Identification d'ACOT13 et de PTGER2 en tant que nouveaux gènes candidats de la polykystose rénale autosomique dominante par séquençage de l'exome entier

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Na Du¹, Dan Dong³, Soleil Luyao¹, Lihe Che¹, Xiaohua Li¹, Yong Liu^2*†et Bin Wang^1*†

Résumé

Arrière plan:Polykystique autosomique dominantun rein(PKRAD) est la maladie monogénique la plus couranteun reindésordre. La moitié des patients évolueraient lentement vers une insuffisance rénale terminale. Cependant, la cible potentielle du traitement de la PKRAD fait toujours défaut.

Méthodes :QuatreADPKDpatients et deux membres de la famille en bonne santé ont été inclus dans cette étude. Les échantillons de sang périphérique ont été obtenus et testés par le séquençage de l'exome entier (WES). Les mutations autosomiques chez les patients PKRAD ont été retenues comme sites candidats. L'enrichissement de l'ontologie génétique (GO), de l'encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) et les analyses du réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) ont été effectuées par le package R du rouleau de cluster. Un ensemble de données contenant 18 patients ADPKD et trois échantillons normaux ont été téléchargés à partir de la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) et analysés à l'aide du package limma R.

Méthodes :QuatreADPKDpatients et deux membres de la famille en bonne santé ont été inclus dans cette étude. Les échantillons de sang périphérique ont été obtenus et testés par le séquençage de l'exome entier (WES). Les mutations autosomiques chez les patients PKRAD ont été retenues comme sites candidats. L'enrichissement de l'ontologie génétique (GO), de l'encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) et les analyses du réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) ont été effectuées par le package R du rouleau de cluster. Un ensemble de données contenant 18 patients ADPKD et trois échantillons normaux ont été téléchargés à partir de la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) et analysés à l'aide du package limma R.

Conclusion :Grâce à une combinaison d'analyses WES, d'expression génique et de réseau PPI, nous avons identifié ACOT13 et PTGER2 comme potentielsADPKD-gènes apparentés.

Mots clés:Séquençage de l'exome entier, Mutations géniques, Polykystiqueun reinmaladie, ACOT13, PTGER2

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Introduction

Polykystiqueun rein(PKD) est un groupe de troubles monogéniques et est la cause fréquente de l'insuffisance rénale terminale. La plupart des patients adultes sont atteints de la forme autosomique dominante (ADPKD), tandis que la polykystose autosomique récessiveun rein(ARPKD) est une forme plus rare qui se présente généralement en période périnatale ou dans la petite enfance [1]. Les mutations de PKD1 et PKD2, qui codent pour les protéines polycystines 1 et 2 (PC1 et PC2), sont les causes les plus fréquentes de PKRAD. PC2, un canal cationique, fait partie de la famille des canaux ioniques à potentiel de récepteur transitoire (TRP) [2]. Il a été rapporté que des défauts de PKD2 déclenchent des changements dans le métabolisme énergétique mitochondrial [3]. les rôles des complexes PC1 et PC1PC2 sont mal compris [4]. Bien que la PKD soit héritée de manière monogénique, elle est hétérogène en termes de phénotype, de gène et d'allèle [1], et 7 % desADPKDles familles sont génétiquement non résolues [5]. De plus, les mécanismes moléculaires sous-jacents à larénaldysfonctionnementrésultant de mutations dans les gènes PKD et les fonctions physiologiques des protéines de polycystine sont également encore peu claires [6].

Les protéines 1 et 2 (PC1 et PC2) sont les causes les plus fréquentes de la PKRAD. PC2, un canal cationique, fait partie de la famille des canaux ioniques à potentiel de récepteur transitoire (TRP) [2]. Il a été rapporté que des défauts de PKD2 déclenchent des changements dans le métabolisme énergétique mitochondrial [3]. les rôles des complexes PC1 et PC1PC2 sont mal compris [4]. Bien que la PKD soit héritée de manière monogénique, elle est hétérogène en termes de phénotype, de gène et d'allèle [1], et 7 % des familles de PKD sont génétiquement non résolues [5]. De plus, les mécanismes moléculaires sous-jacents au dysfonctionnement rénal résultant de mutations dans les gènes PKD et les fonctions physiologiques des protéines polycystines sont également encore mal connus [6].

Ici, nous avons effectué le WES en utilisant les échantillons de sang de quatre patients ADPKD et de deux membres de la famille en bonne santé pour analyser la variation de leurs gènes. En outre, un ensemble de données d'expression génique contenant 18 patients atteints de PKRAD et trois échantillons normaux ont été obtenus à partir de la base de données Gene Expression Omnibus (GEO). Grâce à des analyses intégrées de la mutation génique, de l'expression génique, de l'enrichissement de la fonction génique et de l'interaction protéine-protéine (PPI), nous avons identifié deux gènes (ACOT13 et PTGER2) potentiellement associés à la pathogenèse de la PKRAD.

matériaux et méthodes

Informations cliniques

Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique local (numéro d'approbation : 2019-307). Un patient PKRAD a été traité dans notre hôpital et cinq membres de cette famille ont été inclus dans cette étude. Ce patient avait des antécédents de polykystoseun rein maladie, maladie polykystique du foie et calculs rénaux pendant 13 ans (fichier supplémentaire 1 : tableau S1). L'arbre généalogique de cette famille est illustré à la Fig. 1A. Te N_2 était ce proband. Te N_4, N_5 et N_6 étaient tous des patients PKRAD (noirs), alors que N_3 et N_1 étaient des personnes en bonne santé (blancs) . Au total, il y avait quatre patients PKRAD et deux témoins sains dans notre étude. Les symptômes cliniques de ce proposant comprenaient de la fièvre, des maux de dos et une hématurie. L'examen tomodensitométrique (TDM) de N_2 a révélé de multiples kystes dans le foie et des reins polykystiques bilatéraux. Certaines lésions étaient des kystes complexes, avec des changements dans l'exsudation périrénale droite qui avaient des contours flous et une densité accrue (Fig. 1B).

Séquençage complet de l'exome

L'ADN du génome a été extrait d'échantillons de sang périphérique à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN (Tiangen Biotech, Pékin, Chine) et les exomes ont été capturés à l'aide du kit Agilent SureSelect Human All Exon V6 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) conformément aux instructions. des trousses. Le séquençage de l'exome entier a été réalisé à l'aide des instruments Illumina Novaseq6000 avec des lectures de séquençage 150-bp appariées. Les lectures de séquençage brutes ont été prétraitées pour supprimer les bases de faible qualité et les lectures à l'aide de fast [11], un préprocesseur FASTQ tout-en-un ultra-rapide, et les paramètres par défaut ont été adoptés. Les lectures de séquence ont été alignées sur le génome humain (Build-UCSC hg19) à l'aide du logiciel BWA (Burrow – Wheeler Aligner, http://bio-bwa.sourceforge.net/). Dix, le polymorphisme d'un seul nucléotide (SNP) et l'insertion/délétion (Indel) ont été identifiés avec le logiciel SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/). À l'aide du logiciel ANNOVAR (http://annovar.openbioinformat ics.org/en/latest/user-guide/download/), une annotation fonctionnelle a été effectuée pour les SNP et Indel identifiés afin d'étudier leurs emplacements génomiques et les informations de variation (fichier supplémentaire 2 : Tableau S2).

Dépistage du candidat SNP/Indel pour la PKRAD

Nous avons d'abord supprimé les mutations avec des fréquences supérieures à 1 % dans au moins une des quatre bases de données (1000g_all, esp6500si_all, gnomAD_ALL et gnomAD_ EAS). Dix mutations en positions exoniques ou d'épissage (10 pb en amont et en aval de l'exon) ont été conservées. Petits éclats (<10 bp)="" non-frameshifting="" indel="" mutations="" in="" the="" repeat="" region="" were="" also="" removed.="" in="" addition,="" mutations="" that="" met="" one="" of="" the="" following="" conditions="" were="" retained:="" (a)="" te="" sites="" that="" were="" considered="" as="" harmful="" by="" at="" least="" half="" of="" the="" four="" software="" sift="" [12],="" polyphen="" [13],="" mutationtaster="" [14],="" and="" cadd="" [15]="" basing="" on="" the="" scores;="" (b)="" mutations="" that="" were="" predicted="" to="" affect="" the="" splicing="" by="" dbscsnv="" [16].="" ten,="" the="" genetic="" mutations="" that="" were="" classified="" into="" pathogenic="" and="" likely="" pathogenic="" ones="" according="" to="" the="" criteria="" and="" guidelines="" for="" grading="" clinical="" significance="" of="" single-gene="" mutations="" of="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" and="" genomics="" (acmg,="" https://www.acmg.net/)="" were="" selected="" as="" candidate="" sites.="" for="" the="" screening="" of="" dominant="" genetic="" pattern,="" on="" the="" basis="" of="" mutation="" site="" filtering,="" the="" sites="" showing="" autosomal="" mutations="" in="" adpkd="" patients,="" which,="" however,="" could="" not="" be="" detected="" in="" normal="" controls="" were="" retained="" as="" candidate="">

Enrichissement fonctionnel et analyses PPI

Les données du profil d'expression de l'ARNm de GSE7869 [18] ont été téléchargées à partir de la base de données GEO (https://ncbi.nlm.nih.gov/geo), qui a été détectée sur la base d'Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array . L'ensemble de données GSE7869 contenait 18 échantillons ADPKD et trois échantillons normaux. Les données du profil d'expression de l'ARNm ont été analysées à l'aide du package de fonctions limma dans R [19]. Les gènes différentiellement exprimés (DEG) ont été sélectionnés en utilisant les seuils de valeur absolue d'expression différentielle (|Log2FC|) > 0.5 et P-value <>

analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel R v3.5.2. La valeur P <0.05 a="" été="" considérée="" comme="" statistiquement="" significative="" dans="" toutes="" les="" analyses="">

Results

Mutatisural landscape

Le nombre total de SNP dans les six échantillons était concentré entre 100, 000 et 150, 000, et ils étaient principalement situés dans la région de l'intron, la région de l'exon et la région intergénique (Fig. 2A). Le nombre total d'indels dans les six échantillons était concentré entre 15,000 et 20,000, et ces indels étaient principalement distribués dans la région intronique et intergénique (Fig. 2B). Nous avons ensuite exploré le paysage des mutations localisées dans la région codante. Par conséquent, les SNP de six échantillons de la région codante comprenaient principalement des mutations anonymes, faux-sens et stop-loss, dont le nombre cumulé était de près de 21, 000 (Fig. 2C). Les indels de six échantillons dans la région de codage consistaient principalement en une suppression sans décalage _ et une insertion sans décalage _ (Fig. 2D)

Mutations et gènes potentiels pour la PKRAD

Six gènes mutants, dont AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 et ADAM21, ont été criblés en utilisant le modèle génétique dominant. Ils ont été mutés de manière hétérozygote dans les échantillons d'ADPKD mais pas mutés dans les échantillons normaux. La plupart de ces gènes n'ont pas été signalés comme étant liés à l'apparition de la PKRAD. Parallèlement, 19 gènes ont également été sélectionnés en fonction de la nocivité de la mutation, notamment MUTYH, USH2A, HBS1L, GLI3, SBDS, SND1, ABCA2, RPS6KA4, FLVCR1, ATIC, SCN11A, ATP6V1A, GLRA1, PRMT8, PKD1, INSL3, SUPT5H, NCF4 , et GPR143. Pour étudier la relation entre ces mutations génétiques et la PKRAD, nous avons d'abord analysé les effets des mutations génétiques sur les protéines. Par conséquent, tous ces gènes avaient au moins une mutation qui pourrait affecter le codage de la protéine, indiquant les rôles potentiels de ces mutations (tableau 1).

Voies KEGG et termes GO significativement enrichis des gènes potentiels liés à la PKRAD

Les résultats des analyses d'enrichissement GO et KEGG des 25 gènes potentiels associés à la PKRAD sont présentés sur la Fig. 3A (processus biologique), la Fig. 3B (composant cellulaire), la Fig. 3C (fonction moléculaire) et la Fig. 3D (KEGG) . L'analyse GO a montré que ces 25 gènes étaient significativement enrichis dans les processus biologiques (BP) du processus cellulaire d'un seul organisme et de la réponse au stimulus, les composants cellulaires (CC) de la membrane plasmique et de la périphérie cellulaire, et la fonction moléculaire (MF) de la liaison des anions. De plus, l'analyse de la voie KEGG a révélé que ces 25 gènes étaient principalement enrichis en voies de signalisation de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et en voies cancéreuses.

ACOT13 et PTGER2 pourraient être des gènes candidats associés à la PKRAD

L'analyse du réseau PPI a été réalisée pour explorer l'association entre les 25 gènes potentiels liés à la PKRAD. Comme le montre la figure 3E, la plupart de ces gènes étaient indépendants dans le réseau. ACOT13 a eu une interaction directe avec le SBDS et l'ATIC ; Il a été prédit que PTGER2, ADCY4 et INSL3 interagissent les uns avec les autres (Fig. 3E). De plus, ACOT13, PTGER2 et ADCY4 étaient des gènes qui n'ont muté que chez les patients ADPKD. , sur la base des données d'expression téléchargées à partir de la base de données GEO, nous avons comparé les niveaux d'expression d'ACOT13, PTGER2 et ADCY4 entre les patients ADPKD et les témoins normaux. Comparé aux témoins normaux, le niveau d'expression d'ACOT13 était significativement plus faible chez les patients ADPKD (Fig. 4A), tandis que PTGER2 présentait un niveau d'expression plus élevé chez les patients ADPKD (Fig. 4B). ADCY4 n'a pas présenté de différence d'expression significative entre les patients PKRAD et les échantillons normaux (Fig. 4C). En combinant les informations, nous avons émis l'hypothèse que ACOT13 et PTGER2 pourraient être des gènes candidats associés à la PKRAD.

Discussion

La PKRAD est causée par une mutation dans l'un des deux gènes -78 % des cas sont causés par une mutation de PKD1 sur le chromosome 16 et 15 % des cas sont causés par une mutation de PKD2 sur le chromosome 4 [20]. Les maladies rénales kystiques ont également été appelées ciliopathies. Les protéines Te PC1 et PC2, codées par PKD1 et PKD2, sont toutes deux situées sur les cils primaires et agissent comme des capteurs de flux dans le rein [21]. Dans cette étude, la mutation nocive de PKD1, ainsi que 18 autres gènes nocifs connus, ont été détectés dans les échantillons de patients ADPKD. De plus, six mutants, dont AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 et ADAM21, ont été criblés en utilisant le modèle génétique dominant et la plupart d'entre eux n'avaient pas été auparavant reconnus comme des gènes pathogènes liés à la PKRAD.

Les protéines pathogènes de la PKRAD sont principalement responsables de la transmission des informations de l'environnement externe aux cellules [22]. Nous avons analysé les fonctions potentielles des 25 gènes identifiés par des analyses d'enrichissement GO et KEGG. Les résultats ont montré que les BP du processus cellulaire d'un seul organisme, la réponse au stimulus, ainsi que les CC de la membrane plasmique et de la périphérie cellulaire étaient significativement enrichis. En outre, les cellules ADPKD peuvent déplacer leur mode de production d'énergie de la phosphorylation oxydative vers d'autres voies, et ces altérations du métabolisme cellulaire sont devenues une caractéristique de l'ADPKD [6]. Les altérations de la modulation de la production et de l'utilisation d'énergie dans la PKRAD dépendent de plusieurs voies de signalisation cellulaires internes, telles que la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), la signalisation calcique au niveau des membranes associées aux mitochondries, la cible mammifère du complexe de rapamycine 1 (mTORC1), l'AMPc et le transport d'ions médié par le régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) [23, 24]. Ici, la voie de signalisation de l'AMPc a été identifiée comme celle significativement enrichie dans ces échantillons d'ADPKD. Ces résultats confirment la fiabilité des mutations que nous avons criblées. Pendant ce temps, malgré les informations fonctionnelles partiellement révélées par l'analyse d'enrichissement, plus de détails sur les 25 gènes identifiés méritaient une exploration plus approfondie dans la PKRAD à l'avenir.

Te PPI et les analyses d'expression différentielle ont indiqué que, par rapport aux personnes normales, ACOT13 et PTGER2 étaient mutés et exprimés de manière différentielle chez les patients ADPKD, et pourraient être les gènes potentiels associés à ADPKD. La protéine ACOT13 est un membre des enzymes acyl-CoA thioestérases (Acts), qui catalysent la réaction d'hydrolyse des molécules d'acyl-CoA gras en acides gras libres plus CoASH. ACOT13 est enrichi en tissus oxydatifs et est associé aux mitochondries [25]. Lin et al. ont rapporté que PC1 affectait la morphologie et la fonction des mitochondries, ce qui pourrait jouer un rôle clé dans la régulation de la fonction mitochondriale et du métabolisme cellulaire [26]. À notre connaissance, il n'y a pas eu de rapports sur la relation entre ACOT13 et ADPKD. L'expression de PTGER2 affecte le comportement biologique de divers types de tumeurs malignes [27-29], ce qui devrait être lié à l'enrichissement des voies dans le cancer dans l'analyse KEGG. Par ailleurs, le rôle de la prostaglandine E (2) (PGE2) dans la cystogenèse dans des modèles génétiquement non orthologues de PKRAD a déjà été étudié. Liu et al. ont découvert que la PGE2 pouvait activer les voies de signalisation aberrantes dans les épithéliums déficients en PC-1- et médier la prolifération et la sécrétion de chlorure dans les épithéliums rénaux kystiques de la PKRAD [30]. Elberg et al. ont indiqué le rôle de PTGER2 dans la médiation de l'effet PGE2 sur l'induction de la formation du kyste par des analyses combinées biochimiques, pharmacologiques et fonctionnelles dans la PKRAD [31]. Cela confirme encore la fiabilité de notre approche sur le dépistage des gènes pathogènes dans la PKRAD, qui peut être applicable dans d'autres maladies. Il soutient également indirectement la fiabilité d'ACOT13 en tant que gène potentiel lié à la PKRAD. Cependant, la fonction biologique sous-jacente d'ACOT13 dans la PKRAD mérite encore d'autres études.

conclusion

Dans cette étude, nous avons identifié deux gènes potentiels liés à la PKRAD, y compris ACOT13 et PTGER2, en analysant les résultats WES de quatre patients atteints de PKRAD et de deux membres de la famille en bonne santé combinés avec les données d'expression génique de la base de données GEO. Nos résultats peuvent être utiles pour d'autres études sur les causes pathologiques sous-jacentes de la PKRAD. Cependant, en raison du petit nombre de patients dans notre étude, il reste une certaine incertitude quant au rôle potentiel d'ACOT13 et de PTGER2, ce qui justifie encore des études supplémentaires.

Références

1. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, Horie S, Peters DJM, Torres VE. Polykystose rénale. Nat Rev Dis Amorces. 2018;4(1):50. https://doi. org/10.1038/s41572-018-0047-y.

2. Grieben M, Pike AC, Shintre CA, Venturi E, El-Ajouz S, Tessitore A, Shrestha L, Mukhopadhyay S, Mahajan P, Chalk R, et al. Structure du canal TRP de la polykystose rénale Polycystine-2 (PC2). Nat Struct Mol Biol. 2017;24(2):114–22.

3. Chumley P, Zhou J, Mrug S, Chacko B, Parent JM, Challa AK, Wilson LS, Berryhill TF, Barnes S, Kesterson RA, et al. Tronquer PKHD1 et

Les mutations PKD2 modifient le métabolisme énergétique. Am J Physiol Physiol rénal. 2019;316(3) : F414–25.

4. Kim DY, Park JH. Mécanismes génétiques de la PKRAD. Adv Exp Med Biol. 2016 ; 933 : 13–22.

5. Cornec-Le GE, Olson RJ, Besse W, Heyer CM, Gainullin VG, Smith JM, Audrezet MP, Hopp K, Porath B, Shi B, et al. Les mutations monoalléliques de DNAJB11 provoquent une polykystose rénale autosomique dominante atypique. Suis J Hum Genet. 2018;102(5):832–44.

6. Padovano V, Podrini C, Boletta A, Caplan MJ. Métabolisme et mitochondries dans la recherche et le traitement de la polykystose rénale. Nat Rev Néphrol. 2018;14(11):678–87. https://doi.org/10.1038/s41581-018-0051-1.

7. Bergmann C. Progrès récents dans le diagnostic moléculaire de la polykystose rénale. Expert Rev Mol Diagn. 2017;17(12):1037–54. https://doi. org/10.1080/14737159.2017.1386099.

8. Yang Y, Muzny DM, Xia F, Niu Z, Person R, Ding Y, Ward P, Braxton A, Wang M, Buhay C, et al. Résultats moléculaires chez les patients référés pour le séquençage clinique de l'exome entier. JAMA. 2014;312(18):1870–9.

9. Mallawaarachchi AC, Hort Y, Cowley MJ, McCabe MJ, Minoche A, Dinger ME, Shine J, Furlong TJ. Le séquençage du génome entier surmonte l'homologie pseudogénique pour diagnostiquer la polykystose rénale autosomique dominante. Eur J Hum Genet. 2016;24(11):1584–90. https://doi.org/10.1038/ejhg.2016.48.

10. Braun DA, Schueler M, Halbritter J, Gee HY, Porath JD, Lawson JA, Airik R, Shril S, Allen SJ, Stein D, et al. Le séquençage de l'exome entier identifie les mutations causales dans la majorité des cas consanguins ou familiaux avec une échogénicité rénale accrue apparue dans l'enfance. Rein Int. 2016;89(2):468–75.

11. Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. fast : un préprocesseur FASTQ tout-en-un ultra-rapide. Bioinformatique. 2018;34(17):i884–90.

12. Kumar P, Henikof S, Ng PC. Prédire les effets du codage de variants non synonymes sur la fonction des protéines à l'aide de l'algorithme SIFT. Protocole Nat. 2009;4(7):1073–81.

13. Flanagan SE, Patch AM, Ellard S. Utilisation de SIFT et de PolyPhen pour prédire les mutations de perte de fonction et de gain de fonction. Genet Test Mol Biomarqueurs. 2010;14(4):533–7.

14. Schwarz JM, Rodelsperger C, Schuelke M, Seelow D. MutationTaster évalue le potentiel pathogène des altérations de séquence. Méthodes Nat. 2010;7(8):575–6.

15. Itan Y, Shang L, Boisson B, Ciancanelli MJ, Markle JG, Martinez-Barricarte R, Scott E, Shah I, Stenson PD, Gleeson J, et al. Le seuil de signification des mutations : seuils au niveau du gène pour les prédictions de variantes. Méthodes Nat. 2016;13(2):109–10.

16. Liu X, Wu C, Li C, Boerwinkle E. dbNSFP v3.0 : une base de données unique de prédictions fonctionnelles et d'annotations pour les SNV humains non synonymes et de site d'épissage. Hum Mutat. 2016;37(3):235–41.