La surexpression de GRP78 déclenche la mitophagie neuroprotectrice PINK1- médiée par IP3R, partie 1

Abstrait:

Un modèle expérimental d'avulsion de la racine vertébrale (PR) est utile pour étudier les programmes moléculaires causals qui conduisent à une neurodégénérescence rétrograde après une déconnexion neurone-cible.

L'avulsion de la racine vertébrale est une lésion mortelle du système nerveux central qui peut avoir un impact significatif sur la vie quotidienne et les capacités cognitives du patient. Heureusement, la mémoire n’est pas nécessairement affectée et la plupart des patients peuvent améliorer leur mémoire grâce à certaines méthodes efficaces de réadaptation cognitive.

Plusieurs études ont montré que l'avulsion de la racine vertébrale n'affecte pas directement la mémoire d'une personne, mais affecte principalement les capacités cognitives du cerveau du patient, notamment l'attention, la cognition et l'apprentissage. Cela signifie que même si elles sont affectées par une avulsion de la racine vertébrale, de nombreuses personnes ont encore une bonne mémoire.

Par conséquent, pour les personnes touchées par une avulsion de la racine vertébrale, l’amélioration des capacités cognitives est la clé de l’amélioration de la mémoire. La rééducation cognitive est une méthode efficace qui peut aider les patients à reconstruire les capacités cognitives de leur cerveau et ainsi à améliorer leur mémoire. Ces méthodes incluent le cloze, les opérations mathématiques, etc., qui peuvent aider les patients à améliorer leur concentration, leur sensibilité et leur vitesse de réaction.

De plus, une attitude positive est également un facteur important pour améliorer la mémoire. Les patients présentant une avulsion radiculaire, lorsqu'ils sont confrontés à des défis et à des difficultés, doivent essayer de maintenir une attitude optimiste et d'affronter courageusement les différents défis de la vie pour obtenir les meilleurs résultats dans le processus de rééducation.

En résumé, les lésions par avulsion de la racine de la moelle épinière n’affectent pas directement la mémoire d’une personne. La plupart des gens peuvent améliorer leur mémoire grâce à des méthodes efficaces telles que la rééducation cognitive. Dans le même temps, une attitude optimiste est également la clé pour améliorer la mémoire. Au cours du processus de réadaptation, nous devons croire fermement que nous pouvons surmonter les difficultés et progresser pas à pas vers un avenir sain. On voit que nous devons améliorer notre mémoire. Le cistanche peut améliorer considérablement la mémoire car le cistanche est une matière médicinale traditionnelle chinoise avec de nombreux effets uniques, dont l'un est d'améliorer la mémoire. L'efficacité du Cistanche provient de ses différents ingrédients actifs, notamment l'acide tannique, les polysaccharides, les glycosides flavonoïdes, etc. Ces ingrédients peuvent favoriser la santé cérébrale de diverses manières.

Cliquez sur connaître 10 façons d'améliorer la mémoire

Ce processus neurodégénératif partage des caractéristiques communes avec les processus liés aux maladies neuronales, tels que la présence d'un stress du réticulum endoplasmique (RE) et le blocage du flux de l'autophagie.

Nous avions précédemment constaté que la surexpression de GRP78 favorisait la neuroprotection motoneuronale après une PR. Après cela, nous avons cherché à élucider le mécanisme sous-jacent en effectuant une protéoanalyse comparative impartiale et des interventions pharmacologiques et génétiques.

De manière inattendue, les facteurs mitochondriaux se sont révélés plus altérés lorsque GRP78 était surexprimé, et l’abondance de mitochondries englouties, une caractéristique de la mitophagie, a également été observée par microscopie électronique dans les motoneurones lésés par la PR après la surexpression de GRP78.

De plus, la surexpression de GRP78 a augmenté le marquage des mitochondries LC3-, favorisé la translocation PINK1 et l'induction de la mitophagie, et récupéré la fonction mitochondriale dans les cellules stressées par l'ER.

Enfin, nous avons constaté que la mitophagie pro-survie favorisée par le GRP78- était médiée par PINK1 et IP3R dans notre modèle in vitro de mort motoneuronale. Ces données indiquent une nouvelle relation entre le chaperon GRP78 et la mitophagie, ouvrant de nouvelles options thérapeutiques pour la conception de médicaments visant à obtenir une neuroprotection.

Mots clés : GRP78/BiP ; mitophagie; les motoneurones; neurodégénérescence; neuroprotection.

1. Introduction

La perturbation de la connectivité neuronale fonctionnelle est une caractéristique précoce courante des processus neurodégénératifs [1]. La dégénérescence axonale isole les neurones qui succombent à un processus de dysfonctionnement rétrograde et progressif.

Face à des dommages, les neurones réagissent, activant des mécanismes endogènes de neuroprotection tels que la réponse protéique dépliée (UPR), la réponse au choc thermique, la voie de l'autophagie, le système ubiquitine-protéasome, l'expression des chaperons, la machinerie de dégradation associée au réticulum endoplasmique (RE). (ERAD), et la défense antioxydante.

Bien que leur activation précise soit efficace pour récupérer la cellule, des dommages excessifs ainsi que le vieillissement peuvent entraîner le fonctionnement défectueux d'un ou plusieurs de ces programmes.

Nous avons estimé qu'imiter la nature et renforcer ces mécanismes endogènes pourrait constituer une stratégie efficace pour la neuroprotection [2,3]. Le GRP78, également connu sous le nom de BiP ou protéine de choc thermique 5a (HSP5a), est une protéine multifonctionnelle ayant des fonctions critiques dans les mécanismes endogènes de neuroprotection [4 ]. GRP78 orchestre l'UPR, qui est activé après un stress ER, a une activité ATPase et est une protéine de liaison au Ca 2+ [5,6].

Il agit également pour favoriser le repliement approprié des protéines nouvellement synthétisées ou mal repliées et pour cibler les protéines désassemblées en vue de leur dégradation par la machine ERAD (examiné dans [7]).

Les preuves suggèrent également que GRP78 participe au déclenchement de la macroautophagie, qui élimine à la fois les formes solubles et agrégées de protéines dépliées et d'organites dysfonctionnels [8-15].

Il a été prouvé que la surexpression de GRP78 est beneuroprotectrice dans plusieurs modèles de neurodégénérescence [16-23], et une réduction des niveaux de GRP78 a été observée au cours du vieillissement et tout au long de la progression des troubles dégénératifs [24].

Certaines de ces études ont rapporté que la neuroprotection était médiée par l'inhibition de l'apoptose ; cependant, l'apoptose est rarement la principale cause de mort des cellules neuronales au cours des processus neurodégénératifs (20, 25–27).

Ainsi, notre objectif principal est d’établir les mécanismes par lesquels la surexpression de GRP78 conduit à une neuroprotection en utilisant des modèles non transgéniques de neurodégénérescence.

En particulier, en exploitant les avantages anatomiques et techniques de plusieurs modèles d'axotomie des motoneurones spinaux (MN), nous avons précédemment signalé que l'avulsion des racines nerveuses (PR) initiait un processus rétrograde de neurodégénérescence motrice (80 % de la perte de MN sur un mois après la blessure) caractérisé par la présence de stress ER, le blocage du flux de l'autophagie, l'arrêt du trafic de vésicules et de protéines, la concurrence apoptose/antiapoptose/anoikisinitiation mais l'absence d'exécution efficace de l'apoptose (20,25,28).

Nous avons découvert que l'expression de GRP78 est perdue environ 5 jours après la PR au sein des MN endommagés et que sa surexpression forcée permet leur survie après axotomie. Comme nous l’avons décrit précédemment, une résolution correcte de l’autophagie augmente la survie des neurones après PR [26], nous nous demandons s’il est possible de décrypter si l’autophagie sélective peut avoir un effet protecteur.

Par conséquent, nous avons utilisé un modèle de PR pour clarifier les mécanismes qui interviennent dans la neuroprotection du GRP78 à l'aide d'une analyse protéomique impartiale, et nous avons en outre validé l'hypothèse résultante par une analyse approfondie in vitro utilisant un traitement à la tunicamycine qui déclenche à la fois le stress du RE et l'arrêt du trafic de protéines, deux caractéristiques principales du modèle de PR. [26].

2. Matériels et méthodes

2.1. Procédures chirurgicales

Des rats femelles Sprague – Dawley âgés de 12 semaines ont été gardés dans des conditions standard de lumière et de température et ont reçu de la nourriture et de l'eau à volonté. Nous avons réalisé des interventions chirurgicales sous anesthésie avec un cocktail de kétamine/xylazine (0,1 mL/100 g de poids) par voie intrapéritonéale, essentiellement comme indiqué précédemment [26,27].

Pour réaliser une avulsion extra-vertébrale des racines L4 – L5, nous avons pratiqué une incision cutanée médiane pour identifier chaque côté du nerf sciatique et appliqué une traction modérée sur des racines sélectionnées à l'écart des foramens intervertébraux, obtenant ainsi les nerfs spinaux mixtes contenant les racines motrices et sensorielles. ganglions de la racine dorsale.

La plaie a été suturée par avions et désinfectée avec de la povidone iodée, et les animaux ont pu récupérer dans un environnement chaud. Des animaux opérés de manière factice ont été utilisés comme témoins.

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été réalisées par les autorités espagnoles (Real Decreto 53/2013) et européennes (2010/63/UE), et ont été approuvées par le Département d'Agriculture, Ramaderia, Pesca, Alimentació i MediNatural du Gouvernement Catalan (Generalitat de Catalogne).

2.2. Construction, purification et infection par des vecteurs viraux

L'ADNc codant pour GRP78 (ATCC, LGC Promochem, Teddington, Royaume-Uni) a été cloné dans le vecteur navette pAC.CMV. Les adénovirus recombinants ont été construits par recombinaison homologue dans des cellules HEK293.

L'adénovirus témoin exprimant la galactosidase bactérienne (Ad- -gal) était un cadeau de CB Newgard (Duke University, Durham, Caroline du Nord, États-Unis). Les virus ont été purifiés à l'aide du kit Vivapure AdenoPackTM 20 selon les instructions du fabricant (Sartorius, Göttingen, Allemagne).

Pour la construction de vecteurs adéno-associés, l'ADNc de GRP78 a été cloné dans les sites NheI et HindIII entre les domaines ITR de AAV2 sous la régulation d'un promoteur CMV et de l'élément sensible au virus de l'hépatite de la marmotte (29).

Le vecteur AAVrh10 a été généré comme décrit précédemment [30] par triple transfection de cellules HEK293-AAV (Stratagene, Bellingham, WA, USA) avec de la polyéthylèneimine ramifiée (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) avec le plasmide contenant les ITR de l'AAV2, le plasmide auxiliaire de l'AAV contenant Rep2 et Capfor rh10 (aimablement fourni par JM Wilson, Université de Pennsylvanie, Philadelphie, PA, États-Unis) et le plasmide pXX6 contenant les gènes adénoviraux auxiliaires (31). Les vecteurs recombinants ont été clarifiés après traitement à la benzonase (50 U/mL, Novagen, Madison, WI, USA) et précipitation au polyéthylène glycol (PEG 8000, Sigma-Aldrich).

Les vecteurs ont été purifiés par gradient d'iodixanol par l'unité de production de vecteurs du CBATEG-UAB selon des procédures opérationnelles standard. Les génomes viraux par ml (VG/mL) ont été quantifiés à l'aide de PicoGreen (Invitrogen, Waltham, MA, USA).

Immédiatement après la PR, les animaux ont reçu une injection de 14 µL de virus Ad-GRP78 ou Ad-gal (108 pfu/mL) à l'aide d'une aiguille de calibre 33- et d'une seringue Hamilton dans l'espace thécal au niveau du site lombaire.

Alternativement, l'administration intrathécale de 10 µL de 4 × 10−10 génomes viraux du virus adéno-associé AAVrh10 pour surexprimer GFP ou GRP78 a été lentement injectée dans le LCR entre les vertèbres L3 et L4 d'animaux anesthésiés à l'isoflurane trois semaines avant la PR (32).

Nous avons utilisé l’AAVrh10 car il infecte spécifiquement 30 % des motoneurones spinaux [32]. L'accès approprié à l'espace intrathécal a été confirmé par le coup de queue d'animal. Les aiguilles ont été maintenues en place au site d'injection pendant 1 minute, après quoi les muscles et la peau ont été suturés.

2.3. Préparation des échantillons et analyse protéomique

Nous avons anesthésié des rats (n=4 – 5) à 7 dpi et obtenu des échantillons de segments de moelle épinière L4 – L5 (5- mm de longueur), qui ont été congelés dans de l'azote liquide. Nous avons homogénéisé le tissu dans un tampon de lyse (HEPES 20 mM, pH 7,7, saccharose 250 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM et un cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase) avec un homogénéisateur Potter sur glace.

Après centrifugation des lysats à 800 × g pendant 20 min à 4 ◦C, nous avons collecté les surnageants de la fraction post-nucléaire et quantifié les protéines par test BCA (Pierce Chemical Co., Dallas, TX, USA).

Pour l'analyse protéomique, nous avons solubilisé 75 µg de chaque échantillon dans 4 % de SDS, 8 M d'urée, 0,1 M HEPES, pH 7,7, 0,1 M DTT, ajouté 0. 05 M d'iodoacétamide et digéré avec de la trypsine (rapport enzyme: substrat 1:10) en utilisant la méthode de préparation d'échantillons assistée par filtre (FASP).

Tous les échantillons ont été traités en parallèle. Nous avons analysé les échantillons à l'aide d'un spectromètre de masse LTQ-OrbitrapVelos (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) couplé à un ProxeonEasyLC (Thermo Fisher Scientific). Nous avons chargé les mélanges de peptides directement sur la colonne analytique (2 µL ·min−1) et les peptides séparés par chromatographie en phase inversée en utilisant une colonne de 15- cm d'un diamètre intérieur de 100 µm remplie de particules C18 de 5- µm (NikkyoTechnos Co., Tokyo, Japon).

Les gradients chromatographiques ont commencé à 97 % de tampon A (0,1 % d'acide formique (FA) dans l'eau) et à 3 % de tampon B (acétonitrile, 0,1 % FA) avec un débit de 500 nl. ·min−1, et augmenté à 85 % du tampon A + 15 % du tampon B sur 4 min, et à 55 % du tampon A + 45 % du tampon B sur 120 min.

Nous avons utilisé l'instrument en mode d'acquisition dépendante des données TOP20 avec un scan MS complet dans l'Orbitrap à une résolution de 60,000 et une plage de masse de m/z 350–2000 suivi par des spectres MS-MS des 20 ions les plus intenses. . Nous avons utilisé le piège à ions avec une méthode de dissociation induite par collision pour produire des spectres d'ions fragmentés et utilisé une énergie de collision normalisée à 35 %. Nous avons acquis toutes les données avec le logiciel Xcalibur v2.1.

Nous avons utilisé la suite logicielle Proteome Discoverer (v1.3.0.339, Thermo Fisher Scientific) et le moteur de recherche Mascot (v2.3.01, Matrix Science50) pour l'identification et la quantification des peptides.

Nous avons analysé les données par rapport à la base de données SwissProt Rat contenant les contaminants les plus courants (599 entrées). Nous avons utilisé une tolérance de masse des ions précurseurs de 7 ppm au niveau MS1 et avons autorisé jusqu'à trois clivages erronés pour la trypsine.

La tolérance de masse des ions fragments a été fixée à 0,5 Da. L'oxydation de la méthionine et l'acétylation de la protéine N-terminale ont été définies comme modifications variables, et la carbamidométhylation de la cystéine a été définie comme modification fixe.

Nous avons filtré les peptides en fonction de leur taux de fausses découvertes (FDR > 5 % non pris en compte). Pour la quantification des peptides, nous avons considéré le pic chromatographique des peptides calculé à l'aide du ProteomeDiscoverer et avons normalisé les zones par transformation log2 en utilisant R 3.0.2. Nous avons quantifié les données à l'aide du package R MSstats (v. 2.0.1).

Pour chaque ratio, nous avons calculé la valeur p ajustée (p < 0,05 pour la signification). Enfin, nous avons effectué une analyse de l'ontologie génétique et des voies pour les protéines régulées avec les outils Web d'annotation DAVID (https://david.ncifcrf.gov/ consulté le 28 mai 2021) et KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway. html, consulté le 28 mai 2021), comme nous l'avons réalisé précédemment (voir plus de détails dans [25]).

2.4. Immunohistochimie et analyse d'images

Après une anesthésie profonde au pentobarbital, nous avons perfusé les animaux par voie transcardiale avec une solution saline contenant 10 U/mL d'héparine, suivie de 4 % de paraformaldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2 pour la fixation des tissus à 7 dpi (n {{7 }} pour chaque condition), et retiré les segments L4 et L5 (5- mm de longueur totale) de la moelle épinière, qui ont été post-fixés dans le même fixateur pendant 4 h et cryoconservés dans 30 % de saccharose pendant la nuit.

Des coupes transversales en série ({{0}} µm d'épaisseur) ont été obtenues sur des lames gélatinisées à l'aide d'un cryotome (Leica, Wetzlar, Allemagne) et conservées à -20 ◦C jusqu'à l'analyse. Pour l'immunohistochimie, nous avons traité les lames avec une solution de blocage dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) avec 0,03 % de TritonX-100 et 10 % de sérum bovin pendant 1 h, puis incubées avec différents anticorps primaires : anti-LC3B de lapin (ab51520 ; Abcam ; 1 : 200) ou anti-COXIV de souris (A21355 ; LifeTechnologies ; 1 : 500).

Après plusieurs lavages avec du TBS, 0,05 % Tween-20, les coupes ont été incubées pendant 2 h avec des anticorps anti-lapin d'âne conjugués Cy-2 ou Cy-3 (JacksonImmunoresearch, West Grove, Pennsylvanie, États-Unis).

Nous avons contre-coloré les coupes avec du DAPI (Sigma, St Louis, MO, USA) ou NeuroTrace Fluorescent Nissl Stain (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) et monté les tranches avec le milieu de montage Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA) ou Mowiol fait à la main.

Les sections à comparer ont été traitées ensemble sur la même lame et le même jour.

Des images des échantillons de moelle épinière provenant de différents traitements et contrôles ont été prises avec le même temps d'exposition, la même sensibilité et la même résolution pour chaque marqueur analysé à l'aide d'un microscope confocal (Zeiss LSM 700). Nous avons analysé l'intensité du signal avec le logiciel ImageJ (National Institutes ofHealth ; disponible sur http://rsb.info.nih.gov/ij/, consulté le 28 mai 2021).

For more information:1950477648nn@gmail.com