulaire, et la formule suivante a été utilisée pour calculer le pourcentage d'inhibition de la croissance. La conversion du MTT en un produit formazan violet par la déshydrogénase mitochondriale des cellules saines est à la base de cette expérience [38].

2.10. Étude in vitro sur la cicatrisation des plaies à l'aide du test Scratch Assay

Les capacités de propagation et de migration des cellules de la lignée cellulaire L292 causées par des échantillons contenant des concentrations connues d'extrait de plante et de nanoparticules de fer ont été examinées dans la présente enquête [39]. Des plaques de culture de cellules animales avec du milieu DMEM additionné de 10 % de FBS et de 2 % d'antibiotique Pen-Strep (Darmstadt, Allemagne) ont été utilisées pour démarrer le processus de culture cellulaire. Une pointe de pipette en plastique stérile a été utilisée pour gratter le confluent monocouche de cellules après qu'elles aient atteint environ 50 000 cellules par ml. Une solution de PBS a été utilisée pour éliminer tous les débris cellulaires indésirables. Comme témoin négatif, des cellules non traitées ont été utilisées, tandis que l'acide ascorbique standard a été utilisé comme témoin positif pour des échantillons de polymère de concentration connue. Pendant les 24 h suivantes, les cellules ont été maintenues à 37 ◦C avec 5 % de CO2. Pour l'examen de la migration cellulaire relative et de la fermeture de la plaie, les couches de cellules rayées ont été incubées et imagées à des intervalles allant de 0 h à 6 h à 12 h et 24 h. L'étalonnage de mesure de MagVision Software (X64, 2016, Magnus, New Delhi, Inde) à une résolution de 4 × a été utilisé pour quantifier la distance de l'écart. Afin de déterminer la fermeture de la plaie et le taux de migration, la formule ci-dessous a été utilisée :

en ce qui concerne les éléments suivants : A0h=surface de la plaie mesurée immédiatement après le grattage ; ATh=surface de la plaie mesurée après h heures ; Rm=taux de migration (µm/h) ; Wf=largeur initiale de la plaie (µm) ; et T=temps de migration (heure).

2.11. Analyses statistiques

Les données sont présentées sous forme d'écart-type moyen et d'erreur-type, et chaque expérience a été réalisée trois fois. La version 20 du logiciel SPSS a été utilisée pour effectuer une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) sur les différences de scores moyens qui existaient entre les groupes.

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