La cause de l'insuffisance rénale chronique (IRC) - L'anémie

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PARTIE Ⅰ : L'insuffisance rénale chronique protéinurique est associée à une altération de la durée de vie, de la déformabilité et du métabolisme des globules rouges

Rosi Bissinger, Travis Nemkov & et al.

Le développement deanémieest une complication typique du stade avancémaladie rénale chronique(CKD) et est associée à une altération de la qualité de vie¹et un risque accru d'événements cardiovasculaires²et l'hospitalisation,³ainsi que le déclin cognitif.⁴La sévérité deanémiea été considéré comme un prédicteur indépendant de la mortalité dans les cas d'IRC sous dialyse et non sous dialyse (maladie rénale chronique) les patients.⁵La physiopathologie des maladies rénales associéesanémieest complexe et implique une carence en fer et en érythropoïétine (EPO) dans le cadre d'une inflammation de bas grade, qui, à son tour, compromet l'érythropoïèse normale dans l'IRC (maladie rénale chronique) les patients.⁶En CKD avancée (maladie rénale chronique), la réponse de l'OEB est insuffisante par rapport au degré deanémie.^7,8 La forte prévalence d'une carence en fer concomitante dans l'IRC (maladie rénale chronique) est une conséquence d'une perturbation de l'homéostasie du fer.⁹ Un mécanisme négligé de la perte de fer dans l'IRC (maladie rénale chronique) est la protéinurie, qui peut entraîner des pertes urinaires de fer lié à la transferrine (jusqu'à 0,3 mg/j) lorsque la protéinurie atteint la plage néphrotique.¹⁰On pense qu'un autre facteur contribue àanémieen MRC (maladie rénale chronique) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >il y a 60 ans.^6,11,12

Bénéfice de Cistanche : traiter les maladies rénales et améliorer la fonction rénale

Une étude récente utilisant un test respiratoire au monoxyde de carbone a démontré que la durée de vie des globules rouges diminuait progressivement de 120 jours chez les patients atteints d'IRC de stade 1 (maladie rénale chronique) à 60 jours chez les patients atteints d'IRC de stade 5 (maladie rénale chronique).¹³ Notamment, la transfusion de globules rouges allogéniques de donneurs sains à CKD (maladie rénale chronique) les patients ont été suivis d'une clairance rapide des globules rouges transfusés sans signe d'hémolyse.¹²Un mécanisme plausible pour cette observation peut être la stimulation de la mort cellulaire de type apoptose dans les globules rouges anucléés, indiquant un schéma de blessure dans lequel l'intégrité de la membrane cellulaire n'est pas compromise et le contenu cytoplasmique reste intact.¹⁴Les globules rouges subissant la mort cellulaire présentent diverses altérations morphologiques résultant de lésions cytosquelettiques, telles que la formation de bulles de surface, la perte d'élasticité de la membrane et/ou la déshydratation cellulaire.¹⁵Au niveau moléculaire, la mort des globules rouges est associée à une accumulation intracellulaire de Ca2þ, à une altération de l'état énergétique cellulaire et à la dégradation de l'asymétrie des phospholipides, conduisant finalement à l'externalisation de la phosphatidylsérine (PS) sur la membrane plasmique externe.^15,16En conséquence, les macrophages et les cellules dendritiques spécialisées reconnaissent rapidement les globules rouges externalisés par PS, entraînant une phagocytose de l'érythrose et leur catabolisme dans la rate et le foie.¹⁷En raison de la physiopathologie déconcertante demaladie du rein-associéeanémiechez l'homme, des études animales sont justifiées pour identifier les mécanismes contributifs. Néphropathie induite par la doxorubicine (DIN) chez les souris 129S1/SvImJ¹⁸et souris présentant un déficit inductible en podocine (Nphs2Dipod)¹⁹sont 2 modèles caractérisés par l'induction d'une protéinurie néphrotique en quelques jours, l'évolution vers une insuffisance rénale après 3 semaines et la mort en 6 à 7 semaines.^19–21Les deux modèles de souris récapitulent efficacement toutes les étapes de l'IRC humaine (maladie rénale chronique). Dans la présente étude, nous avons testé si l'insuffisance rénale progressive chez ces souris atteintes de protéinuriemaladie du reinaffecte la durée de vie des globules rouges et contribue àanémie. En parallèle, nous avons examiné le phénotype RBC dans le sang prélevé sur CKD (maladie rénale chronique) patients atteints de protéinurie néphrotique.

MRC (maladie rénale chronique) etanémie : CISTANCHE

MÉTHODES

Des informations détaillées sur les matériaux et les méthodes sont fournies dans les matériaux et méthodes supplémentaires.

Études sur la souris

Des expériences ont été réalisées sur des souris 129S1/SvImJ de type sauvage 8-semaines des deux sexes (Charles River). Le DIN a été induit par une seule injection de doxorubicine (14,5 mg/g de poids corporel), comme décrit précédemment.^18,22Pour contrôler l'effet myélotoxique de la doxorubicine non lié au développement de la néphropathie, des souris C57BL/6 résistantes à la doxorubicine ont également été soumises au même protocole de traitement.²³ De plus, des expériences similaires ont été menées sur des souris 8-d'une semaine avec suppression inductible de la podocine (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO -cre]1Jaw) ou des souris Nphs2Dipod, qui ont été traitées avec de la doxycycline pendant 14 jours.¹⁹Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et à la loi allemande sur le bien-être des animaux, avec l'approbation des autorités locales (Regierungspräsidium Tübingen, numéros d'approbation M12/17 et M17/19G ). La conception expérimentale des études sur la souris est décrite dans la figure supplémentaire S1.

Les patients

L'étude des patients a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki et a été approuvée par le comité d'éthique local de l'hôpital universitaire de Tübingen (556/2018BO2). Des échantillons de sang et d'urine à l'héparine de lithium ont été prélevés chez des patients atteints de protéinurie néphrotique et avec un taux de filtration glomérulaire préservé (DFG ; stades 1 à 2 ; n ¼ 10) et de patients atteints d'un DFG réduit (IRC (maladie rénale chronique) stade 3–5 ; n ¼ 15) à l'hôpital universitaire de Tübingen. En tant que groupe témoin, le sang de volontaires sains appariés selon l'âge et le sexe (n ¼ 25) a été fourni par la banque de sang de l'hôpital universitaire de Tübingen. Tous les échantillons humains ont été prélevés après consentement éclairé. Les caractéristiques cliniques des patients sont indiquées dansTableau 1.

Tableau 1|Caractéristiques des patients atteints d'IRC (maladie rénale chronique) et des donneurs de sang sains

Analyses par cytométrie en flux

Différents paramètres de la mort des globules rouges ont été déterminés par une autre cytométrie.¹⁴ Pour déterminer la durée de vie des globules rouges in vivo, 25 ml de 5, 6- carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester [5 (6) -CFDA, SE] colorant ont été injectés à une concentration de 9,96 mM (solubilisé dans du diméthylsulfoxyde) dans le rétro-orbital plexus de souris de type sauvage 129S1/SvImJ et de souris ayant reçu une injection de doxorubicine, comme décrit précédemment. cellules a été détectée par une autre analyse de cytométrie. Enfin, les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo (FlowJo LLC).

Déformabilité des globules rouges et ektacytométrie à gradient osmotique

La déformabilité des globules rouges a été mesurée à l'aide de l'analyseur de cellules rotatives optiques assisté par laser (LORCA Max Sis ; RR Mechatronics), qui a été décrit en détail ailleurs.²⁵Les analyses d'ektacytométrie à gradient osmotique (cosmos can) ont également été effectuées à l'aide du LORCA Max Sis et mesurent la déformabilité dans diverses conditions osmotiques.²⁶

Examen histologique

Pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine, les rates et les fémurs ont été colorés à l'hématoxyline et à l'éosine. Toutes les lames ont été colorées avec l'anticorps primaire Ter119 (BD Pharmingen; dilution 1:500). Pour la coloration périodique à l'acide de Schiff, des tranches de 2,5-mm d'épaisseurreinsont été colorées avec de l'acide périodique - réactif de Schiff (Carl Roth) et de l'hématoxyline (Abcam). La coloration de May-Grünwald-Giemsa (méthode de Pappenheim) a été réalisée pour déterminer les changements de forme des globules rouges, comme décrit précédemment.²⁷ L'isolement des glomérules a été effectué en utilisant une approche de biotinylation et un tri cellulaire.¹⁹Pour la détection des protéines de la podocine, un anticorps de Sigma a été appliqué (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI ; Carl Roth) a été utilisé pour colorer les noyaux.

Métabolomique par chromatographie liquide ultra-haute performance et spectrométrie de masse à partir de globules rouges de souris

Les analyses ont été effectuées comme précédemment publiées.²⁸En bref, la plateforme analytique utilise un système de chromatographie liquide ultra-haute performance Vanquish (Thermo Fisher Scientific) couplé en ligne à un spectromètre de masse Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche traite les maladies rénales causées par l'anémie

analyses statistiques

Les données sont fournies sous forme de moyennes arithmétiques SEM ou de médiane avec intervalle interquartile (25e au 75e centile) avec n représentant le nombre d'animaux utilisés ou de patients inclus, respectivement. Les données ont été testées pour la normalité avec le test de Kolmogorov-Smirnov, le test de D'Agostino et le test de Shapiro-Wilk. Les variances ont été analysées par le test de Bartlett pour des variances égales. Le post-test de comparaison multiple de Tukey ou Dunn, le test t de Student non apparié ou le test U de Mann-Whitney ont été effectués par GraphPad Prism 8 (logiciel GraphPad). P < 0.05="" avec="" 2-="" test="" de="" queue="" a="" été="" considéré="" comme="" statistiquement="" significatif.="" des="" graphiques="" supplémentaires="" ont="" été="" tracés="" via="" graphpad="" prism="">

RÉSULTATS

La maladie rénale protéinurique expérimentale induitanémiechez la souris Après induction, des souris 129S1/SvImJ avec des souris DIN et Nphs2Dipod ont développé une protéinurie néphrotique (Figure 1a et Figure supplémentaire S2C) et une insuffisance rénale progressive caractérisée par des niveaux élevés d'urée plasmatique à partir du jour 20 (Figure 1b et Figure supplémentaire S2D). Au cours des 10 premiers jours, les souris ont connu un gain de poids corporel avec ascite (Figure 1c et Figure supplémentaire S2E), reflétant la rétention de sodium causée par l'excrétion de sérine protéases ou de protéinurie.¹⁸Après inversion spontanée de la rétention de sodium, ces souris ont régulièrement perdu du poids. Chez les souris atteintes de DIN et chez les souris Nphs2Dipod, des images de microscopie optique, capturées après 10 jours, ont révélé des changements histomorphologiques typiques compatibles avec la sclérose glomérulaire segmentaire focale (Figure 1d et Figure supplémentaire S2B). Ceux-ci étaient absents chez les souris C57BL/6 injectées de doxorubicine (Figure 1d). Le traitement à la doxorubicine a induit une forte baisse de l'hémoglobine, du nombre de globules rouges et de l'hématocrite (Figure 1e–g) à partir du jour 10 chez les souris 129S1/SvImJ et C57BL/6, qui chez ces dernières ont été normalisées aux jours 20 et 30. En revanche, sur jours 20 et 30, les souris déficientes en 129S1/SvImJ et en podocine ayant reçu une injection de doxorubicine ont développé uneanémie, caractérisé par un volume corpusculaire moyen réduit (Figure 1h) et une hémoglobine réduite (Figure supplémentaire S2F), suggérant queanémieest associée à une insuffisance rénale progressive et non au traitement par doxorubicine proprement dit.

Figure 1|Fonction rénale et anémie manifeste chez des souris 129S1/SvImJ injectées de doxorubicine.( a - d ) Des souris 129S1 / SvImJ injectées de doxorubicine ont développé ( a ) une protéinurie élevée, ( b ) une augmentation progressive de la concentration plasmatique d'urée, ( c ) une augmentation transitoire du poids corporel et ( d ) des changements histomorphologiques typiques indiquant une sclérose glomérulaire segmentaire focale au jour 10 (acide périodique - coloration de Schiff ; barre ¼ 10 mm). (e–h) De plus, ces souris ont développéanémiereflétée par (e) une diminution du taux d'hémoglobine, (f) une diminution du nombre de globules rouges (GR), (g) une diminution des taux d'hématocrite et (h) une diminution du volume corpusculaire moyen. ( a – d ) les souris C57BL / 6 injectées de doxorubicine n'ont montré aucun signe de lésion rénale, et ( e – g )anémieau jour 10 a été normalisé aux jours 20 et 30. Les moyens arithmétiques SEM sont affichés. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="">< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

L'anémie dans la maladie rénale protéinurique expérimentale n'est pas causée par une érythropoïèse compromise

Les deux modèles de souris anémiques ont affiché une augmentation significative du pourcentage de réticulocytes circulants (Figure 2a et Figure supplémentaire S3C). Les concentrations plasmatiques d'EPO ont été considérablement augmentées au jour 10 chez 129S1/SvImJ avec des souris DIN et C57BL/6 saines, mais ont été à nouveau normalisées aux jours 20 et 30 (Figure 2b). Chez les souris déficientes en podocine, les concentrations plasmatiques d'EPO ont augmenté au jour 10 et sont restées augmentées aux jours 20 et 30 (Figure supplémentaire S2H). Dans les analyses histologiques de la moelle osseuse et de la rate, le nombre de cellules précurseurs érythroïdes par rapport aux précurseurs myéloïdes a augmenté au jour 30 (Figure 2d – g), indiquant une érythropoïèse stimulée chez les souris anémiques 129S1 / SvImJ atteintes de DIN.

Figure 2|L'érythropoïèse est stimulée chez des souris anémiques 129S1/SvImJ ayant reçu une injection de doxorubicine. (a) Anémiechez des souris 129S1/SvImJ ayant reçu une injection de doxorubicine s'est produite malgré l'augmentation du nombre de réticulocytes aux jours 2{{30}} et 30. ( b ) La concentration plasmatique d'érythropoïétine a fortement augmenté au jour 1 0 chez les souris 129S1 / SvImJ et C57BL / 6 injectées de doxorubicine, mais a de nouveau été normalisée aux jours 2 0 et 3 0. ( c – e ) Quantification du nombre absolu de ( c ) cellules myéloïdes et ( d ) cellules érythroïdes dans la moelle osseuse. Le rapport (e) des cellules myéloïdes sur érythroïdes chez les souris 129S1/SvImJ saines et injectées de doxorubicine dans la moelle osseuse a montré un nombre plus élevé de cellules précurseurs érythroïdes chez les souris 129S1/SvImJ injectées de doxorubicine au jour 3{{5{{52 }}}}. (f, g) L'histologie (f) de la rate et (g) de la moelle osseuse a montré une augmentation des cellules précurseurs érythroïdes, observée même à des grossissements plus faibles, chez les souris 129S1/SvImJ injectées de doxorubicine (panneaux de droite) par rapport aux souris saines (panneaux de gauche ) au jour 30. (f, g) L'immunohistochimie de Ter119 (panneaux inférieurs) a confirmé les résultats de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E). Ter119 est positif dans les précurseurs érythroïdes (cellules nucléées) et dans les globules rouges (cellules non nucléées). Barre ¼ 100 mm; encarts ¼ 25 mm. Les moyennes arithmétiques SEM sont indiquées. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" et="" ***p="">< 0,001="" indiquent="" une="" différence="" significative="" entre="" les="" souris="" 129s1/svimj="" saines="" et="" les="" souris="" 129s1/svimj="" injectées="" de="" doxorubicine ;="" ##p="">< 0,01="" et="" ####p="">< 0,0001="" indiquent="" une="" différence="" significative="" par="" rapport="" à="" la="" ligne="" de="" base="" des="" souris="" 129s1/svimj="" injectées="" de="" doxorubicine ;="" et="" §p="">< 0,05,="" §§p="">< 0,01="" et="" §§§§p="">< 0,0001="" indiquent="" une="" différence="" significative="" entre="" les="" souris="" 129s1/svimj="" injectées="" de="" doxorubicine="" et="" les="" souris="" c57bl/6="" injectées="" de="">

Avantage deCistanche : traiter les maladies rénales et améliorer la fonction rénale

La réduction de la durée de vie des globules rouges est la principale cause d'anémie dans la maladie rénale protéinurique expérimentale

L'extériorisation de la PS sur le feuillet externe de la membrane plasmique des érythrocytes est un indicateur de la mort cellulaire et un promoteur de la phagocytose érythrocytaire.¹⁴La mort des cellules érythrocytaires a été quantifiée à l'aide d'analyses de tri cellulaire activées par fluorescence de PS de surface liée à l'annexine V fluorescente.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}} fois plus élevé au jour 20 chez les souris avec DIN (4,16 % et 0.86 %) par rapport aux souris en bonne santé (1.{{7 }} pour cent & 0.11 pour cent ) (Figure 3a). De même, les souris Nphs2Dipod ont montré une augmentation d'environ 2- fois de l'exposition à la PS (1,27 % et 0,20 %) par rapport aux souris en bonne santé (0,58 % et 0,05 %) au jour 30 (Figure supplémentaire S3A). On sait que les globules rouges sont éliminés de la circulation par les macrophages résidant dans la rate.17 Cette observation peut donc expliquer le rapport poids rate/corps plus élevé des souris Nphs2Dipod (Figure supplémentaire S2G), dans laquelle deux fois plus de globules rouges sont dégradés par rapport aux souris saines. Souris C57BL/6. Étant donné que la protéinurie de la gamme néphrotique entraîne une dysprotéinémie, 29 nous avons en outre étudié si la mort accrue des globules rouges pouvait être stimulée par un composant du plasma de souris atteintes de DIN. Comme le montre la figure 3b, l'exposition à la PS aux jours 10 et 20 était deux fois plus élevée après l'incubation (30 minutes à 37^OC) de globules rouges sains dans le plasma de souris 129S1/SvImJ injectées de doxorubicine par rapport à l'incubation dans le plasma de souris saines. Influx de Ca2þ dans les globules rouges, médié par des canaux cationiques non sélectifs voltage-dépendants et indépendants du voltage,^30,31est l'un des principaux régulateurs de la mort des globules rouges. Dans les globules rouges prélevés aux jours 20 et 30 sur des souris 129S1/SvImJ avec DIN, les concentrations intracellulaires de Ca2þ ont augmenté (figure 3c) ; ce phénomène a été récapitulé chez les souris Nphs2Dipod au jour 20 (Figure supplémentaire S3B). Dans les deux modèles de souris, il y avait une corrélation négative significative du pourcentage de globules rouges PS-positifs, avec la sévérité deanémiereflété par les niveaux d'hémoglobine (Figure 3d et Figure supplémentaire S3D). De plus, il existait une corrélation significative avec les lésions rénales reflétées par la concentration plasmatique d'urée (Figure 3e et Figure supplémentaire S3E) et, dans une moindre mesure, avec la protéinurie (Figure 3f et Figure supplémentaire S3F). Pour compenser la perte de RBC dansanémie, la formation de nouveaux globules rouges a été stimulée chez les deux souris, comme l'indique l'augmentation du pourcentage de réticulocytes circulants, et était significativement corrélée à l'ampleur de la PS exposant les globules rouges (Figure 3g et Figure supplémentaire S3G).

Figure 3|Les souris atteintes de néphropathie induite par la doxorubicine développent une mort accrue des globules rouges (RBC) médiée par une augmentation des niveaux de calcium intracellulaire.( a ) L'externalisation de la phosphatidylsérine (PS), reflétant la mort des globules rouges, a été renforcée les jours 2 0 et 3 0 après l'induction de la néphropathie induite par la doxorubicine. (b) L'incubation de globules rouges sains dans du plasma prélevé les jours 10 et 20 chez ces souris a conduit à l'externalisation de la PS. ( c ) L'externalisation de la PS s'est accompagnée d'une augmentation des niveaux de calcium intracellulaire des globules rouges pris les jours 20 et 3{{30}} après l'induction. ( d – g ) Le pourcentage ( d ) de globules rouges exposant à la PS était corrélé aux taux d'hémoglobine, aux lésions rénales indiquées par ( e ) la concentration plasmatique d'urée et ( f ) la protéinurie , ainsi qu'à ( g ) la formation de réticulocytes. (d–g) Les données incluent chaque point de temps (0, 10, 20 et 30 jours) de chaque souris 129S1/SvImJ et 129S1/SvImJ en bonne santé avec néphropathie induite par la doxorubicine. Les moyennes arithmétiques SEM sont indiquées. **P < 0,01,="" ***p="">< 0,001="" et="" ****p="">< 0,0001="" indiquent="" une="" différence="" significative="" entre="" les="" souris="" 129s1/svimj="" saines="" et="" les="" souris="" 129s1/svimj="" injectées="" de="" doxorubicine="" (in.) ;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" et="" ####p="">< 0,0001="" indiquent="" une="" différence="" significative="" par="" rapport="" à="" la="" ligne="" de="" base="" des="" souris="" 129s1/svimj="" injectées="" de="" doxorubicine ;="" et="" §§§§p="">< 0,0001="" indiquent="" une="" différence="" significative="" entre="" les="" souris="" 129s1/svimj="" injectées="" de="" doxorubicine="" et="" les="" souris="" c57bl/6="" injectées="" de="" doxorubicine.="" créa,="" créatinine;="" mfi,="" intensité="" moyenne="" de="">

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