Dépendance énergétique du GTP de l'endocytose et de l'autophagie dans le cerveau vieillissant et la maladie d'Alzheimer

Abstrait

Intérêt accru pour le vieillissement etLa maladie d'AlzheimerLes troubles de l'autophagie cérébrale liés à la MA soulèvent d'importantes questions sur la régulation et le traitement. Étant donné que de nombreuses étapes de l'endocytose et de l'autophagie dépendent des GTPases, de nouvelles mesures des niveaux de GTP cellulaire sont nécessaires pourévaluer la régulation énergétique dans le vieillissement et la MA. Le développement récent des capteurs GTP ratiométriques (GEVALS) et les découvertes selon lesquelles les niveaux de GTP ne sont pas homogènes à l'intérieur des cellules soulèventnouveaux enjeux de régulation des GTPasespar la disponibilité locale de GTP. Dans cette revue, nous soulignons lamétabolisme du GTPen relation avec les Rab GTPases impliquées dans la formation des endosomes précoces, des endosomes tardifs et du transport lysosomal pour exécuter la dégradation autophagique de la cargaison endommagée. Des GTPases spécifiques contrôlent la macroautophagie (mitophagie), la microautophagie et l'autophagie médiée par le chaperon (CMA). Par déduction, les niveaux locaux de GTP contrôleraient l'autophagie, sinon en excès. Des niveaux supplémentaires de contrôle sont imposés par l'état redox de la cellule, y compris l'implication de la thiorédoxine. Tout au long de cette revue, nous insistons surchangements liés à l'âgecela pourraitcontribuent aux déficits du GTP et de l'AD. Nous concluons avec des perspectives d'augmentation des niveaux de GTP et d'inversion des changements redox oxydatifs liés à l'âge pour restaurer l'autophagie. Par conséquent, les niveaux de GTP pourraient réguler les nombreuses GTPases impliquées dans l'endocytose, l'autophagie et le trafic vésiculaire. En vieillissant, l'adaptation métabolique à un mode de vie sédentaire pourrait altérer la fonction mitochondriale en générant moins d'énergie GTP et redox pour une gestion saine de l'amyloïde etprotéostase tau, fonction synaptique, etinflammation.

Mots clés GTP · Énergétique · Autophagie · Mitophagie ·Endocytose· Lysosomes ·Alzheimer · Vieillissement

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GTP, l'autre monnaie de l'énergie, dans le vieillissement et AD

La synthèse des molécules à haute énergie ATP et GTP repose toutes deux sur l'état redox du NAD plus /NADH et de leurs concentrations suffisantes. La synthèse d'ATP à partir de la glycolyse est principalement alimentée par le pouvoir oxydant du NAD et agit sur les sucres réducteurs. La synthèse d'ATP par phosphorylation oxydative dans les mitochondries est alimentée par la génération de NADH dans le cycle TCA pour la réduction du pyruvate, du glycérol ou des acides gras avec de l'oxygène comme accepteur d'électrons terminal dans la chaîne de transport d'électrons. Nos études sans étiquette sur des neurones vivants de l'hippocampe de rat ou de souris indiquent une déplétion liée à l'âge du NAD et du NADH, qui pourrait altérer la synthèse de l'ATP et du GTP [1–4]. Cet épuisement a été encore exacerbé dans les neurones de souris portant des transgènes pour la bêta-amyloïde humaine et la tau. En outre, l'analyse post-mortem des enzymes du cycle TCA a indiqué jusqu'à 40 % d'altération des enzymes du cycle TCA dans les cerveaux AD par rapport aux témoins appariés selon l'âge [5]. Ainsi, l'épuisement énergétique lié à l'âge du NAD plus et du NADH en plus de l'altération mitochondriale liée à la MA dans l'activité des enzymes TCA pourrait affecter localement les niveaux d'ATP et de GTP, même si leurs concentrations globales étaient peu affectées.

L'énergie disponible à partir de l'hydrolyse du GTP est la même que celle de l'hydrolyse de l'ATP, mais le GTP est utilisé à des fins différentes de l'ATP en raison de la sélectivité d'enzymes spécifiques. Les concentrations de GTP dans les cellules sont en moyenne dix fois inférieures à l'ATP millimolaire. Le GTP est un régulateur majeur de multiples processus cellulaires dépendants de l'énergie de la synthèse des protéines et du trafic vésiculaire impliquant l'endocytose et l'autophagie. La concentration totale estimée de GTP cellulaire dans les cellules de mammifères est comprise entre 250 et 700 μM [6], mais le GTP libre dans les protrusions de cellules cancéreuses est plus proche de 30 μM [7]. Les principales protéines alimentées par le GTP comprennent les dynamines pour la fission et la fusion membranaires, les petites GTPases régulatrices et les microtubules, comme détaillé ci-dessous. Outre la synthèse de novo à partir d'inosine par IDMPH2 et de xanthosine par GMPS, les sources cellulaires de GTP sont principalement des nucléoside diphosphate kinases localisées (NDPK) des gènes non métastatiques (NME ; parfois appelés NM23) qui convertissent l'ATP en GTP [8]. Il existe au moins dix membres de la famille des gènes NME, mais seuls les quatre premiers ont une activité nucléoside diphosphate kinase. Selon l'Allen Brain Atlas, NME1 à 4 sont fortement et sélectivement exprimés dans l'hippocampe de la souris et de l'homme où la mémoire est altérée dans la MA. NME1–3 sont cytoplasmiques, tandis que NME4 est mitochondrial. Étant donné que les deux processus distincts d'endocytose et d'autophagie sont affectés par le vieillissement et la MA, nous postulons que les altérations en amont affectent à la fois, éventuellement l'âge et la conséquence liée à la MA de limiter les niveaux de GTP sur ces fonctions critiques pour l'amyloïde.

Mesure des niveaux de GTP

Bien que le GTP régule plusieurs processus cruciaux pour la survie cellulaire, il est difficile de mesurer les niveaux de GTP dans la cellule vivante dans des conditions physiologiques et pathologiques en raison du renouvellement élevé et de l'existence à la fois d'un état lié aux protéines et d'un état libre. Bianchi-Smiraglia et al. [9] ont décrit un nouveau capteur GTP codé génétiquement (GEVAL) basé sur une protéine fluorescente jaune qui détecte les changements ratiométriques de la concentration sans GTP et liée au GTP in vitro et in vivo. Récemment, le même groupe a rapporté un mécanisme de régulation de la GTPase Rac1 lors de l'invasion cellulaire par une lignée cellulaire de mélanome humain pilotée par la production locale de GTP [7] et a revu sa méthodologie [10]. Comme nous le verrons dans cette revue, le GTP joue un rôle crucial lors de l'endocytose et de l'autophagie liées au traitement de l'amyloïde. Actuellement, nous étudions les changements de GTP liés à l'âge dans le traitement de A dans les cultures primaires de neurones hippocampiques de la souris triple transgénique 3xTg-AD et son effet sur les altérations de l'autophagie. La figure 1 montre les résultats préliminaires de la transfection de GEVAL530 dans les neurones adultes primaires de ce modèle de souris AD par rapport aux neurones de souris non transgéniques. Comme observé par Bianchi-Smiraglia et al. [7], nous observons une distribution non uniforme du GTP dans les processus et les bords du soma lors de la mesure du GTP libre (Fig. 1Aa), avec des niveaux de GTP libre plus faibles dans les neurones 3xTg-AD (Fig. 1Ac). Comme détaillé dans la section 10, le prétraitement de ces neurones avec un précurseur du NAD plus, le nicotinamide, a augmenté les niveaux de GTP libre (Fig. 1Ab, d). Le 530-µM Kd pour GEVAL530 utilisé dans ces expériences suggère que la concentration locale de GTP libre est inférieure à 530 µM. Sur la figure 1B, nous avons examiné le GTP lié qui semble être localisé dans les vésicules et augmenté par le nicotinamide (figure 1Bf, h), en particulier dans les neurones AD 3xTg. Des preuves préliminaires indiquent que les neurones traités avec l'ARNsi NME1 abaissent leurs taux de GTP libre (Santana Martinez, non publié). D'autres études avec des neurones adultes à travers le spectre d'âge détermineront la dépendance à l'âge des déficits en GTP et la capacité de les corriger avec des précurseurs NAD plus. Compte tenu du rôle essentiel du GTP dans les processus de trafic vésiculaire d'endocytose et d'autophagie et de ces preuves préliminaires de modifications du GTP avec une génétique de type AD, les sections suivantes fournissent des détails sur ces processus et les effets du vieillissement et de la maladie d'Alzheimer sur eux. Le résultat de cette revue met en évidence le besoin de nouvelles méthodes telles que les sondes GEVAL pour mesurer directement les changements dans les concentrations de GTP lié et libre et de GTP total.

Fig. 1 Mesures ratiométriques du GTP dans les neurones primaires de l'hippocampe de souris provenant de souris d'âge moyen transfectées avec le capteur GEVAL530 Les images ratiométriques pixel par pixel faussement colorées des neurones montrent des distributions non uniformes du GTP. ( a ) Excès de GTP libre / GTP lié du neurone 3xTg-AD d'âge moyen (14 mois) non transgénique (NTg) aux bords et à la dendrite apicale par rapport à ( c ) du neurone 3xTg-AD d'âge moyen (10 mois). ( b, d ) Augmentation du GTP libre dans les neurones traités avec du nicotinamide 2 mM en 24 h. (e, g) Les neurones non traités présentent une GTP liée aux vésicules qui est augmentée dans (f, h) les neurones traités avec du nicotinamide 2 mM en 24 h

Endocytose : dépendance au GTP dans le vieillissement et la MA

Dans le processus d'endocytose, la cellule internalise des macromolécules et des récepteurs liés au ligand et des protéines de surface, y compris la protéine précurseur amyloïde (APP) [11] (Fig. 2A). Parmi les deux principales voies endocytaires, l'absorption de l'APP intégrée à la membrane plasmique se produit principalement par l'intermédiaire de la clathrine (Fig. 2B.1) plutôt que par la cavéole à partir de plaques riches en choles terol (Fig. 2B.2). Cependant, l'A hydrophobe se répartit en plaques riches en cholestérol de radeaux lipidiques dans la membrane plasmique avec une absorption ultérieure par la voie de la cavéole [12] (Fig. 2B.2). Dans les deux cas, les complexes dynamine GTPase s'assemblent à l'invagination pour catalyser la courbure membranaire dépendante du GTP pour la fusion finale et la libération des vésicules matures de la membrane plasmique [13–15]. L'alimentation locale en GTP est catalysée par NME1 et 2 nucléotides phosphate kinases qui se lient à la dynamine [16]. Décision précoce de l'endosome Rab5 GTPase vers l'exocytose et le recyclage ou la transformation des récepteurs vers l'endosome tardif Rab7 GTPase pour la dégradation.

La Rab5 GTPase est considérée comme un marqueur de l'endosome précoce [17]. La protéine Rab5 est présente dans la membrane plasmique, dans les vésicules recouvertes de clathrine et dans les endosomes précoces (Fig. 2). Dans les modèles cellulaires et fy de la maladie de Huntington, Rab5 participe à la formation d'autophagosomes pour réguler l'autophagie et éliminer la huntingtine mutante toxique [18]. L'inhibition de Rab5 réduit la conjugaison des protéases régulant l'autophagie Atg5-Atg12, entraînant une diminution de la formation d'autophagosomes. Le conjugué Atg12-Atg5 favorise la lipidation de l'Atg8, et l'Atg8 lipidé facilite la formation d'autophagosomes et la reconnaissance sélective du cargo pendant l'autophagie [19].

La phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) est un autre facteur contribuant à l'autophagie médiée par Rab5-. Le complexe PI3-kinase inhibe l'autophagie en activant la voie de signalisation Akt/mTOR [20]. La sous-unité P110 du complexe PI3K régule l'activité catalytique du complexe Vps34 pour favoriser la génération de PI3P [21]. Cette étape est essentielle à la formation des autophagosomes. P110 favorise la transition de Rab5- PIB à Rab5- GTP. La surexpression de P110 atténue le déficit autophagique suite à l'activation du complexe macromoléculaire composé de Rab5, Vps34 et Beclin1, qui à son tour conduit à la formation d'autophagosomes [22]. Le ciblage de ces protéines spécifiques peut élucider des pistes thérapeutiques pour atténuer la pathologie de la MA.

Fig. 2 Endocytose de la protéine précurseur amyloïde (APP). La partie N-terminale de la protéine APP à 770 résidus avec un ombrage vert du A sujet à l'agrégation nécessite un clivage par les peptidases BACE et Gamma. B Endocytose de l'APP. (1) Formation du bourgeon interne à partir de la membrane plasmique orchestrée par la clathrine avec les endoprotéases BACE et 훾 -secretase. L'endocytose soutenue par la dynamine reçoit du GTP local par NME1. (2) Des microdomaines enrichis en cholestérol (radeaux lipidiques) lient l'APP traitée à A ou A adsorbée à partir du parenchyme. (3) L'endosome précoce attire la GTPase Rab5 qui est reconnue par une autre GTPase, Rab11, pour médier (4) le recyclage endocytique des récepteurs vers la membrane plasmique. Alternativement, (5) Rab7 assure la ségrégation précoce dans les endosomes tardifs permettant un traitement ultérieur de l'APP et l'accumulation de A . (6) Fusion tardive de l'endosome avec (7) le lysosome pour dégrader le contenu. Certains A agrégés peuvent être résistants à la digestion, et avec la perturbation de l'endosome, A peut s'accumuler dans le cytosol.

Rab5 lié à la membrane est un facteur clé dans la promotion directe de l'activation de Rab7 dépendante de Mon1-Ccz1- et de la fusion membranaire dépendante de Rab7- [23]. Mon1-Ccz1 est un complexe hétérodimérique de facteur d'échange de nucléotides guanine GEF qui active Rab5. Le déplacement médié par Mon1-du FEM Rab5 entraîne le déplacement de Rab5 par Rab7. Le complexe C-Vps agit comme un GEF pour Rab7 et favorise le passage de Rab7 de l'état lié au GDP à l'état lié au GTP pour l'activation de Rab7. Le gène associé à la résistance aux rayonnements ultraviolets (UVRAG) stimule l'activation de Rab7 par l'interaction UVRAG‐C‐Vps via l'échange GDP/GTP de Rab7 [24]. Un autre point régulateur du processus autophagique est le complexe homotypique fusion and vacuole protein-sorting (HOPS) qui active la GTPase vacuolaire Ypt-Rab de la levure lors de la fusion membranaire [25]. L'une des 6 sous-unités du complexe HOPS est le complexe de tri des protéines vacuolaires de classe C (C-Vps) qui contient Vps11, Vps16, Vps18 et Vps33. Les vésicules endocytaires tardives de Rab7 fusionnent ensuite avec les lysosomes pour la dégradation de la cargaison (Fig. 2).

Modifications du trafic endosomal Rab 5 et Rab 7 dans les modèles murins et dans la MA

Dans des modèles murins de MA avec des mutations de la protéine précurseur amyloïde (APP) ou de la préséniline productrice d'A, la voie endosome-autophagosome-lysosome semble dérégulée en partie à cause d'une acidification altérée des lysosomes qui ne parvient pas à activer suffisamment la protéase et les lipases [26]. Dans les modèles murins de la MA, de grands corps périnucléaires contenant A s'agrègent avec le marqueur autophagosome LC3 colocalisé avec Rab7 et les composants endosomaux et lysosomiques tardifs. Cela pourrait être dû à une régulation positive défaillante ou à une altération pathologique. Dans les neurones cultivés à partir de souris 3xTg-AD à travers l'âge, nous avons constaté que l'agrégat vésiculaire A augmentait de 30 à 50 fois avec l'âge, principalement dans les endosomes et les mitochondries précoces marqués Rab5-, mais également dans Rab{{9} } endosomes tardifs marqués et autophagosomes [27]. L'accumulation en forme de boule de neige de A 42 et A 45 suggère que les vieux neurones étaient incapables de terminer la dégradation autophagique de ces agrégats plus longs de A . Nous émettons l'hypothèse que la production d'énergie altérée dans les vieux neurones limite la capacité énergétique pour l'achèvement de l'autophagie. Comparés aux niveaux dans l'hippocampe et le cortex jeunes, dans l'hippocampe de souris APP/PS1 de 7 à 12-mois, les niveaux de Rab7 ont diminué avec des réductions des activateurs Beclin1 et Rubicon et une augmentation de l'inhibiteur Rubicon [28]. Dans l'hippocampe plus jeune et à tous les âges du cortex, Beclin1 active Rab7, tandis que Rubicon inhibe l'activation de Rab7 via la suppression de l'interaction entre la protéine du gène associé à la résistance aux rayons UV (UVRAG) et le gène de tri des protéines vacuolaires (Vps). La carence en Rab7 chez les levures et les mouches des fruits entraîne une accumulation massive d'autophagosomes [29]. Le knockdown de Rab7 inactive également mTORC1/S6K1 et la localisation de mTOR dans les endosomes tardifs [30]. Fait intéressant, l'inhibition d'autres étapes du trafic endocytaire ne modifie pas l'activité de mTORC1, ce qui suggère que les endosomes tardifs intacts sont cruciaux pour la signalisation de mTORC1 dans l'autophagie. C'est une raison importante pour laquelle le ciblage de mTOR peut ne pas ralentir le vieillissement ou la MA.

Une régulation positive régionale sélective des protéines Rab 5 et Rab7 et des ARNm dans la MA suggère des contributions sélectives à la pathologie de la maladie ou un mécanisme de protection insuffisant [31]. A s'accumule principalement dans les endosomes tardifs positifs pour Rab7 et les vacuoles autophagiques des cellules neuronales [32] d'une manière liée à l'âge [27] provoquant l'internalisation de A et l'augmentation subséquente de Rab7 déclenchant une dégénérescence neuronale [33]. Le blocage de la voie endocytaire tardive par la suppression de Rab7 induit la formation de fibrilles amyloïdes dépendantes de A à la surface des cellules, provoquant un élargissement endosomal [34] entraînant un recyclage accéléré de Rab7 et un trafic endocytaire de A vers les lysosomes pour dégradation [35]. L'inhibition de la protéolyse Iysoso mal peut également affecter le transport axonal rétrograde des organites autophagiques provoquant une dystrophie axonale de type MA [36]. Cependant, des interventions pratiques visant à promouvoir l'autophagie médiée par Rab7- pourraient retarder ou inverser la progression de la MA. Les exemples incluent le passage d'un état sédentaire à l'exercice, un régime méditerranéen et des composés énergisants comme les précurseurs du NAD pour créer un changement redox [4] (Section 10). Une autre avenue est l'étrange découverte que les niveaux de guanosine monophosphate réductase 1 (NADPH-dépendant GMPR1) sont augmentés dans les cerveaux AD qui pourraient eux-mêmes abaisser les niveaux de GTP et augmenter la signalisation AMP [37]. Les enchevêtrements neurofibrillaires de tau ont été réduits lorsque cette activité a été inhibée chez les souris AD.

Avec la progression d'une déficience cognitive légère vers la MA, les expressions endosomales de Rab5 et Rab7 ont été régulées positivement dans les neurones CA1 de l'hippocampe, comme mesuré par microréseau transcriptionnel [31]. L'élargissement des endosomes Rab5-positifs était associé à des enchevêtrements neurofibrillaires et à des dépôts amyloïdes. Des facteurs neurotrophiques tels que le facteur de croissance nerveuse (NGF) se lient à leurs récepteurs Trk et s'intériorisent dans les endosomes Rab5-positifs pour initier une signalisation en aval [38]. Il est intéressant de noter que l'endosome de signalisation est conservé en tant qu'endosomes précoces Rab5 et ne progresse pas vers les endosomes tardifs Rab7, lors de leur transit dans les axones longs [39]. Ce dif différencie la délivrance du signal médiée par les récepteurs du traitement de l'endosome vers l'autophagie [40]. Suite à l'activation par NGF, TrkA recrute un Rab5‐GAP pour convertir rapidement GTP‐Rab5 en GDP‐Rab5 afin de contrôler le niveau de GTP‐Rab5, ce qui empêche la conversion de Rab5 en Rab7 entraînant une inhibition de la signalisation NGF/TrkA et dégradation prématurée.

La fonction de Rab5 est compromise dans les phases précoces de la MA [41]. L'hyperactivation persistante de Rab5 a favorisé la voie endocytaire vers les endosomes tardifs, la fusion des lysosomes et l'autophagie, entraînant une dégradation prématurée de la signalisation du facteur neurotrophique et une atrophie neuronale. Vps35 et Vps26, deux protéines rétromères clés, ont également été réduites dans les cerveaux atteints de MA [42]. Vps26 se lie à SorLA qui est un récepteur de tri qui contrôle le trafic APP des endosomes vers l'appareil de Golgi. Une réduction des protéines rétromères Vps conduit à un complexe Vps-SorLA anormal qui entrave le trafic d'APP et l'accumulation d'APP dans les endosomes où elle est soumise à la bêta-sécrétase. Cependant, imiter la phosphorylation de l'APP à S655, dans le motif basolatéral APP 653YTSI656, peut améliorer la récupération de l'APP dans un processus médié par les rétromères, entraînant une diminution du ciblage lysosomal de l'APP et une diminution de la production d'Abeta [43]. Une augmentation de l'APP pleine longueur et du fragment d'APP ‐CTF peut, à son tour, augmenter l'activité de la Rab5 GTPase induisant l'élargissement des endosomes précoces [44]. Il est intéressant de noter que l'atrophie neuronale induite par les APP ‐CTF pourrait être sauvée par un mutant Rab5 dominant‐négatif à la fois in vitro [39] et in vivo [45].

Le résultat net du vieillissement est l'épuisement des endosomes tardifs, un dysfonctionnement endocytaire tardif et une fusion lysosomale altérée. Dans la MA, l'endocytose de A augmente dans les endosomes précoces de Rab5 agrandis. Le rôle de Rab7 dans la MA n'a pas encore été clairement élucidé car une régulation à la hausse précoce et une régulation à la baisse tardive de Rab7 ont été observées affectant la santé neuronale dans les deux sens. Comme le soulignent Bianchi-Smiraglia et al. [7], le GTP cellulaire total mesuré dans les homogénats ne permet pas d'évaluer le GTP libre disponible localement pour les Rab GTPases. Les mesures de GTP libre n'ont pas encore été rapportées, de sorte que leur rôle possible dans l'âge et les déficiences liées à la MA dans l'endocytose n'est pas exploré. Par conséquent, il sera important de mesurer le GTP libre dans les cellules vivantes et les effets des variations du GTP libre sur l'endocytose en fonction de l'âge et des modèles AD.

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