Détermination par HPLC de l'échinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche Herba
Jul 21, 2025
Abstrait: Objectif : Une méthode HPLC a été établie pour le dosage de l'Echinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche deserticola. Méthodes : L’échinacoside a été dosé par HPLC. La séparation a été réalisée sur une colonne Inertsil ODSSP C18 avec une phase mobile constituée d'acétonitrile (A) et d'une solution d'acide phosphorique à 0,4 % (B), par élution par gradient. La longueur d'onde de détection a été réglée à 333 nm et la température de la colonne était de 30 degrés. Le débit était de 1,0 mL·min-1 et le volume d'injection était de 10 µL. Résultats : La relation linéaire de l'échinacoside dans la plage de concentrations de 44,93977 à 539,2764 ug·m était bonne (r=0.9998). Les récupérations étaient de 94,59 % à 105,31 % (RSD= 2.93%,n=9). La teneur en échinacoside des extraits aqueux de Cistanche herba était de 15,527,7,347,12,267 mg·g-1.
Conclusion : La méthode HPLC établie avec une bonne répétabilité est précise, simple et réalisable. Il convient au dosage de l'échinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche deserticola.
Mots-clés: HPLC ; extrait aqueux de Cistanche deserticola ; Échinacoside ; détermination du contenu
La cistanche deserticola est un tonique couramment utilisé en médecine traditionnelle chinoise dans la pratique clinique et a la réputation de « ginseng du désert ». La Cistanche deserticola incluse dans l'édition 2015 de la Pharmacopée chinoise est la tige séchée, écailleuse et charnue de la plante Orobaceae Cistanche deserticola YC Ma ou Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. Il a une nature chaleureuse, un goût sucré et salé et appartient aux méridiens des reins et du gros intestin. Il a pour effet de tonifier le yang des reins, de bénéficier de l'essence et du sang, d'humidifier les intestins et de soulager la constipation [2].
Ginseng du désert
Le « Shennong Materia Medica Classic » déclare qu'il peut « nourrir le milieu, nourrir les cinq organes internes, renforcer le yin et nourrir l'essence ». Cistanche deserticola contient principalement des glycosides phényléthanoïdes, des iridoïdes et glycosides, des lignanes et glycosides, des polysaccharides, des esters et des alcaloïdes [3]. Les glycosides de phényléthanol sont les principaux composants actifs du Cistanche deserticola, parmi lesquels l'échinacée et le bord de la piscine sont les composants indicateurs pour l'identification et la détermination du contenu du Cistanche deserticola dans la pharmacopée chinoise.
Le glycoside de phényléthanol est le principal composant actif de Cistanche deserticola.
Des études pharmacologiques [4] indiquent que Cistanche deserticola a divers effets pharmacologiques, tels que l'humidification des intestins et le soulagement de la constipation, la protection du foie, la résistance à l'ostéoporose, l'antioxydation, l'anti-âge et l'anti-fatigue. L'extrait aqueux de Cistanche deserticola peut favoriser les gènes de la protéine morphogénétique osseuse 2 des ostéoblastes chez le rat, ainsi que la phosphatase acide résistante au tartrate et l'ostéocalcine dans le sérum de souris ovariectomisées, ainsi que les gènes Smad1 et Smad5 et les facteurs de croissance transformants dans la moelle osseuse.- - - - . L'expression de, etc., a un effet anti-ostéoporose [5-6]. L'échinoside peut favoriser la prolifération des ostéoblastes et favoriser la différenciation des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse en ostéoblastes in vitro [7-9].
L'échinoside, principal composant chimique du Cistanche deserticola
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Ces dernières années, il y a eu de nombreux rapports sur la détermination de la teneur en échinacoside et en polyside dans l'extrait alcoolique de Cistanche deserticola et ses préparations composées [10-12], mais il existe peu de rapports sur la détermination de la teneur en composants indicateurs dans l'extrait aqueux de Cistanche deserticola. Dans cette étude, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) a été utilisée pour déterminer la teneur en échinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche deserticola.
1. Matériel
1.1 Appareillage
LC-20AT chromatographie liquide haute performance, détecteur SPD-20A, échantillonneur automatique SIL-20A, boîtier de température de colonne CTO-10ASvp, poste de travail de chromatographie liquide LCsolution, Shimadzu Corporation du Japon ; Balance d'analyse électronique MES125P-OCE-DU, Sartorius, Allemagne ; Pompe à vide polyvalente à circulation d'eau SHZ-D (III), Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.
Système de circulation de refroidissement de l'évaporateur rotatif 1.2RC2BSO25, évaporateur rotatif RV10DS96, IKA, Allemagne ; DK-S26 Bain-marie thermostatique électrique, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd ; Machine à eau ultra-pure série UPR, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.
1.2 Matériels médicinaux et réactifs
Matériau médicinal Meat Rong, acheté auprès de Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., numéro de lot : 18010011806001, 181001. Les tiges séchées, écailleuses et charnues de la plante Leobaceae Cistanche deserticola identifiées par l'herboriste chinois en chef Tu Xingming du troisième hôpital affilié de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Guangzhou sont stockées dans la salle d'inspection des médicaments du troisième hôpital affilié de l'Université de Guangzhou. Médecine traditionnelle chinoise ; Substance de référence échinoside, teneur 89,7 %, Institut chinois pour le contrôle des aliments et des drogues, numéro de lot : 111670-201706 ; L'acétonitrile est chromatographiquement pur (Merck, Allemagne) ; Le méthanol et l'acide phosphorique sont analytiquement purs (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.) ; L'eau est de l'eau ultra pure.
2. Méthodes et résultats
2.1 Préparation de l'extrait aqueux de Cistanche deserticola
Prenez la poudre de cistanche, ajoutez 10 fois la quantité d'eau distillée, chauffez et refluez pour extraire deux fois, à chaque fois pendant 1 heure. Filtrer, combiner le filtrat et utiliser un évaporateur rotatif pour concentrer le filtrat jusqu'à obtenir une teneur en médicament brut de 0,100 g · mL-1. Conserver à 4 degrés en veille. 2.2 Conditions chromatographiques et adéquation du système Colonne chromatographique : colonne InertsilODS SPC18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm) ; Phase mobile : acétonitrile (A) - 0.4 % de solution d'acide phosphorique (B), élution en gradient : 0 à 5 min, 17 % A ; 5~25min,20%A ; 25~30min,17%A ; Longueur d'onde de détection : 333 nm ; Température de la colonne : 30 degrés ; Débit : 1,0 mL · min-1 ; Volume d'injection : 10 µL. Dans ces conditions chromatographiques, la résolution entre les pics d'échinacée et les composants adjacents est supérieure à 1,5, et le nombre théorique de colonnes ne doit pas être inférieur à 4000 pour les pics d'échinacée. Le chromatogramme est présenté à la figure 1.
Figure 1 Chromatogrammes HPLC de l'échinacoside (A) et de l'extrait aqueux de Cistanche herba (B)
2.3 Préparation de la solution
2.3.1 Solution de référence
Pesez une quantité appropriée de substance de référence d'échinacétine, pesez-la avec précision, placez-la dans une fiole jaugée de 10 ml, ajoutez du méthanol pour la dissoudre et faites en sorte qu'elle contienne 898,794 d'échinacétine par millilitre μ G de la solution de référence, conservée à 4 degrés en veille.
Échinoside de Cistanche deserticola
2.3.2 Solution d'essai
Mesurer avec précision 2,0 mL d'extrait aqueux de Cistanche deserticola, évaporer au bain-marie, dissoudre dans du méthanol, porter à volume constant dans une fiole jaugée de 10 mL et bien agiter. 0.22 filtration sur membrane microporeuse μm, à savoir.
2.4 Étude d'une relation linéaire
Mesurez avec précision 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 2,50 et 3,00 mL de la solution de référence sous 2.3.1 et placez-les dans une fiole jaugée de 5 mL, ajoutez du méthanol à volume constant et agitez bien pour obtenir des concentrations en gradient de 44,9397, 89,8794, 179,7588, 359,5176, 449,3970 et 539,2764 μ G · mL-1 de la solution de référence, 0,22 μ M Filtration sur membrane microporeuse. Effectuer la détermination selon les conditions chromatographiques de 2.2 et enregistrer la surface du pic. En utilisant la concentration massique de la substance de référence comme abscisse (X, μ G · mL-1), la surface du pic est l'ordonnée (Y) et l'équation de régression linéaire est obtenue : Y=13185.0X-32273.0, r=0.9998. Les résultats ont montré que l'échinacée variait de 44,9397 à 539,2764 μ. La relation linéaire dans la plage de concentrations de g · mL-1 est bonne.
2.5 Test de précision
Prendre 539,2764 μG · mL-1 de solution de référence, injecter l'échantillon en continu 6 fois selon les conditions chromatographiques de 2.2 et enregistrer la surface du pic. Résultats : Le RSD de la surface du pic de l'échinacée était de 1,81 %, indiquant une bonne précision de l'instrument.
2.6 Essai de stabilité
Mesurer avec précision 2,0 mL d'extrait aqueux de Cistanche deserticola, évaporer à sec dans un bain-marie, dissoudre dans du méthanol, porter à un volume constant dans une fiole jaugée de 10 mL, bien agiter, 0,22 μ Filtrer avec une membrane microporeuse, injecter des échantillons pour détermination à 0, 2, 4, 8, 12 et 24 heures selon les conditions chromatographiques en 2.2, et enregistrer la surface du pic. Résultats : la RSD de la surface maximale de l'échinacée était de 1,16 %, ce qui indique que la solution de test présentait une bonne stabilité dans les 24 heures.
2.7 Test de répétabilité
Mesurer avec précision 6 portions de 2,0 mL d'extrait aqueux de Cistanche deserticola, préparer 6 portions de la solution d'essai en parallèle selon la méthode décrite en 2.3.2, injecter des échantillons pour détermination selon les conditions chromatographiques décrites en 2.2 et enregistrer la surface du pic. Résultats : Le RSD de la concentration massique d'échinacée était de 1,28 %, indiquant que la méthode avait une bonne répétabilité.
Expérience Cistanche deserticola
2.8 Test de récupération d'addition d'échantillon
Mesurer avec précision 9 portions de 1,0 mL d'extrait aqueux de Cistanche deserticola, ajouter 0,8, 1,0 et 1,2 mL de solution de référence (101,552 mg · mL - 1), évaporer au bain-marie, dissoudre dans du méthanol et porter au volume dans une fiole jaugée de mL ; Bien agiter, filtre 0,22 μ avec une membrane filtrante microporeuse pour préparer une solution de test à concentration élevée, moyenne et faible. Préparez 3 parties de chaque concentration en parallèle, mesurez selon les conditions chromatographiques de 2.2, enregistrez la surface du pic et calculez la récupération de l'ajout d'échantillon. Les résultats sont présentés dans le tableau 1.
2.9 Détermination du contenu de l'échantillon
Mesurer avec précision 3 portions de 2,0 ml d'extrait aqueux de Cistanche deserticola, évaporer à sec dans un bain-marie, dissoudre dans du méthanol, porter à volume constant dans une fiole jaugée de 10 ml, bien agiter, filtrer 0,22 μ avec une membrane microporeuse, mesurer selon les conditions chromatographiques en 2.2, enregistrer la surface du pic et calculer la teneur en échinacée. Les résultats sont présentés dans le tableau 2.
Tableau 1 : Résultats des tests de récupération de l'échinacoside
Tableau 2 Résultats de la détermination de la teneur en échinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche herba
3. Discussion
3.1 Méthode de préparation de l'article d'essai
L'extrait aqueux de Cistanche deserticola contient divers composants chimiques tels que des glycosides de phényléthanol et des polysaccharides, qui provoquent certaines interférences avec les composants à tester. Cette étude a porté sur deux concentrations différentes de solvants, 50 % de méthanol et de méthanol. Les résultats ont montré que l'effet de séparation des pics dans le chromatogramme du produit testé utilisant 50 % de méthanol comme solvant était médiocre entre l'échinacée et les composants adjacents. En utilisant le méthanol comme solvant, la résolution du pic de glycoside d'échinacée est bonne et il n'y a aucune interférence provenant d'autres pics d'impuretés. Par conséquent, le méthanol a été choisi comme solvant pour la solution test. En utilisant du méthanol comme solvant, l’extrait aqueux de Cistanche deserticola a été évaporé à sec au bain-marie. Deux méthodes de traitement ont été utilisées : dissolution du méthanol, agitation à volume constant et dissolution par ultrasons du méthanol (10 min). Les résultats ont montré qu’il n’y avait pas de différence significative entre les deux méthodes. Cette méthode a été choisie pour préparer la solution d’essai en raison de l’opération simple de dissolution du méthanol et d’agitation à volume constant.
Cistanche aux herbes chinoises
3.2 Sélection de la phase mobile
Dans cette étude, il a été fait référence à la phase mobile (méthanol-0,1 % d'acide formique) utilisée pour la détermination de la teneur en Cistanche deserticola dans la Pharmacopée chinoise (Volume I) (2015). Les résultats ont montré que le pic du glycoside d'échinacée s'est élargi et qu'il y avait un phénomène de pointe, qui peut être lié à la faible capacité d'élution de la phase mobile ; En se référant à la littérature pertinente [12-13], de l'acétonitrile-0,5 % d'acide acétique a été utilisé comme phase mobile, mais la forme du pic de l'échinacée était médiocre et il y avait un phénomène de traînée. Compte tenu de la valeur du pH de la phase mobile, de l'acétonitrile-acide phosphorique à 0,4 % a finalement été utilisé comme phase mobile. En conséquence, le nombre théorique de plaques de pics d’échinacée était supérieur à 4 000 et la résolution entre l’échinacée et les pics des composants adjacents était supérieure à 1,5. La forme du pic était symétrique, sans interférence des pics d'impuretés, et la ligne de base était stable. Par conséquent, dans cette étude, de l'acétonitrile-0,4 % - 0.4 % d'acide phosphorique a été utilisé comme phase mobile chromatographique pour la détermination de la teneur en échinacée. Dans cette étude, la méthode HPLC a été utilisée pour déterminer l’échinacée dans l’extrait aqueux de Cistanche deserticola.
Poudre d'extrait de cistanche
La méthode est simple, précise et reproductible. Il convient à la détermination de l'échinacée dans l'extrait aqueux de cistanche deserticola et peut être utilisé comme méthode de contrôle qualité pour l'extrait aqueux de cistanche deserticola. Cette étude a uniquement déterminé la teneur en échinacée dans l'extrait aqueux de Cistanche deserticola. À l'avenir, il est prévu de déterminer la teneur en échinacée dans la décoction composée de Cistanche deserticola afin d'explorer l'impact de divers facteurs sur la teneur en échinacée, fournissant ainsi une référence pour le contrôle qualité de la décoction contenant Cistanche deserticola.
