Amélioration de la production d'échinacoside et d'actéoside par élicitation en deux étapes dans la culture en suspension cellulaire de Cistanche Deserticola

pour plus d'informations :ali.ma@wecistanche.com

Wen-Hao Chen et al

Résumé

A des concentrations appropriées, les polyamines ont favorisé la croissance des callosités etéchinacosidecontenu deCistanche désertiquetandis que Ag plus augmentait la teneur enéchinacosideetactéoside. Dans une période de culture de 20- jours, lorsque de la putrescine (25 lM) et de l'Ag plus (10 lM) ont été ajoutés respectivement les jours 8 et 16, laéchinacosideproduction(1,7 gl–1) etactéosidela production (0.4 gl–1) a atteint le maximum, qui était de 1.4- fois et 1.5- fois de ceux d'un seul traitement à la putrescine, 1.6- fois et 1. 4- fois plus que dans le cas d'un traitement Ag plus unique, respectivement. La viabilité cellulaire améliorée par la putrescine exogène et l'activité enzymatique antioxydante ont nettement augmenté la biomasse finale. L'ajout d'Ag plus a augmenté de manière significative la teneur en H2O2 et l'activité de la phénylalanine ammoniaque lyase, ce qui a conduit à une augmentationéchinacosideetactéosideContenu.

Mots clésActéoside,Cistanche désertique, Échinacoside, Éliciteur, Culture en suspension

Abréviations

APOX Ascorbate peroxydase

CAT Catalase

H2O2 Peroxyde d'hydrogène

PAL Phénylalanine ammoniac-lyase

PeG Glycosides phényléthanoïdes

Espèces réactives de l'oxygène ROS

SOD Superoxyde dismutase

Cistanche désertique

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Introduction

Cistanche désertiqueYC Ma est largement utilisé dans la médecine traditionnelle chinoise. Les glycosides phényléthanoïdes (PeG) sont les principaux constituants bioactifs de cette plante.Parmi les PeG,échinacosideetactéosidesont les principaux composants pour améliorer la puissance sexuelle, réguler la fonction immunitaire, piéger les radicaux libres et les propriétés anti-vieillissement (Song et al. 2003). En raison de la surexploitation, de la culture difficile et de l'environnement détérioré, Cistanche désertiqueles plantes sont au bord de l'extinction. La culture de cellules végétales peut être une alternative intéressante pour obtenir ces composants bioactifs. Les principaux problèmes rencontrés en culture in vitro deCistanche désertiquesont à faible biomasse et à faible teneur en PeG. De nombreux éliciteurs stimulent la synthèse de la PeG (Cheng et al. 2005, 2006 ; Lu et Mei 2003 ; Ouyang et al. 2003a ; Xu et al. 2005), mais malheureusement, la plupart des éliciteurs diminuent la biomasse cellulaire.

Depuis quelques années, la combinaison de différents éliciteurs est explorée dans la culture en suspension de cellules végétales. En raison des différentes actions des différents éliciteurs, la combinaison de différents éliciteurs peut obtenir un effet synergique. Les éliciteurs peuvent être ajoutés en même temps, par exemple dans la culture en suspension de Taxus spp. (Yuan et al. 2002) et le ginseng (Bae et al. 2006). D'autre part, l'ajout de différents éliciteurs au stade de la croissance de la biomasse et au stade de la production de métabolites secondaires respectivement a donné la production maximale de biomasse et de taxol dans la culture en suspension de Taxus baccata ( Khosroushahiet al. 2006). Cependant, peu de rapports sont disponibles concernant l'utilisation des éliciteurs de combinaison dans la culture cellulaire de Cistanche désertique.

EhcinacosidedansCistanche désertique

Rapports précédents surCistanche désertiquese sont concentrés sur l'augmentation de la teneur en PeG, mais les éliciteurs tels que les polyamines pour favoriser la biomasse ont été partiellement ignorés. Les polyamines peuvent favoriser la biomasse des cals en améliorant la prolifération cellulaire et en atténuant la sénescence cellulaire (Bais et Ravishankar 2002). Il a été rapporté récemment que les polyamines étaient impliquées dans l'interaction avec l'éthylène et la tolérance au stress abiotique, tandis que l'éthylène et les espèces réactives de l'oxygène (ROS) du stress abiotique entraînaient la sénescence et la mort des cellules (Cona et al. 2006). D'autre part, le stress oxydatif causé par les éliciteurs a entraîné l'accumulation de ROS, y compris le peroxyde d'hydrogène (H2O2) et l'anion superoxyde (O2–), qui ont été signalés comme médiateurs avec la mort cellulaire programmée et la synthèse des métabolites secondaires en tant que molécules de signal (Yuan et al. 2001 ; Xu et Dong 2005). Par exemple, H2O2 a induit l'expression génique de la phénylalanine ammonia-lyase (EC 4.3.1.5), une enzyme clé pour la réponse de défense et le métabolisme secondaire (Desikan et al. 1998), qui a régulé la production de PeG dans la culture cellulaire deCistanche désertique(Cheng et al. 2005 ; Ouyanget al. 2003a). Compte tenu du stress oxydatif, certains ions métalliques, tels que Ni2 plus , Co2 plus , Ag plus , ont favorisé efficacement la synthèse des métabolites secondaires dans de nombreuses plantes (Zhao et al. 2005). Peut-être peuvent-ils améliorer l'activité PAL et la production de PeG. Dans cette étude, des polyamines et des ions métalliques, ainsi que la combinaison de ces éliciteurs, ont été appliqués pour améliorer la croissance des callosités,échinacoside, etactéosidecontenu de Cistanche désertique. En outre, la relation entre les éliciteurs et la teneur en H2O2, ainsi que leurs effets sur les activités du PAL et des enzymes antioxydantes ont également été étudiées.

matériaux et méthodes

Matières végétales

Cistanche désertiquedes lignées cellulaires ont été induites à partir de la tige. Après stérilisation, la tige a été découpée en morceaux d'environ 1 cm3 et cultivée sur un milieu B5 (Gamborg et al. 1968) contenant 5 lM d'acide naphtalène acétique (NAA), 9 lM de 6-benzyl adénine (6-BA), 4 lM 2,4-acide dichlorophénoxyacétique (2,4-D) et 30 g de saccharose l–1. Après 30 jours, le cal jaune clair a été retiré et sous-cultivé sur du milieu B5 avec 5 lMNAA, 9 lM 6-BA et 1 lM 2,4-D, et la culture en suspension cellulaire a été établie selon les méthodes d'Ouyang et al. (2003b).

Culture de callosités

Environ 1,5 g de cal frais (0.125 g DW) de 20-culture en suspension d'un jour deCistanche désertiquea été inoculé dans un erlenmeyer de 250- ml contenant 50 ml de milieu B5. Le milieu B5 a été complété avec 5 lM de NAA, 9 lM de 6-BA, 1 lM de 2,4-D et 30 g de saccharose l–1 à un pH de 5,6 avant l'autoclavage. Toutes les expériences ont été réalisées avec trois répétitions à 25 degrés dans l'obscurité sur un agitateur rotatif (110 tours min-1) pendant 20 jours.

ActédosiedansCistanche désertique

Traitements éliciteurs

Dans une seule expérience d'élicitation, des solutions stérilisées sur filtre de putrescine (Put), de spermine (Spm), de spermidine (Spd), de nitrate d'argent et de chlorure de cobalt ont été ajoutées au milieu à des concentrations conçues pour étudier leurs effets sur la croissance des cals et la teneur en PeG. Avec un type et une concentration d'éliciteur optimaux, l'effet du temps d'alimentation a été étudié. Ensuite, sur la base de la concentration optimale et du temps d'alimentation, la combinaison de différents éliciteurs a été conçue pour améliorer la production de PeG dans une expérience d'élicitation en deux étapes. La culture de cals sans éliciteurs a servi de témoin. Pour étudier le mécanisme d'action des éliciteurs, le cal a été retiré à un moment donné après l'ajout de l'éliciteur pour une analyse plus approfondie dans l'expérience d'élicitation en deux étapes.

Dosages biochimiques

À un moment donné après l'ajout de l'éliciteur, les cellules ont été filtrées et lavées doucement avec de l'eau distillée. Ensuite, la viabilité cellulaire a été déterminée par coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium selon la méthode de Verleysenet al. (2004), L'indice de viabilité est défini comme l'absorbance mesurée par gramme de tissu frais. La teneur en H2O2 des cellules fraîches a été déterminée selon la méthode de Velikova et al. (2000). La détermination de l'activité de la phénylalanine ammonia-lyase (PAL) (EC 4.3.1.5) était basée sur la méthode de Koukol et Conn (1961). Les méthodes utilisées pour l'extraction et la détermination de la superoxyde dismutase (SOD) (EC1.15.1.1), de la catalase (CAT) (EC 1.11.1.6), de l'ascorbate peroxydase (APOX) étaient les mêmes que celles de Jebara et al. (2005).

Mesure de la biomasse, de l'échinacoside et de l'actéoside

Pour la détermination du poids sec (DW), le cal a été filtré et lavé avec de l'eau distillée, puis lyophilisé à poids constant pour enregistrer le poids sec.

Les cellules sèches (20 mg) ont été extraites avec 10 ml de méthanol à 50 % (v/v) à température ambiante sous ultrasons (40 kHz, 160 W) pendant 15 min. Après filtration à travers un filtre de 0,22 lm, 20 ul d'échantillons ont été injectés dans un système HPLC (Waters 2695) équipé d'une colonne C18 (Diamonsil, 250 mm · 4,6 mm, granulométrie 5 μm). La phase mobile était constituée de méthanol et d'une solution d'acide acétique à 0,05 % (v/v) dans le rapport de 35:65 (v/v). Le débit était de 1,0 ml min^–1, la température de la colonne était de 30 degrés et la longueur d'onde de détection UV (Waters 2996) était de 334 nm.

Les courbes d'étalonnage deéchinacosideetactéosideétaient en bonne linéarité sur la plage de {{0}}.2–6.4 lg(r=0.9997) et 0.16–4.6 lg (r {{1{{ 24}}}}.9995), respectivement. Les récupérations moyennes d'échinacoside et d'actéoside (n=5) étaient de 98,7 % (RSD=1.5 %) et de 98,2 % (RSD=1 0,28 pour cent), respectivement. Les expériences de précision et d'exactitude ont montré de bons résultats, l'écart-type relatif était inférieur à 2 %. Les limites de quantification étaient respectivement de 0,04 et 0,06 µg pour l'échinacoside et l'actéoside. Les étalons d'échinacoside et d'actéoside ont été achetés auprès du NICPBP (Institut national pour le contrôle des produits pharmaceutiques et biologiques, Pékin, Chine). Production d'échinacoside/actéoside=teneur en échinacoside/actéoside (mg g–1 DW) x biomasse (g DW l^–1).

analyses statistiques

Toutes les expériences et déterminations ont été répétées trois fois et toutes les valeurs étaient les moyennes de triples ± SE. Les données ont été soumises à une analyse de variance (one-wayANOVA, test de Tukey) pour détecter des différences significatives par PROC ANOVA de SAS version 6.12.

Résultats

Effets des polyamines sur la croissance des callosités,échinacoside, etactéosidecontenu.

Le tableau 1 montre les effets des polyamines sur la croissance des callosités,échinacoside, etactéosidecontenu deCistanche désertique. Put et Spm ont favorisé la croissance des callosités de manière significative à une concentration appropriée. Environ 25 lM de Put étaient les plus efficaces et la biomasse (11,2 g DW l–1) était 1,3- fois celle du témoin. Enrichis en polyamines simultanémentéchinacosidecontenu de manière significative. Lorsque 25 lM Put ont été ajoutés,échinacosidele contenu a été augmenté de 46 % par rapport au témoin alors qu'aucune augmentation significative du contenu en actéoside n'a été trouvée.

Effets de Ag plus et Co2 plus sur la croissance des cals, la teneur en échinacoside et en actéoside

Les effets des ions métalliques sur la croissance des cals,échinacoside, etactéosideLe contenu est illustré dans le tableau 2. Les contenus en échinacoside et en actéoside ont été fortement favorisés par Ag plus tandis que la croissance du cal a été légèrement inhibée. Lorsque 10 lM Ag plus ont été ajoutés,échinacosidecontenu etactéosidele contenu ont été augmentés de 73 % et de 62 %, respectivement, par rapport au témoin. Simultanément, il n'y avait pas de différence significative dans la biomasse entre le traitement Ag plus et le témoin. Co2 plus a à peine montré des effets positifs sur la croissance des cals et la teneur en PeG.

Effets du temps d'alimentation sur la croissance des cals, la teneur en échinacoside et en actéoside

Put (25 1M) et Ag plus (10 1M) ont été sélectionnés pour d'autres expériences. Les effets du temps d'alimentation sur la croissance des callosités,échinacoside, etactéosideLe contenu est indiqué dans le tableau 3. Lorsque Put (25 lM) a été ajouté au jour 8, la biomasse maximale (11,8 g DW l–1) a été obtenue. Dans l'intervalle, leéchinacosidela teneur a été portée à 107,2 mg g–1 DW tandis queactéosidele contenu était presque le même que celui du témoin.

Ag plus l'addition à un moment plus précoce a conduit à moins de biomasse. En ajoutant Ag plus (10 lM) au jour 16, les deuxéchinacosidecontenu(127,9 mg g–1 DW) etactéosidecontenu (34,2 mg g–1 DW) a atteint le maximum, qui était 2,2- fois et 1,4- fois celui du témoin, respectivement.

Les effets combinés de Put et Ag plus sur la croissance des callosités, la production d'échinacoside et d'actéoside

Comme le montrent les résultats des éliciteurs uniques, l'ajout de Put au stade précoce a amélioré la biomasse, et l'ajout d'Ag plus au stade tardif a favorisé la teneur en échinacoside et en actéoside sans diminuer la biomasse de manière marquée. Un protocole d'élicitation en deux étapes a donc été conçu. Put (25 lM) et Ag plus (10 lM) ont été ajoutés à leurs stades optimaux respectifs.

La figure 1 montre les effets de la combinaison de l'ajout de Putand Ag plus sur la croissance des cals,échinacoside, etactéosideproduction contrairement au contrôle. Lorsque Put (25 lM) a été ajouté au jour 8 et Ag plus (10 lM) a été ajouté au jour 16, la biomasse optimale (11,4 g DW l–1), la teneur en échinacosides (152,4 mg g–1 DW) et la teneur en actéosides (36,1 mg g–1 DW) ont été atteints au jour 20 (Fig. 1). Laéchinacosideproduction (1,7 gl–1) etactéosidela production (0.4 gl–1) s'élevait à 3,3- fois et 2,1- fois à celles du contrôle, respectivement, qui étaient supérieures à celles de l'élicitation unique (tableau 3) . Par rapport au traitement à éliciteur unique, leéchinacosideetactéosidela production en combinant les éliciteurs était 1.4- fois et 1.5- fois celle du traitement Put unique, 1.6- fois et 1.4- fois celle du traitement Ag plus unique , respectivement. La culture prolongée a diminué la biomasse, la production d'échinacosides et la production d'actéosides (Fig. 1)

Fig. 1 Les profils de biomasse (A),échinacoside, etactéosideproduction (B) avec/sans éliciteurs combinés en culture en suspension deCistanche désertique. Les barres verticales représentent l'erreur standard de trois répétitions. Callus, 0.125 g DW, a été inoculé dans des flacons Erlenmeyer de 250- ml contenant 50 ml de milieu B5. Du put (25 ul) et de l'Ag plus (10 ul) ont été ajoutés au jour 8 et au jour 16, respectivement. Les expériences ont été réalisées à 25 degrés dans l'obscurité sur un agitateur rotatif (110 tr/min) pendant 20 jours.

Effet de Put et Ag plus sur la viabilité cellulaire, la teneur en H2O2 et les activités de PAL et des enzymes antioxydantes

Comprendre le mécanisme d'action des éliciteurs sur la croissance cellulaire et le métabolisme secondaire desCistanche désertique, les modifications de la viabilité cellulaire, de la teneur en H2O2 et des activités de PAL et des enzymes antioxydantes après l'ajout de Put et Ag plus ont été examinées dans la culture d'élicitation en deux étapes. WhenPut a été ajouté le jour 8 (0 h sur la Fig. 2), la teneur en H2O2 a diminué rapidement, ce qui n'était que de 48,9 % du contrôle à la 6e heure, respectivement, et a récupéré progressivement au niveau du contrôle après 24 h (Fig .2A). La viabilité cellulaire a augmenté jusqu'à 12 h, puis a diminué régulièrement, ce qui était de 26, 9% et 16, 7% supérieur au témoin à 24 h et 48 h, respectivement (Fig. 2B). Les activités de la SOD et de l'APOX ont nettement augmenté après 6 h, et l'activité de la SOD a diminué à un niveau similaire au témoin après 24 h, tandis que l'activité de l'APOX était encore 1,3- fois celle du témoin (Fig. 2C, D). Putaddition n'a montré aucune influence significative sur l'activité CAT (Fig. 2E). La diminution de la teneur en H2O2 et la croissance de l'activité des enzymes antioxydantes signifiaient moins de dommages oxydatifs et maintenaient plus de cellules viables que le témoin.

Fig. 2 Les modifications de la teneur en H2O2, de la viabilité cellulaire, de l'APOX, de la SOD, du CAT et de l'activité PAL après l'addition au jour 8 de la culture en suspensionCistanche désertique. Les barres verticales représentent l'erreur type de trois répétitions

Simultanément, l'activité PAL a atteint le maximum à la 12e heure puis a diminué progressivement jusqu'au niveau similaire au témoin après 48 h (Fig. 2F).

Les cellules ont été cultivées en continu après l'ajout de Put, et Ag plus a été ajouté au milieu au jour 16 (0 h inFig. 3). La teneur en H2O2 a augmenté rapidement et s'est maintenue à un niveau significativement plus élevé que le témoin jusqu'à 48 h (Fig. 3A). Cependant, la viabilité cellulaire a été inhibée de manière significative et est devenue plus petite (Fig. 3B). L'activité APOX a gardé un niveau constant et a diminué après 24 h (Fig. 3C). Les activités de SOD et de CAT ont fortement augmenté après 3 h et ont atteint leurs maximums à 12 h et 6 h, respectivement, qui étaient 1,6- fois et 1,0- fois plus élevées que les témoins, puis ont chuté lentement (Fig. 3D , E). L'activité PAL a augmenté à 2,1- fois celle du contrôle après 24 h, ce qui était encore 22,5 % supérieur à celui du contrôle après 48 h (Fig. 3F).

Fig. 3 Les modifications de la teneur en H2O2, de la viabilité cellulaire, de l'activité APOX, SOD, CAT et PAL après Ag plus addition au jour 16 de la culture en suspensionCistanche désertiqueavec Put addition onday 8. Les barres verticales représentent l'erreur standard de trois répétitions.

Discussion

Les polyamines et les ions métalliques ont montré des influences différentes sur la croissance des cals et la production de PeG deCistanche désertique. À des concentrations appropriées, les polyamines ont principalement amélioré la croissance des cals, tandis que l'Ag plus a favorisé la production deéchinacosideetactéosidesignificativement. Lorsque Put et Ag plus à la concentration optimale ont été ajoutés à des moments différents, certains effets synergiques se sont produits.

Pour la croissance des cals, l'effet de promotion reposait sur le type de polyamines, la concentration et le temps d'alimentation. 25 IMPut a été le plus efficace pour la croissance des cals lorsqu'il a été ajouté le jour 8. L'éliciteur a montré l'effet de promotion optimal au stade précoce de la croissance. Bien que l'Ag plus et le Co2 plus se soient avérés améliorer les métabolites secondaires dans différentes plantes (Zhaoet al. 2005), seul l'Ag plus a montré un effet positif sur le contenu deéchinacosideetactéoside. Étant donné que l'Ag plus pouvait inhiber la viabilité et la prolifération cellulaires, l'ajout d'Ag plus le jour 16 a amélioré la production deéchinacosideetactéosidesans réduire significativement la biomasse.

Lorsque les cellules végétales sont exposées à un traitement éliciteur, l'éliciteur initie la transduction du signal à partir de la surface de la membrane plasmique et la production de ROS, induit une réponse de défense des plantes et améliore le métabolisme secondaire des plantes en régulant les enzymes clés qui catalysent la biosynthèse des métabolites secondaires cibles (Zhao et al. 2005). Le stress oxydatif dû au traitement par éliciteur entraîne une accumulation de ROS et peut être atténué par des enzymes antioxydantes, notamment SOD, APX, CAT et POD. Lorsque les dommages oxydatifs dépassent les fonctions des enzymes antioxydantes, les cellules végétales peuvent mourir à mesure que la viabilité cellulaire diminue.

On pense que H2O2, un type de ROS, intervient dans la mort cellulaire programmée et régule la synthèse des métabolites secondaires en induisant l'expression de nombreux gènes de défense et de gènes biosynthétiques des métabolites secondaires, tels que PAL. On pense que H2O2, un type de ROS, intervient dans la mort cellulaire programmée et régule la synthèse des métabolites secondaires en induisant l'expression de nombreux gènes de défense et de gènes biosynthétiques des métabolites secondaires, tels que PAL.

Les polyamines ont amélioré la tolérance au stress abiotique en éliminant efficacement les ROS, en protégeant l'acide nucléique et la membrane (Alca´zar et al. 2006) et en améliorant l'activité des enzymes antioxydantes (Tang et Newton 2005). Selon le rapport de Papadakis et Roubelakis-Angelakis (2005), Put a montré un meilleur effet bloquant sur l'accumulation de ROS que Spd et Spm. Comme le montrent nos résultats, le traitement final d'apport de biomasse était supérieur à ceux des traitements Spd et Spm. Exogenous Put a réduit la teneur en H2O2, augmenté les activités enzymatiques antioxydantes et la viabilité cellulaire efficacement. Une viabilité cellulaire probablement plus élevée a contribué à une plus grande prolifération et à une biomasse plus élevée. Ensuite, on pourrait expliquer pourquoi Ag plus l'ajout à un moment antérieur a conduit à moins de biomasse pour Ag plus une accumulation de H2O2 améliorée et une diminution significative de la viabilité cellulaire. Les activités des enzymes antioxydantes ont été améliorées pour atténuer le stress oxydatif sans influencer la viabilité cellulaire. L'ajout d'Ag plus a également favorisé l'activité PAL ainsi que la production deéchinacosideetactéosideconsidérablement. Le mécanisme pourrait être cohérent avec les résultats de Desiken et al. (1998) et Yuan et al. (2001). H2O2 pourrait jouer un rôle clé dans la prolifération cellulaire et la production de PeG. Mettez une activité PAL accrue etéchinacosidecontenu dans une certaine mesure, peut-être d'une manière différente pour mettre une teneur réduite en H2O2.

Au cours des dernières années, la plupart des rapports se sont concentrés sur l'effet d'un seul éliciteur sur la croissance du cal et la teneur en PeGs deCistanche désertique. Cependant, de nombreux éliciteurs n'ont pas amélioré la croissance des cals à une concentration optimale, comme l'aschitosane, l'éliciteur funal (Fusarium solani), le jasmonate de méthyle et l'acide salicylique (Cheng et al. 2006 ; Lu et Mei2003 ; Xu et al. 2005). Un mélange d'éléments de terres rares a amélioré la croissance cellulaire et la production de PeG, 26 % et 167 % de plus que celles du témoin, respectivement (Ouyanget al. 2003b). L'élicitation répétée avec un seul éliciteur a également considérablement amélioré la production de PeG (Cheng et al.2005, 2006). C'est une bonne alternative pour obtenir la production optimale de biomasse et de PeG en ajoutant différents éliciteurs à différentes étapes. Lorsque 25 lM de Put et 10 lM d'Ag plus ont été ajoutés aux jours 8 et 16, respectivement, leéchinacosidela production (1,7 gl–1) et la production d'actéosides (0.4 gl–1) ont atteint le maximum, qui était supérieur à ceux de l'élicitation simple Put ou Ag plus ainsi que des rapports antérieurs.

De : ' Amélioration deéchinacosideetactéosideproduction par élicitation en deux étapes dans une culture en suspension cellulaire deCistanche désertique' parWen-Hao Chen et al

---Monde J Microbiol Biotechnol (2007) 23:1451–1458 / Springer Science plus Business Media BV 2007

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