Empreintes digitales HPLC et relation d'effet spectre-antitumoral pour la discrimination entre Mylabris Phalerata Pallas et Mylabris Cichorii Linnaeus

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Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 École de pharmacie, Université de médecine de Zunyi, Zunyi, Chine,

2 Laboratoire clé de pharmacologie fondamentale du ministère de l'Éducation et Laboratoire de recherche international conjoint d'ethnomédecine du ministère de l'Éducation, Université de médecine de Zunyi, Zunyi, Guizhou, Chine.

3 École des sciences médicales de base, Université médicale de Zunyi, Zunyi, Chine, 4 Laboratoire clé du Collège provincial de Guizhou pour la prévention et le traitement des tumeurs avec des médicaments distinctifs, Université médicale de Zunyi, Zunyi, Chine.

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Points forts

Cette étude fournit une méthode HPLC applicable, crédible et plus efficace pour discriminer deux espèces de Mylabris. Et, l'empreinte HPLC et le spectre-effets antitumorauxont été intégrés et les trois marqueurs différentiels importants ont été trouvés pour un nouveau marqueur de Mylabris.

Résumé

Objectif : Évaluation de la discrimination entre deux espèces de Mylabris sur la base de l'empreinte HPLC et du spectreeffet antitumoralrelation. Méthodes : Dans cette étude, une méthode simple et efficace de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) intégrant l'analyse chimiométrique et le spectre-effet antitumoralrelation a été développée pour la discrimination entre deux espèces de Mylabris : Mylabris phalerata Pallas (MP) et Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Résultats : Dans l'analyse des empreintes digitales, 14 pics caractéristiques ont été sélectionnés pour évaluer les différences entre MP et MC à l'aide de l'analyse de similarité et de reconnaissance de formes à l'aide de PCA et OPLS-DA. Les chromatogrammes HPLC d'échantillons provenant de 10 régions de Chine ont montré des différences entre MP et MC, et 7 marqueurs chimiques caractéristiques ont été trouvés. Dans le spectre-effet antitumoralanalyse relationnelle, 4 marqueurs d'activité ont joué un rôle vital dans la diminution de l'IC50 et pourraient être les composants antitumoraux de Mylabris par analyse relationnelle grise et analyse de régression linéaire multivariée. L'analyse chimiométrique en combinaison avec les résultats de la relation spectre-effet a indiqué que les pics 2 (cytosine), 4 (inconnu) et 14 (inconnu) étaient des marqueurs différentiels importants pour distinguer les deux espèces de Mylabris.

Conclusion : La méthode est applicable, crédible et plus efficace pour discriminer MP et MC, et offrira une nouvelle façon de faciliter le contrôle de la qualité des médicaments contre les insectes.

Mots-clés : HPLC, Empreintes digitales, Spectre-effet antitumoral, Mylabris, Discrimination

Arrière plan

Mylabris, appelé ban mao en Chine, a été utilisé comme médecine traditionnelle chinoise (MTC) pour traiter le furoncle, les ulcères profondément enracinés, une masse abdominale, et est un importantantitumoralagent. De plus, il est largement utilisé en Europe comme médecine traditionnelle [1]. Le principal constituant actif de Mylabris est la cantharidine, qui est unanti-tumoralcomposé [2]. Des études pharmacologiques modernes ont démontré que Mylabris possède de multiples activités et est très apprécié pour le traitement des tumeurs en raison de sa doubleanticancéreuxpropriétés et la capacité d'augmenter le nombre de leucocytes [3-4]. À l'heure actuelle, Mylabris a été largement utilisé dans certaines prescriptions cliniques de MTC anti-carcinome en Chine, telles que l'injection d'Aidi et la capsule Compound ban mao.

Selon la Pharmacopée de la République populaire de Chine (version 2015), Mylabris est défini comme un corps séché de Mylabris phalerata Pallas (MP) et Mylabris cichorii Linnaeus (MC), qui diffèrent par leurs caractéristiques botaniques, leur dynamique de population et leur écologie [ 5-6]. Mylabris est également un médicament hautement toxique. Étant donné que les médicaments disponibles en Chine sont généralement un mélange de MP et de MC, il est nécessaire d'identifier les différences chimiques et d'activité entre les deux espèces.

Étant donné que les TCM contiennent de nombreux ingrédients connus et inconnus, l'analyse quantitative du profil de leurs constituants chimiques pose un défi important. L'empreinte digitale de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) joue un rôle important dans le contrôle de la qualité (CQ) du TCM en raison de ses caractéristiques de profil globales de la plupart des composés dans un système complexe. En outre, l'analyse des empreintes digitales des TCM a une bonne reproductibilité et stabilité pour l'authentification des espèces et l'évaluation de la qualité, et est acceptée par l'Organisation mondiale de la santé, la State Food and Drug Administration of China (SFDA) et l'Agence européenne d'évaluation des médicaments (EMEA). Récemment, une analyse chimiométrique combinant l'empreinte HPLC a été développée pour le CQ et discriminant différentes sources naturelles complexes [7]. Cependant, il est inefficace de discriminer les différences entre les MTC car il ne peut pas refléter les différences de constituants actifs, ce qui est plus important pour une utilisation clinique. Jusqu'à présent, le spectre-antitumoral effetdes approches relationnelles ont été utilisées pour identifier avec succès les constituants bioactifs des TCM [8]. L'empreinte HPLC combinée à l'analyse chimiométrique et à la relation spectre-effet antitumoral permettra de mieux élucider la différence entre plusieurs sources de TCM.

Récemment, certaines méthodes ont été rapportées pour déterminer la teneur en cantharidine, qui peuvent être utilisées pour déterminer la qualité de Mylabris [9]. Certaines empreintes digitales chromatographiques ont également été appliquées pour le CQ [10-11]. Une seule étude a utilisé une méthode impliquant une élution par gradient des composés hydrosolubles de Mylabris basée sur HPLC. Pendant ce temps, seuls dix échantillons ont été utilisés, et aucun échantillon MC [12]. À notre connaissance, la discrimination de MP et de MC basée sur la composition chimique et l'activité n'a pas été étudiée auparavant.

Cette étude visait à développer une méthode simple et efficace pour discriminer deux espèces de Mylabris en utilisant l'empreinte HPLC combinée à l'analyse chimiométrique et au spectre-antitumoraleffetrelation, qui fournira une base pour le QC de Mylabris. Cette méthode pourrait également être appliquée pour identifier le marqueur QC d'autres TCM.

matériaux et méthodes

Au total, 20 lots de Mylabris phalerata Pallas (MP) et Mylabris cichorii Linnaeus (MC) ont été collectés dans différentes provinces de Chine (Tableau 1) et identifiés par notre prof Xiao-Fei Li. Les spécimens de référence ont été déposés dans nos laboratoires.

La cytosine, l'uridine, la guanosine et l'adénosine standard de référence ont été achetées auprès de ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Chine). L'acétonitrile et le méthanol de qualité HPLC ont été achetés chez Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, USA). L'eau pure de Watson a été utilisée tout au long de l'étude. Les autres produits chimiques et solvants étaient de qualité analytique et obtenus auprès du réactif Aladdin (Shanghai, Chine), du réactif Chengdu Kelong (Chengdu, Chine) et du réactif chimique Sinopharm (Pékin, Chine)

Appareillage et conditions chromatographiques

L'analyse HPLC a été réalisée à l'aide d'un système HPLC Agilent 1260 Infinity à 30 degrés sur un Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) pour la prise d'empreintes digitales. Une élution à gradient linéaire avec les éluants A (eau/acide acétique glacial, 100:1, v/v) et B (méthanol) a été utilisée pour la séparation. Le programme de gradient a été développé comme suit : 0-1 min, 3,0-4,6 % B ; 1-9 min, 4.6-6.8 % B ; 9-25 min, 6.8-51.0 % B ; 25-30 min, 51,0-100 pour cent . Le débit de la phase mobile était de 1,0 mL/min. Le chromatogramme a été contrôlé à 254 nm. Après une période d'équilibrage de 15 min, 10 μL d'échantillons ont été utilisés pour l'injection.

La préparation des échantillons

Les échantillons séchés ont été broyés en poudre et 2,5 g de chaque échantillon en poudre ont été extraits deux fois avec 5 0 ml d'éthanol à 75 % au reflux pendant 1,5 heure à chaque fois. L'échantillon extrait a été mélangé et concentré sous pression réduite à 20 ml. Le mélange a ensuite été précipité avec 80 ml d'eau pendant 24 heures sous 4 degrés. Par la suite, l'extrait a été centrifugé à 3 000 g min-1 pendant 10 min pour séparer le surnageant. Le surnageant a été concentré sous pression réduite à 25 mL. Enfin, le surnageant a été filtré sur un film Millipore de 0,22 µm avant analyse HPLC.

Validation de la méthodologie

La méthode HPLC a été validée pour sa précision, sa reproductibilité et sa stabilité (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h) . La validation a été estimée sur la base du temps de rétention (RT) et de la surface du pic (PA). Enfin, les empreintes chimiques de 20 lots de Mylabris ont été établies pour identifier les caractéristiques chimiques intégrées de multiples composés. Certaines techniques chimiométriques ont été introduites sur l'empreinte chimique pour analyse.

Analyse de reconnaissance de formes

Les différences entre deux espèces des zones de pic ont été évaluées pour leur signification statistique à l'aide du test t de Student non apparié. Une valeur de p inférieure à 0.05 a été considérée comme statistiquement significative. En tant que méthode classique non supervisée, l'analyse en composantes principales (ACP) est largement appliquée pour l'analyse de données statistiques. Au lieu d'utiliser de nombreuses variables, l'ACP prend un petit nombre de PC sans perdre beaucoup d'informations, et les tracés des scores sont ensuite visualisés pour une séparation libre des observations. Dans cette étude, l'ACP a été menée sur les zones de pic normalisées de chaque composant des empreintes HPLC à l'aide du logiciel SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics, Umea, Suède) pour trouver la discrimination entre les deux espèces de Mylabris.

Pour une discrimination plus préférée entre les deux espèces de Mylabris, une méthode supervisée d'analyse discriminante orthogonale des moindres carrés partiels (OPLS-DA) a été appliquée pour analyser les différences dans les zones de pic normalisées de chaque composant dans les empreintes HPLC. La valeur VIP est une somme pondérée des carrés des poids OPLS, reflétant la contribution relative de chaque variable X au modèle. Les variables avec VIP> 1, ainsi que S-plot ont été considérées comme influentes pour la séparation des échantillons dans les parcelles de score générées à partir de l'analyse OPLS-DA. Ensuite, les marqueurs chimiques caractéristiques de discrimination ont été obtenus.

Analyse de la relation spectre-effet antitumoral

Pour explorer leanti-tumoralsurface de pic d'effet pour les échantillons de Mylabris intégrés aux données d'empreintes digitales, et comparer les différences entre les deux espèces, la corrélation entre le pic d'empreintes digitales etanti-tumeureffets ont été étudiés. Deux méthodes combinant l'analyse relationnelle grise et l'analyse de régression linéaire multivariée (MLRA) ont été appliquées par SPSS19.0 (IBM, États-Unis) et GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, Chine). Laanti-tumeurtest a été effectué par nos méthodes publiées [12], les cellules HepG2 de la lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire humain ont été maintenues dans un milieu RPMI1640 additionné de 10% de sérum bovin fœtal. Les cellules ont été cultivées dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 à 37 C. La méthode SRB a été utilisée pour évaluer la prolifération desanti-tumeurActivités, puis l'IC50 des cellules HepG2 a été calculée, enfin, l'IC50 et les aires de pic normalisées ont été utilisées pour l'analyse chimiométrique. Ensuite, les marqueurs d'activité caractéristiques de Mylabris ont été obtenus.

Résultats et discussion

Optimisation des conditions d'extraction

Pour une extraction suffisante des composés hydrosolubles de Mylabris, le système d'extraction a été optimisé. Les ultrasons et le reflux ont montré que ces composés pouvaient être extraits de manière optimale par reflux.

Optimisation de la méthode HPLC

Pour obtenir des pics chromatographiques maximaux pour décrire la caractéristique globale de l'herbe, la composition de la colonne chromatographique, de la phase mobile et des longueurs d'onde de détection (200, 254, 265 et 278 nm) ont été étudiées. Les résultats ont montré que la colonne Phenimenex Synergy Polar-RP80, l'eau (contenant 1% d'acide acétique glacial) et le méthanol, et 254 nm étaient les meilleures conditions pour l'analyse HPLC Mylabris (Figure 1), la structure de 4 substances standard est illustrée à la Figure 2 .

Validation de la méthode

Dans cette étude, 14 pics ont été bien séparés et utilisés comme "pics communs". La précision, la répétabilité et la stabilité étaient basées sur le temps de rétention (RT) et la surface du pic (PA). Les valeurs RSD de RT et PA pour la précision (n=6) n'ont pas dépassé 0.2 et 4 %, respectivement ; Les valeurs RSD de RA et PA pour la répétabilité (n=6) étaient inférieures à 0.2 et 4 %, respectivement, et les valeurs RSD pour la stabilité (0-24 h) étaient inférieures à { {10}}.4 et 5 %, respectivement, ce qui indique que les échantillons étaient stables dans les 24 h. Ces résultats ont montré que la qualité des échantillons étudiés et la méthode HPLC étaient stables et bien contrôlées.

Évaluation de la similarité des empreintes digitales

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921 sauf pour les échantillons MC (de Guizhou2 et Guizhou4), dont les similitudes étaient respectivement 0.888 et 0.887. Ces données ont indiqué que la qualité de Mylabris au sein d'une espèce était stable. Cependant, les similitudes de seulement trois échantillons MP par rapport à l'empreinte HPLC de référence étaient > 0.930 ; et les similitudes de seulement deux échantillons MC par rapport à l'empreinte HPLC de référence étaient > 0,921. Ces résultats ont montré que les deux espèces de Mylabris présentaient des variations considérables dans certaines zones de pointe.

Discrimination de MP et MC par analyse de reconnaissance de formes

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, les pics 1, 2, 4, 7, 9, 12 et 14 pourraient être les variables les plus significatives pour discriminer les deux espèces (Figure 6). Le groupe de pics (1, 2, 4, 7, 9, 12 et 14) peut jouer un rôle essentiel dans la distinction entre MP et MC en tant que marqueurs chimiques caractéristiques.

Relation spectre-effet par analyse relationnelle grise

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Relation spectre-effet par MLRA

Le modèle MLRA est la méthode de modélisation la plus courante pour déduire la complexité de la relation entre deux ou plusieurs variables et une réponse qui a été construite par la formule suivante

Où Y est la valeur estimée et représente la réponse ; Xn est une variable indépendante, b{{0}} est l'ordonnée à l'origine et bn est le coefficient de régression pour Xn. Dans cette étude, la MLRA a été appliquée pour établir la relation empreinte-efficacité entre les valeurs des aires de pic dans les empreintes HPLC et l'IC50 de l'anti-HepG2, puis trouver les composants antitumoraux possibles. La colinéation des données a été trouvée par un modèle MLRA commun, qui ne convient pas pour explorer la corrélation entre Y (IC50) et X (PA). Un modèle PCA MLRA a été utilisé pour étudier la relation empreintes digitales-effet, et les six premiers PC avec un taux de contribution à la variance cumulée : 91,068 % ont été sélectionnés pour l'analyse. Enfin, l'équation suivante a été établie en fonction de la sortie SPSS et des PC : IC50=1.115864 plus （ 1.87268PA1- 699.722PA2 plus 25.7138PA3 - 24.1528PA4 plus 7.22878PA{{ 23}}.2114PA6 plus 2.95283PA7- 15.5305PA8 plus 13.0297PA9 plus 22.5683PA10 - 10.3462PA11 plus 123.762PA12 plus 31.0428PA13 - 10.702PA14) ×10-6. (R était de 0,682, P <>

Intégration de l'analyse de deux espèces de Mylabris

L'expérience a montré que l'empreinte HPLC pouvait être utilisée pour refléter les caractéristiques chimiques de Mylabris. Les algorithmes de similarité, PCA et OPLS-DA ont été appliqués pour trouver la différence entre MC et MP. Le groupe de pics (1, 2, 4, 7, 9, 12 et 14) a été défini comme des marqueurs chimiques caractéristiques.

De plus, GRA et MLRA se sont révélés être des méthodes satisfaisantes pour une discrimination plus poussée. En intégrant les résultats des analyses GRA et MLRA, les pics 2, 4 et 14 en tant que marqueurs d'activité de Mylabris devraient être responsables de l'effet antitumoral, qui peut être la base matérielle pharmacodynamique de Mylabris.

Les marqueurs différentiels importants ont été définis pour le pic avec des propriétés chimiques et de marqueur d'activité caractéristiques. Ainsi, entre MC et MP sur les empreintes HPLC après analyse de la relation spectre-effet, les pics 2 (cytosine), 4 (inconnu) et 14 (inconnu) étaient des marqueurs différentiels importants pour les différences entre MP et MC, comme le montre la figure 7.

Conclusion

En conclusion, dans la présente recherche, une méthode HPLC a été proposée pour l'empreinte chimique des MP et MC. En combinant l'empreinte HPLC, l'ACP et l'analyse des relations spectre-effet telles que GAS et MLRA, les propriétés chimiques et pharmacologiques de deux espèces proches de Mylabris pourraient être discriminées. Cela indiquait que les composés des pics 2 (cytosine), 4 (inconnu) et 14 (inconnu) en tant que marqueurs différentiels importants jouaient un rôle dominant dans la distinction entre MP et MC. La structure des pics 4 et 14 devrait être identifiée par une autre technologie. La méthode de prise d'empreinte HPLC combinée à une analyse statistique, chimiométrique et à une analyse de la relation spectre-effet s'est avérée efficace pour découvrir des composants marqueurs ou pour promouvoir le CQ demédicaments à base de plantes.

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