La surexpression de GRP78 déclenche la mitophagie neuroprotectrice PINK1- médiée par IP3R, partie 2

2.5. Western Blot

Nous avons profondément anesthésié des rats avec Dolethal (n=4) à 7 dpi pour obtenir des segments de moelle épinière L4 – L5 (5- mm de longueur) pour l'analyse par Western blot. Nous avons congelé les échantillons dans de l'azote liquide.

Ces dernières années, de plus en plus de résultats de recherche ont montré qu’il existe une relation étroite entre le transfert de protéines et la mémoire. Le transfert de protéines est une technique analytique permettant de détecter l’expression des protéines, largement utilisée dans la recherche en neurosciences.

La connexion entre les neurones est étroitement liée au stockage de la mémoire. Le transfert de protéines peut détecter l'état de connexion entre les neurones et l'expression de protéines pré- et post-synaptiques, révélant ainsi le rôle important des protéines dans la formation et le stockage de la mémoire.

Des études ont montré que l’expression des protéines neuronales présynaptiques est étroitement liée à la formation et au stockage de la mémoire. Par exemple, au cours du processus d’apprentissage et de mémoire, les neurones modifient l’expression des protéines présynaptiques, et ce changement est lié à la formation et au stockage de nouveaux souvenirs. En outre, certaines études ont également montré que des modifications dans l'expression de certaines protéines sont liées à des maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer.

Par conséquent, le transfert de protéines peut fournir une compréhension approfondie de l’état des connexions entre les neurones et des changements dans l’expression des protéines associées, révélant ainsi le mécanisme moléculaire des neurones. Ceci revêt une grande importance pour l’étude du mécanisme de formation de la mémoire et des maladies neurodégénératives.

En bref, la relation entre le transfert de protéines et la mémoire montre le rôle des protéines dans la connexion entre les neurones et le stockage de la mémoire. Cela fournit de nouvelles idées et orientations pour étudier le mécanisme de formation de la mémoire et les maladies neurodégénératives. Favorisons activement la recherche en neurosciences et contribuons à la santé et à la longévité ! On peut voir que nous devons améliorer la mémoire, et Cistanche peut améliorer considérablement la mémoire car il a des effets antioxydants, anti-inflammatoires et anti-âge, qui peuvent aider à réduire les réponses oxydatives et inflammatoires dans le cerveau, protégeant ainsi la santé du système nerveux. système. En outre, Cistanche peut également favoriser la croissance et la réparation des cellules nerveuses, améliorant ainsi la connectivité et le fonctionnement des réseaux neuronaux. Ces effets peuvent contribuer à améliorer la mémoire, la capacité d’apprentissage et la vitesse de réflexion, et peuvent également prévenir l’apparition de dysfonctionnements cognitifs et de maladies neurodégénératives.

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Les échantillons ont été stockés ou traités ultérieurement par homogénéisation dans un tampon de lyse (HEPES 20 mM, pH 7,7, saccharose 251 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM et un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Sigma-Aldrich) et de phosphatase (Roche, Bâle, Suisse). ) avec un homogénéisateur Potter sur glace.

Après centrifugation des lysats à 800 × g pendant 20 min à 4°C, nous avons collecté le surnageant en tant que fraction post-nucléaire et quantifié les protéines par BCAassay (Pierce Chemical Co.).

Pour le Western Blot, nous avons chargé 30 µg de fractions post-nucléaires de segments L4 – L5 de chaque animal sur des gels SDS-polyacrylamide à 12 % pour effectuer une séparation électrophorétique des protéines suivie d'un transfert sur une membrane PVDF dans un système BioRadcuvette en 25 mM. Tris, pH 8,4, glycine 192 mM, 20 % (v/v) de méthanol.

Nous avons bloqué les membranes avec 5 % de BSA dans du PBS plus 0,1 % de Tween-20 pendant 1 h à température ambiante, puis incubées à 4 ◦C pendant la nuit avec un anticorps primaire : anti- -actine de souris ( 1:10000 ; SigmaAldrich), anti-GRP78 de souris (1 :500, Sigma-Aldrich), anti-CV de souris (1 :1000, Invitrogen), anti-HSP60 de lapin (1 :500, Antibodies-online), anti- NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), anti-OPA1 de souris (1:1000, BD Biosciences), anti-Parkin de lapin (1:500, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anti-PINK1 de souris (1:500, Abcam), anti-NRF2 de lapin (1: 500, Abcam), anti-MNF2 (1: 500, Abcam), anti-GRP75 de lapin (1: 500, Abcam).

Après plusieurs lavages, les membranes ont été incubées pendant 2 h avec un anticorps secondaire approprié conjugué à la peroxydase de raifort (1: 5 0 00, vecteur). La membrane a été visualisée à l'aide d'un mélange chimiluminescent de 1: 1 (luminol 0,5 M, acide p-coumarique 79,2 mM, Tris-HCl 1 M, pH 8,5) et (peroxyde d'hydrogène 8,8 M, Tris-HCl 1 M; pH 8,5), et le les images ont été prises avec un appareil Gene Genome et analysées avec les logiciels Gene Snap et Gene Tools (Syngene).

2.6. Modèle in vitro

Les cellules NSC34 ont été cultivées dans du milieu d'Eagle modifié à haute teneur en glucose (DMEM, Biochrom, Cambridge, Royaume-Uni) additionné de 1 0 % de sérum de veau fœtal (Sigma-Aldrich), 100 unités/mL de pénicilline et 0,5 X de solution de pénicilline/streptomycine. (Sigma-Aldrich) et maintenu dans un incubateur humidifié à 37 ◦C sous 5% de CO2, essentiellement comme décrit précédemment [26].

Après 4 jours de culture cellulaire sans changement de milieu, les cellules NSC34 présentaient un phénotype différencié caractérisé par la présence de longs neurites. Au jour 4, des médicaments ont été ajoutés aux cellules. Les solutions Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) et EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, USA) ont été préparées à une concentration de 10X et dissoutes dans du DMEM.

Après 24 h, nous avons évalué la viabilité cellulaire en incubant les cellules avec une solution de MTT à 4 mg/mL pendant 3 h. Les cristaux de formazan bleu formés ont été dissous dans du DMSO et l'absorbance à 570 nm a été mesurée avec un lecteur de microplaques (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA).

2.7. Nucléofection

Nous avons transfecté un million de cellules avec 2 µg de plasmide pour l'expression de GFP, GRP78, HAPARK, sh-eGFP de souris, sh-PINK1 de souris (ID 68943, Tebu-bio), sh-Hspa5 de souris (ID 14828, Tebu-bio) et /ou souris sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) en utilisant l'Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Bâle, Suisse) et le kit Nucleofactor V (Lonza) suivant les recommandations du fabricant.

Pour l'analyse cytométrique statique, nous avons ensemencé les cellules dans des plaques de {{0}} puits recouvertes de collagène à 10 %. Après la culture, nous avons fixé les cellules avec 4 % de PFA, rincé deux fois avec du PBS et stocké ou ajouté ultérieurement un tampon de blocage contenant du PBS à 0,3 % (v/v) de Triton X-100 et 10 % de sérum de veau fœtal. Après 3 jours de culture cellulaire, des médicaments dissous dans le DMEM ont été ajoutés.

Pour ces expériences, nous avons utilisé 1 µM de Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM de CsA (Sigma-Aldrich) ou 10 µM de BAPTA-AM (Sigma -Aldrich).Après 5 heures après le traitement, nous avons soit fixé les cellules pour immunocytochimie avec 4 % de PFA, soit les avons homogénéisées dans un tampon RIPA modifié (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM , 1 % NP-40, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS, cocktails de protéases et de phosphatases) pour l'immunotransfert. L'immunohistochimie a été réalisée en rinçant les échantillons deux fois avec du PBS et en incubant avec un tampon de blocage contenant du PBS plus 0,3 % (v/v) de Triton X-100 et 10 % de sérum bovin fœtal.

Nous avons incubé avec les anticorps primaires suivants : anti-IP3R de lapin (1 : 200, Abcam), anti-HA de souris (1 : 2000, Abcam), anti-GRP78 de souris (1 : 200, Sigma-Aldrich) et anti-HSP60 de lapin. (1: 500, Antibodies-online). Pour évaluer la viabilité par MTT comme décrit ci-dessus, nous avons laissé le traitement pendant 24 h.

2.8. Mesure de la production de superoxyde mitochondrial et de ∆ψM

Les cellules ont été incubées avec 2,5 µM de MitoSOX pour l'analyse du superoxyde ou avec 2,5 µMTMRM pour l'analyse ∆ψM, provenant de Molecular Probes et d'Invitrogen au cours des 30 dernières minutes de traitement. La fluorescence a été détectée avec un microscope IX81 Olympus et quantifiée à l'aide du logiciel de cytométrie statique.

2.9. Mesure électrochimique de la consommation d'oxygène

Les cellules (1 × 106 pour 1 ml dans HBSS) ont été agitées dans une chambre étanche aux gaz à 37 °C. Les mesures ont été prises avec une électrode O2 de type Clark (Rank Brothers, Cambridge, Royaume-Uni) et enregistrées avec les données Dup.18. dispositif d'acquisition (WPI) immédiatement après 5-htraitement avec un véhicule ou Tun.

2.10. Fractionnement mitochondrial et cytosolique

Les cellules ont été homogénéisées dans un tampon de lyse (HEPES 10 mM, pH 7, 4, EGTA 1 mM, saccharose 250 mM et un cocktail de protéases (Sigma-Aldrich) et d'inhibiteurs de phosphatase (Roche)) avec un homogénéisateur Potter sur glace.

Après centrifugation des lysats à 2000× g pendant 5 min, le surnageant a été centrifugé à 10 000 × g pendant 12 min. Le surnageant était considéré comme la fraction soluble (S2) et contient des protéines cytosoliques et des microsomes.

La pastille (P2) était la fraction mitochondriale enrichie, qui a été remise en suspension dans un tampon RIPA modifié (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, NP 1 %{{8 }}, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS, cocktails de protéase et de phosphatase) et la concentration en protéines a été déterminée par test BCA. Les échantillons ont ensuite été traités pour le Western Blot.

2.11. Microscopie électronique à transmission

Nous avons immergé les segments L{{0}}L5 de la moelle épinière (tranches de 1- mm) dans une solution fixatrice de 2 % (p/v) de PFA et 2,5 % (v/v) de glutaraldéhyde (qualité EM) dans 0,1 M PBS, pH 7,4 et les a placés sur une plate-forme à bascule pendant 2 h, puis fixés dans 1 % (p/v) de PFA et ensuite postfixés avec 1 % (p/v) de tétroxyde d'osmium (TAAB Lab ) contenant 0,08 % (p/v) d’hexacyanoferrate de potassium (Sigma-Aldrich) dans du PBS pendant 2 h.

Nous avons effectué quatre lavages avec de l'eau déminéralisée et une déshydratation séquentielle dans l'acétone. Toutes les procédures ont été réalisées à 4 ◦C, comme décrit précédemment [33]. Nous avons incorporé des échantillons dans de la résine EPON et polymérisé à 60 ◦C pendant 48 h.

Les échantillons ont été traités pour obtenir des coupes semi-minces (1 µm) avec un microtome Leicaultracut UCT, colorées avec une solution aqueuse à 1 % (p/v) de bleu de toluidine, et examinées au microscope optique pour identifier les zones de corne ventrale enrichies en MN.

Des coupes ultrafines (70 nm) ont été coupées avec un couteau diamanté, placées sur des grilles enduites et contrastées avec des solutions conventionnelles d'acétate d'uranyle et de citrate de plomb de Reynolds.

Enfin, nous avons observé les coupes avec un microscope électronique à transmission (Jeol 1400) équipé d'une caméra GatanUltrascan ES1000CCD. Nous avons sélectionné trois tranches par condition, analysé trois MN par section et mesuré les zones de noyaux par rapport à la surface totale du MN à l'aide des outils ImageJ.

2.12. Bioinformatique et statistiques

Nous avons utilisé des analyses de variance (ANOVA) pour comparer les valeurs de différents groupes expérimentaux pour les données répondant à l'hypothèse de normalité. Les différences entre les groupes ont été analysées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle, suivie du test post hoc à plages multiples de Tukey ou du test t de Student. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism5 (n=3 –5 ; p < 0,05 pour la signification).

3. Résultats

3.1. Texte

3.1.1. L'analyse protéomique de la surexpression de GRP78 a révélé que les mitochondries étaient la cible principale

Afin d'identifier les mécanismes moléculaires conduisant à la neuroprotection médiée par la surexpression de GRP78, nous avons effectué une analyse protéomique comparative sans étiquette afin d'identifier les différences quantitatives et qualitatives entre les animaux blessés par la PR et infectés par des adénovirus pour la surexpression de GRP78 (Ad-GRP78), précédemment jugé neuroprotecteur. de MN, ou de bêta-galactosidase (Ad-ß-Gal) comme contrôle [20].

Selon des études antérieures réalisées dans notre laboratoire, sept jours après la blessure (dpi) étaient le délai choisi pour l'analyse [20,25]. Dans une comparaison précédente entre un modèle de régénération après axotomie distale et suture du nerf sciatique et notre modèle de PR dégénérative, nous avons observé que les événements de signalisation étaient similaires jusqu'à 7 dpi, lorsque des événements pro-dégénératifs divergents sont apparus après la PR [20,25].

L'analyse LC-MS/MS sans marquage des fractions post-nucléaires des segments de moelle épinière L4-L5 a abouti à l'identification de 1420 protéines, avec au moins deux peptides par protéine, comme indiqué précédemment pour d'autres échantillons et études [25] .

Au total, 566 et 732 protéines ou peptides ont été altérés de manière significative en raison de la surexpression d'Ad-GRP78 ou d'Ad-ß-Gal, respectivement, chez les animaux blessés par PR, par rapport aux animaux blessés par PR non infectés par un virus (p < 0 .05) (Tableaux S1 et S2).

Nous avons comparé les deux listes et avons constaté que 220 étaient modifiés de manière unique en raison de la surexpression d'Ad-GRP78 (tableau S3). L'annotation fonctionnelle de ces protéines à l'aide de l'outil Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) nous a permis d'identifier les fonctions biologiques les plus significatives dans l'ensemble de données (FDR < 0,05) [34,35].

La surexpression de GRP78 a entraîné des différences dans les niveaux de protéines impliquées dans les processus, la fonction et les composants mitochondriaux (Tableau S4A – C, Figure S1A – C). Les termes de Gene Ontology (GO) et l'analyse d'enrichissement de la voie KEGG de ces données ont révélé que chez les animaux infectés par Ad-GRP78, il y avait des diminutions significatives des niveaux de nombreuses protéines ayant des fonctions mitochondriales, y compris les protéines de la face mitochondriale externe et interne, les protéines du complexe respiratoire, et les protéines matricielles.

Nous avons confirmé les différences dans les niveaux de protéines révélées dans la liste protéomique, telles que GRP75, qui était régulée positivement (p < 0,05), et la sous-unité du complexe V (CV), régulée négativement (p=0,03). dans les groupes GRP78 comme prévu (Figure 1A).

Dans l'ensemble de la liste, les plus fortement régulées négativement étaient la protéine OGC (SCL25A11) 2-oxoglutarate/malatecarrier, MT-ND3 (un suppresseur de tumeur qui participe à la navette malate-aspartate et régénère le pool NADH dans la matrice mitochondriale pour permettre au complexe I), la sous-unité NADH déshydrogénase 3 du complexe I, l'acide gammaaminobutyrique aminotransférase ABAT et la sous-unité ubiquinol-cytochrome C réductase du complexe III. En revanche, très peu de protéines étaient régulées positivement (Figure 1B).

Comme prévu, une protéine régulée positivement était GRP78, et les autres protéines régulées positivement étaient le transporteur d'acides aminés EAAT2, qui est principalement situé dans la membrane plasmique et parfois dans les mitochondries au niveau des synapses excitatrices, et l'hydroxyacyl-CoA déshydrogénase HADHA, qui catalyse les trois dernières étapes de la bêta mitochondriale. -oxydation des acides gras à longue chaîne.

Nous avons étendu l'analyse pour déterminer si d'autres protéines des mitochondries ou des protéines liées à la fonction des mitochondries ont été modifiées en dehors de la liste protéomique afin de confirmer l'affectation fonctionnelle des mitochondries (Figure 1C).

Nous avons observé que l'atrophie optique 1 de la GTPase 1 (OPA1) liée à la dynamine conservée mitochondriale, impliquée dans la fusion (36), était régulée négativement (p < 0,1) ; LONP1, une protéase dépendante de l'ATP qui intervient dans la dégradation sélective des polypeptides mal repliés, a tendance à augmenter, mais aucune différence n'a été observée dans les niveaux d'ubiquinone NDUFA9, le facteur de transcription NRF2, qui régule les gènes contenant des éléments de réponse antioxydants, ou d'autres dynamines. -des GTPase liées à la perfusion, telles que la mitofusine 2 (MFN2) [36].

Un résumé complet des altérations trouvées dans les mitochondries est présenté dans le schéma de la figure 1D. La dynamique mitochondriale est importante pour les réponses au stress, car les mitochondries endommagées peuvent fusionner pour l'échange de matière, et la fission mitochondriale permet la ségrégation des mitochondries endommagées et la mitophagie ultérieure (37).

Considérant que la majorité des protéines régulées négativement se localisent au niveau des mitochondries et qu'aucun changement évident n'a été observé concernant l'activité de fusion des mitochondries en analysant MFN2 et le rapport des formes L/S OPA1 (Figure 1C), nous avons étudié les marqueurs liés à la mitophagie.

Classiquement, la dégradation des mitochondries dépendante de l'autophagie se produit après la dépolarisation et est généralement déclenchée par l'accumulation accrue de la kinase putative 1 (PINK1) induite par la phosphatase et le tensinhomolog (PTEN) sur toute la longueur de la membrane mitochondriale externe.

Par la suite, l'ubiquitine-protéine ligase Parkin E3 entre les anneaux est recrutée pour marquer la protéine de la membrane externe des mitochondries des mitochondries dépolarisées par ubiquitylation (38-41). Le haut de la figure 2A ne montre aucun changement dans les niveaux de Parkin mais une réduction significative de PINK1 sur toute la longueur produite par une lésion RA dans le segment homolatéral de la moelle épinière L4-L5 par rapport au contrôle à 7 dpi. En revanche, la surexpression de GRP78 a réduit la parkine mais a doublé les niveaux de PINK1 après la PR par rapport à l'expression témoin de la protéine non apparentée -Gal (Figure 2A, en bas).

La régulation positive de PINK1 pleine longueur est cohérente avec l'induction de la mitophagie (42), et la réduction de Parkin pourrait être liée à un état avancé de démantèlement des organites observé par le reste des protéines mitochondriales.

Nous étudions plus en détail la colocalisation des mitochondries et des protéines associées aux microtubules 1A/1B chaîne légère 3 (LC3) ponctuées positives, un élément clé de la machinerie de base de la macroautophagie et nécessaire au processus de mitophagie (43).

En utilisant la microscopie confocale, nous avons observé une augmentation significative de la colocalisation des mitochondries, marquées à l'aide d'anti-COX IV, avec des puncta positives LC3- après PR uniquement dans les MN endommagés surexprimant GRP78 à 7 dpi (Figure 2B).

Nous avons confirmé l'existence d'une mitophagie dans les MN avulsés uniquement lors de la surexpression de GRP78 par l'analyse d'échantillons par microscopie électronique à transmission.

Nous avons observé d'abondantes vacuoles avec des mitochondries englouties, une caractéristique de la mitophagie [37], ressemblant à des mitophagosomes, et plusieurs citernes ER en relation étroite avec les mitochondries dans les MN d'animaux Ad-GRP78, mais nous ne les avons pas détectées chez Ad- -Gal RA blessé. échantillons de rats à 5 dpi (Figure 2C).

Figure 1. La surexpression de GRP78 chez les animaux blessés par PR cible les protéines mitochondriales. (A) Immunoblot et graphiques à barres montrant les modifications moyennes (± SEM) des niveaux de protéines GRP78, GRP75 et CV dans les segments de moelle épinière L4-L5 dans GRP78 vs.

-Gal surexprimant les rats blessés par la PR de 7 dpi. Les niveaux ont été normalisés aux valeurs d'actine (n=4 ; * p < 0,05 vs Ad- -Gal, test t de Student). (B) Histogramme des modifications du repliement des protéines mitochondriales obtenu par analyse protéomique des segments de moelle épinière L4-L5 provenant d'animaux blessés par la PR qui surexpriment GRP78 par rapport au groupe Ad- -Gal de 7 dpi. (C) Immunoblot et graphiques à barres montrant les changements de pli moyens (± SEM) de NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA -1 normalisés à l'actine. (Aucune différence significative entre les groupes. Test t de Student). (D) Mitochondries schématiques avec des protéines modifiées par la surexpression de GRP78 dans les segments de moelle épinière L4-L5 provenant d'animaux blessés par PR surlignés en jaune (diminué) ou en bleu (augmenté) à 7 dpi.

Figure 2. La mitophagie est modulée in vivo après PR chez des rats surexprimant GRP78. (A) Immunoblots et graphiques à barres correspondants pour l'analyse du changement de pli PINK1 et PARK des niveaux de protéines (moyennes ± SEM) normalisés aux niveaux d'actine, dans les segments de moelle épinière L4-L5 des rats blessés par PR vs.

contrôle (en haut) ou à partir des groupes Ad{{0}}Gal et Ad-GRP78 (en bas) de 7 dpi. (n=4 ; * p < 0,05, test t de Student). (B) À gauche, microphotographies de MN représentatifs sur le site homolatéral d'animaux RAinjured qui ont reçu une injection intrathécale de groupes AAVrh10-GFP ou AAVrh10-GRP78 à 7 dpi. Les échantillons ont été colorés pour COX IV (rouge) et LC3 (vert) et contre-colorés avec du Nissl fluorescent (bleu).

Barre d'échelle=10 µm et zoom numérique en médaillon 10X.

Notez que la co-localisation n'est observée que dans le groupe AAVrh10-GRP78. À droite, graphique à barres montrant l'analyse du % de points de co-localisation de COX IV et LC3. Moyenne ± SEM de la colocalisation COX IV et LC3 (n=4 ; ** p < 0.01, test t de Student). (C) Images représentatives de microscopie électronique à transmission où les mitochondries sont distinguées dans les MN de la moelle épinière : a, image du cytoplasme MN montrant les mitochondries chez l'animal témoin ; b, image du cytoplasme MN de rat blessé par PR du groupe Ad- -gal ; c, image du cytoplasme MN d'un rat blessé par PR du groupe Ad-GRP78 avec quelques mitochondries englouties, indiquées par des astérisques rouges ; d, une image à plus fort grossissement est présentée en (C), soulignant une grande mitochondrie et un contact ER. Des barres d'échelle sont indiquées sur les figures.

Au total, ces résultats suggèrent que la surexpression de GRP78 pourrait induire des MN déconnectés de la mitophagyine après une PR, et pourrait favoriser la neuroprotection.

3.1.2. La surexpression de GRP78 restaure la fonction mitochondriale endommagée

Nous avons ensuite étudié plus en détail l'effet de la surexpression de GRP78 sur les mitochondries en utilisant un modèle in vitro de stress ER puisque cette insulte apparaît tôt après une lésion de la PR in vivo, comme indiqué précédemment [20,26], et il s'agit d'une méthode fiable pour cribler de nouveaux agents neuroprotecteurs [2,44]. ].

Ce modèle utilise la tunicamycine (Tun), qui est un inducteur de stress ER qui provoque la formation d'intermédiaires N-acétylglucosamine-lipides, empêchant ainsi la glycosylation des protéines nouvellement synthétisées et conduisant à un mauvais repliement des protéines. Nous avons utilisé cela parce qu'il a également été rapporté qu'un arrêt de la voie sécrétoire était clé dans le processus neurodégénératif après la PR [26].

Nous avons d’abord vérifié que la nucléofection des cellules de type motoneurone NSC34 avec un vecteur approprié entraînait la production de GRP78 (Figure 3A). Dans ces cellules, l'expression de GRP78 a considérablement amélioré la survie dans un milieu contenant du Tun (Figure 3B).

Bien que le traitement par Tun induise normalement le GRP78 lui-même, cette surexpression endogène est assez tardive (au bout de 24 h) (Figure S2). Nous nous sommes également demandé si nous pouvions déterminer si la surexpression de GRP78 avait des effets neuroprotecteurs dans un autre modèle in vitro dont nous avions précédemment rapporté qu'il reproduisait plusieurs caractéristiques de décès de MN après une lésion de PR [26].

Ce modèle est basé sur les dommages cytosquelettiques induits par le nocodazole, qui interfère avec la polymérisation des microtubules. L'expression de GRP78 a également augmenté la viabilité des cellules cultivées en présence de nocodazole (Figure 3B).

Ensuite, nous avons évalué la fonction mitochondriale en mesurant la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les mitochondries à l'aide de MitoSOX, le potentiel de membrane mitochondriale (∆ψm) à l'aide de l'ester méthylique de tétraméthylrhodamine (TMRM) et le taux de consommation d'O2, dans nos cellules NSC34 soumises au stress ER. avec ou sans surexpression de GRP78.

Comme contrôle positif, nous avons utilisé l'éfavirenz (EFV), un agent mitotoxique qui modifie les trois paramètres [45]. Nous avons observé que les niveaux de MitoSOX augmentaient progressivement après l'ajout de Tun, atteignant une signification statistique au bout de 24 h et que la génération de ROS augmentait de manière significative dans les cellules traitées à l'EFV à partir de la première heure après le traitement par rapport aux témoins traités avec le véhicule (Figure S3A).

La surexpression de GRP78 a entraîné des niveaux significativement plus faibles de mitochondries ROSin par rapport aux cellules exprimant la GFP 24 h après le traitement par Tun ou EFV (Figure 3C). Le ∆ψm s'est effondré après 5 et 24 h de traitement Tun et après 24 h de traitement EFV (Figure S3B). La récupération de ce paramètre a été obtenue par surexpression de GRP78 dans des cellules traitées avec Tun ou EFV (Figure 3D).

Le taux de consommation d'O2 a diminué pendant 80 min d'analyse après l'ajout de Tun dans les cellules qui expriment la GFP (pente −0.063,R2=0.98), mais la consommation d'O2 était stable dans les cellules surexprimant GRP78- malgré la présence de Tun (pente −0,221, R2=0,99) (Figure 3E, à gauche).

Après 5 h, la respiration était normale dans les cellules surexprimant GRP 78- et gravement compromise dans les cellules exprimant GFP (Figure 3E, à droite). Au total, ces résultats suggèrent que GRP78 atténue le dysfonctionnement des mitochondries provoqué par le stress du RE ou la mitotoxicité.

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