L'administration in vivo de consortiums de bactéries intestinales reproduit les métabotypes A et B de l'urolithine dans un modèle de rat non producteur d'urolithineⅠ

Pendant des décennies, la consommation d'ellagitanins (ET) et d'acide élagique (EA) a été associée à de nombreux effets biologiques, notamment des activités antioxydantes, anticancéreuses, anti-inflammatoires, antibactériennes et de réplication anti-VIH.1 Cependant, l'absorption et la biodisponibilité des ET et de l'EA sont très pauvres. Des études humaines antérieures ont montré que l'excrétion urinaire de l'EA et d'un EA-O-glucuronide est inférieure à 1 % de l'apport. 2,3 Néanmoins, bien que l'absorption de l'ET et de l'EA soit faible, ils sont en outre métabolisés par le microbiote colique en urolithines. (Uros), qui sont responsables, au moins en partie, des effets bénéfiques des aliments riches en ET et (ou) EA.1,4

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Premièrement, l'EA est libérée par l'hydrolyse des liaisons ester d'ET par l'enzyme connue sous le nom d'ellagitannase.5 L'EA subit une dégradation supplémentaire, produisant des dérivés du 6H-dibenzo[b,d]pyran-6-one appelés Uros. Cette cascade de réactions commence par un clivage du cycle lactone par une enzyme lactonase, aboutissant à l'acide lutéique, qui est ensuite décarboxylé en pentahydroxy-Uro (Uro-M5). Une déshydroxylation consécutive le convertit en tétrahydroxy-Uros (Uro-D, Uro-E et Uro-M6) et trihydroxy-Uros (Uro-C, UroM7 et Uro-G), pour finalement donner du dihydroxy-Uros (Uro-A et isoUro-A) et du monohydroxy-Uro (Uro-B), ce dernier étant généralement détecté lorsque l’isoUro-A est également produit.1

La grande variation des profils métaboliques Uro détectés chez l'homme après avoir consommé des aliments riches en ET indique des différences interindividuelles dans le microbiote colique responsable de la dégradation de l'ET.6–8 Les nombreuses interactions possibles entre les bactéries du côlon et l'organisme hôte pourraient expliquer les différents destins métaboliques des aliments (poly )phénols.6,9 Cette interaction bidirectionnelle entre le microbiote intestinal et les (poly)phénols a incité la communauté scientifique à regrouper la population en fonction de leurphénotype métabolique (type métallique) pour expliquer les différences dans les effets des polyphénols.10,11 Plus précisément, selon le métabolisme ET et EA, les individus peuvent être stratifiés en urométabotypes (UM) associés à la composition et à la fonctionnalité du microbiome intestinal.7,8,12

Trois UM humaines (UM-A, UM-B et UM-0) liées à trois profils de production d'Uro différents ont été décrites dans les populations occidentales et orientales.13–15 À cet égard, les individus du métabotype A (UM-A) produisent plusieurs Uros intermédiaires mais uniquement l'urolithine A (Uro-A), le principal Uro absorbé dans cette UM, à la fin de la voie catabolique microbienne. Les individus du métabotype B (UM-B) produisent des Uros intermédiaires et trois Uros finaux, à savoir l'urolithine B (Uro-B), l'urolithine A (IsoUro-A) et l'Uro-A, qui sont les principaux Uros absorbés dans l'UM-B. Ainsi, les Uros intermédiaires pourraient agir principalement dans l’intestin, tandis que les derniers pourraient avoir des effets locaux et systémiques.6 En revanche, les individus de type métallique 0 (UM-0) ne peuvent pas produire ces Uros finaux (seuls les Uros finaux). le précurseur Urolithine-M5 a été détecté jusqu'à présent, qui n'est pas absorbé dans l'intestin).

Des différences dans les profils uro ont été observées entre les UM et le long du gros intestin, montrant une production prédominante d'Uro dans la région distale du côlon.16–19 Remarquablement, le pourcentage d'UM-0 chez les volontaires sains espagnols et chinois est d'environ 10 % et pourrait être encore plus élevé dans la population américaine.13-15 Les genres bactériens Gordonibacter et Ellagibacter ont été identifiés comme étant capables de métaboliser l'EA en certains Uros.20-23Cependant, il a été constaté que certains intermédiaires (par exemple, Uro-D, Uro-E, Uro- M7 et Uro-G) et les Uros finaux (Uro-A et Uro-B) ne sont pas produits dans des cultures pures de ces bactéries, ce qui implique la nécessité pour d'autres bactéries de compléter l'ensemble des Uros qui configurent à la fois UM-A et UM-B. . Récemment, les consortiums bactériens intestinaux impliqués dans le métabolisme de l'EA pour produire les métabotypes uroproducteurs (UM-A et UM-B) in vitro ont été identifiés.24

Des consortiums bactériens contenant les genres Gordonibacter plus Enterocloster et Ellagibacter plus Enterocloster ont produit in vitro les urolithines associées à l'UM-A et à l'UM-B, respectivement.25 Cependant, la capacité de ces consortiums bactériens à reproduire les profils Uro humains associés à l'UM-A et à l'UM-B in vivo est encore inconnu. De plus, la sécurité de la consommation de ces bactéries productrices d'uro en tant que nouveaux probiotiques est encore incertaine, car elles n'ont pas été testées auparavant sur des animaux ou des humains. Dans la présente étude, les consortiums bactériens ci-dessus ont été évalués pour leur capacité à coloniser l'intestin de rats non producteurs d'Uro (de type UM-0-) ​​et à les convertir en uroproducteurs imitant respectivement l'UM-A et l'UM-B. La sécurité de ces consortiums bactériens a également été évaluée. En outre, deux nouvelles procédures basées sur la PCR quantitative en temps réel (qPCR) ont été développées pour détecter et quantifier Ellagibacter et Enterocloster dans des échantillons fécaux.

Matériels et méthodes

Produits chimiques et réactifs

Les uros ont été synthétisés chimiquement et purifiés par VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcie, Espagne). EA a été acheté auprès de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) a été obtenue auprès de FisherScientific (USA), tandis que le méthanol, l'éthanol et l'acide formique provenaient de Panreac Química (Barcelone, Espagne). Les solvants de qualité chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) ont été achetés auprès de JT Baker (Deventer, Pays-Bas). De l'eau ultra pure Millipore (Bedford, MA, USA) a été utilisée tout au long de l'étude. Tous les produits chimiques et réactifs étaient de qualité analytique.

Préparation de consortiums bactériens

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T et Enterocloster boulonné CEBASS4A9, tous isolés et identifiés dans notre laboratoire (CEBAS-CSIC, Espagne), ont été cultivés en anaérobie dans 5 ml de Wilkins. -Tubes de milieu anaérobie Chalgren (WAM, Oxoid) à 37 degrés pendant 48 h dans une chambre anaérobie Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, Galles du Sud, Royaume-Uni) et remis en suspension dans du PBS additionné de 10 % de glycérol et de 0,05 % de chlorhydrate de L-cystéine (PanReac Química, Barcelone, Espagne). Après incubation anaérobie, des consortiums ont été préparés.24,25 En bref, le « consortium bactérien A » contenait G. les souches d'urolithinfaciens et d'E. bolteae ; le « consortium bactérien B » contenait des cultures d'E. isourolithinifaciens et d'E. bolteae ; et un « cocktail témoin » contenait du PBS stérile avec 10 % de glycérol et 0,05 % de chlorhydrate de L-cystéine. Avant l'administration, tous les cocktails ont été distribués en aliquotes de 3,5 ml et conservés à −80 degrés.

Animaux, régimes alimentaires et conception expérimentale

Le protocole expérimental (référence 624/2020) a été approuvé par le gouvernement local, le Comité de bioéthique du Conseil national espagnol de la recherche (Madrid, Espagne) et le Comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université de Murcie (Espagne). Les expériences ont suivi les recommandations de l'Union européenne en matière d'expérimentation animale (Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques). Des rats Wistar (n=18 ; 9 femelles et 9 mâles) pesant 240 ± 31 g ont été obtenus auprès d'Envigo (Barcelone, Espagne). Ce modèle de rat a été sélectionné en fonction de son incapacité à produire des Uros observées dans nos études préliminaires dans lesquelles des échantillons fécaux provenant de différents modèles de rat ont été testés. Trois groupes (A, B et C) ont été formés en attribuant au hasard 6 animaux chacun (3 rats femelles et 3 rats mâles). ) par groupe (Fig. 1).

Chaque groupe de rats a été hébergé dans deux cages différentes, divisées par sexe, dans une pièce avec un environnement à température contrôlée (22 ± 2 degrés) avec une humidité relative de 55 ± 10 % et un cycle lumière-obscurité contrôlé (12 h). Les rats ont reçu un régime alimentaire standard (Teklad, Barcelone, Espagne) contenant (%/100 g de poids frais) 14,3 % de protéines (farine de gluten de maïs), 48 % de glucides (moulins de blé, blé moulu, maïs moulu) et 4 % de matières grasses (huile de soja). ), densité énergétique de 2,9 kcal g−1 et 4,1 % de fibres brutes, complétées par de la poudre d'EA d'une pureté supérieure ou égale à 95 % (3,6 mg pour 100 g de nourriture). L'EA a été mélangé de manière homogène avec de l'aliment standard broyé, regranulé et lyophilisé. Le régime enrichi en EA a été conservé à l'abri de l'humidité et de la lumière. La dose d'EA administrée auLe régime alimentaire des rats était d'environ 0,72 mg par rat et par jour (régime EA1×), soit une dose équivalente chez l'homme de 41 mg par jour − 1,26. Tous les groupes ont été nourris avec le régime EA 1× et de l'eau du robinet à volonté tout au long de l'expérience ( 5 semaines). Étant donné que l'EA détecté dans les échantillons fécaux était faible au cours de la première semaine, un peu d'EA supplémentaire a été ajouté dans les jours suivants. À la semaine 3, une dose supplémentaire de 1,5 mgEA par rat et par jour dissoute dans l'eau a été administrée par voie orale par gavage aux animaux (total=EA 3× régime), qui n'a été administrée que pendant 1 semaine. Enfin, à la semaine 4, ≈5 g de noix par rat et par jour (une autre source d'EA) ont été ajoutés au régime EA 1× et ont été maintenus jusqu'à la fin de l'étude pour évaluer l'impact de l'EA contenant la matrice alimentaire sur la capacité de la bactérie. pour produire des Uros. Le poids, la nourriture et la consommation d'eau ont été mesurés chaque jour. Les consortiums bactériens intestinaux ont été administrés par voie orale par gavage. Le groupe A a reçu 500 µL de cocktail bactérien A, le groupe B a reçu 500 µL de cocktail bactérien B et le groupe C (contrôle) a reçu 500 µL de PBS. Un gavage oral a été réalisé tous les 2 jours pendant les deux premières semaines et tous les jours pendant les 2 semaines suivantes. Au cours de la dernière semaine (jours 28 à 32), les animaux ont continué avec le même régime supplémenté en EA et en noix mais sans administration orale de bactéries. A la fin de l'étude, les animaux ont été sacrifiés à l'aide d'une chambre à CO2.

Procédures d'échantillonnage

Des échantillons fécaux ont été collectés au cours de l'étude pour l'analyse de l'uro par UPLC-ESI-QTOF-MS/MS et du microbiote intestinal par séquençage du gène de l'ARNr 16S et qPCR. Le sang a été extrait à différents moments (référence, jour 28 et fin de l'étude) pour des analyses hématologiques et biochimiques sériques. Des échantillons de sang ont été obtenus dans la veine de la queue (≈500 µL) et collectés dans des tubes contenant de l'héparine au départ et aux jours 28 et 32 ​​(Fig. 1). La séparation du plasma a été effectuée immédiatement par centrifugation à 3 000 g pendant 10 min à 4 degrés et congelée à - 80 degrés jusqu'à une détermination ultérieure des variables sérobiochimiques. Le foie, les reins et la rate ont été collectés, pesés et examinés pour détecter toute différence morphologique au moment du sacrifice.

Conception et optimisation des amorces et de la sonde pour la quantification d'Ellagibacter et Enterocloster par qPCR

Les séquences des gènes de l'ARNr 16S d'Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T et E. bolted CEBAS S4A9 ont été obtenues à partir de la base de données GenBank (base de données EMBL). Les séquences ont été alignées sur les genres bactériens phylogénétiquement proches à l'aide du logiciel d'analyse génétique évolutive moléculaire (MEGA 11) et inspectées pour détecter les régions de séquences conservées et variables afin de concevoir les amorces et la sonde permettant de détecter et de quantifier Ellagibacter et Enterocloster (Tableau 1). La sonde primersand a été conçue et validée avec les outils Primer Questand Oligo Analyser, respectivement (Integrated DNATechnologies, Inc., Belgique). La sonde TaqMan a été marquée aux extrémités 5 'et 3' avec un groupe 6-carboxy-fluorescéine. (6FAM) et un désaltérant aux mûres(BBQ), respectivement. La qPCR a été réalisée à l'aide d'un système de détection de séquence ABI 7500. Les concentrations finales de chaque amorce et sonde étaient de 300 et 375 nM pour Ellagibacter et de 200 et 500 nM pour Enterocloster. Un protocole qPCR conventionnel a été réalisé pour l'amplification de l'ADN d'Ellagibacter etEnterocloser, respectivement. Le profil de montée en puissance pour l'amplification d'Ellagibacter était de 1 cycle à 95 degrés pendant 5 min, suivi de 45 cycles à 95 degrés pendant 15 s, 50 degrés pendant 40 s et 72 degrés pendant 31 s. Enfin, 1 cycle à 72 degrés pendant 5 min a été ajouté. . Le profil de montée en puissance pour l'amplification Enterocloster était de 1 cycle à 95 degrés pendant 5 minutes, suivi de 40 cycles de 95 degrés pendant 15 s, de 65 degrés pendant 40 s et de 72 degrés pendant 31 s. Enfin, 1 cycle à 72 degrés pendant 5 min a été ajouté.

Extraction d’ADN fécal et analyses microbiennes intestinales

L'extraction de l'ADN à partir d'échantillons fécaux a été réalisée avec le kit de purification d'ADN tissulaire NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Allemagne), conformément aux instructions du fabricant avec quelques modifications. L'ADN a été quantifié par fluorimétrie (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, UK) et la pureté a été mesurée à partir du rapport d'absorbance à une longueur d'onde de 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, UK ). La composition du microbiote intestinal a été déterminée en séquençant les régions variables V3 et V4 du gène de l'ARNr 16S selon les protocoles Illumina (Illumina Inc., San Diego, Californie, États-Unis) avec une longueur de lecture de 2 × 300 pb à extrémités appariées (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). Le séquençage métagénomique a été réalisé sur une plateforme MiSeq-Illumina (service de séquençage FISABIO, Espagne). Le traitement des données, l'élimination des séquences chimériques, l'alignement des séquences et le regroupement des séquences génétiques de l'ARNr 16S ont été effectués comme décrit ailleurs pour obtenir la classification taxonomique.8,27 L'amplification de l'ADN de Gordonibacter a été réalisée dans un système qPCR ABI 7500 comme décrit précédemment.19,28 L'Enterocloster et l'Ellagibacter- des amorces et des sondes spécifiques conçues dans la présente étude ont été utilisées selon le protocole qPCR décrit ci-dessus. Les courbes standard de l'ADN génomique de Gordonibacter, Enterocloster et Ellagibacter ont été utilisées pour la quantification. Tous les échantillons fécaux ont été analysés en triple.

Extraction, détection et quantification des urolithines dans des échantillons fécaux

Des échantillons de matières fécales ({{0}},2–0,5 g) ont été extraits, dans une proportion de 1 : 10, avec une solution de MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), acidifié avec 0,1% HCl, et homogénéisé par vortex pendant 2 min et agitation à 1500 tr/min à température ambiante pendant 10 min dans un chauffe-bloc. La suspension a été centrifugée à 14 000 g à 4 degrés pendant 10 min, et le surnageant a été filtré sur un filtre à membrane PVDF de 0,22 µm (Millipore Corp., Bedford, MA) et dilué 3 fois avec du MeOH (0,1 % d'acide formique ) avant injection dans un système UPLC-ESI-QTOF-MS. Un système UPLC (Agilent 1290Infinity) couplé à un système LC/MS quadripolaire à temps de vol (QTOF) (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne) a été utilisé pour analyser les métabolites fécaux en utilisant une méthode d'élution par gradient comme décrit précédemment. .29,30 En bref, la séparation a été effectuée dans une colonne à phase inverse Poroshell 120 EC-C18, en utilisant de l'eau et de l'acétonitrile, tous deux acidifiés avec 0,1 % d'acide formique, comme phases mobiles. Le débit était de 0,4 mL min-1 et le volume d'injection était de 5 µL. Le logiciel d'analyse qualitative MassHunter (version B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne) a été utilisé pour le traitement des données. Tous les métabolites ont été identifiés par comparaison directe avec des standards et confirmés par leur masse moléculaire. Des courbes d'étalonnage ont été obtenues pour EA et les différents Uros avec une bonne linéarité (R2 > 0,99).

Hématologie et chimie clinique

Les variables hématologiques ont été déterminées dans du sang hépariné à l'aide d'un analyseur hématologique automatisé doté d'un logiciel spécifique pour les échantillons de sang de rat (AVDIA 120, Siemens, Munich, Allemagne). Les variables analysées étaient le volume corpusculaire moyen (MCV), l'hémoglobine corpusculaire moyenne (MCH), la concentration moyenne d'hémoglobine corpusculaire (MCHC), la distribution érythrocytaire (RDW), le volume plaquettaire moyen (MPV), le taux plaquettaire (PCT), la largeur de distribution plaquettaire (PDW). , la composante plaquettaire moyenne (MPC), la masse plaquettaire moyenne (MPM), la numération plaquettaire (PLT), la teneur en hémoglobine des réticulocytes (CHr) et le volume corpusculaire moyen des réticulocytes (MCVr). Les variables biochimiques du plasma, le calcium (Ca) et le phosphore (P) ont été analysées à l'aide d'un analyseur chimique et toxicologique Olympus AU400 (Beckman Coulter, Californie, États-Unis). Les variables biochimiques étaient les protéines totales (PROT), l'albumine (ALBU), la globuline (GLOB), la créatinine (CREA), le glucose (GLUC), le cholestérol (CHOL), les triglycérides (TRIGL), la phosphatase alcaline (ALP), la gamma-glutamyl transpeptidase ( GGT), l'aspartate aminotransférase (AST) et l'alanine aminotransférase (ALT). Enfin, les niveaux de thyroxine (T4) ont été analysés à l'aide d'un système de dosage immunologique IMMULITE® 1000 (Siemens).

analyses statistiques

Les données sont exprimées en moyenne ± écart type (SD). L'analyse statistique a été réalisée avec le logiciel SPSS version 27. 0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), et les différences avec p < 0.05 ont été considérés comme statistiquement significatifs. La normalité des données a été évaluée avec le test de Shapiro – Wilk. Des comparaisons entre différents groupes de traitement ont été effectuées à l'aide d'une analyse de variance mesurée répétée (RM ANOVA) avec le test post hoc T3 de Tukey ou de Dunnett, selon que les données suivaient respectivement une distribution normale ou non normale. Les différences entre les hommes et les femmes ont été explorées à l'aide du test t de Student apparié ou du test de rang signé de Wilcoxon lorsque les données étaient distribuées normalement ou non normalement, respectivement. L'analyse discriminante linéaire du chi carré (LEfSe) a été utilisée pour détecter les caractéristiques bactériennes différentielles entre les groupes. La corrélation de Pearson a été utilisée pour analyser les associations possibles entre les variables dans les données à distribution normale, tandis que la corrélation de Spearman a été appliquée aux données à distribution non normale. Les tracés de données ont été réalisés à l'aide de Sigma Plot 14.5 (logiciel Systat, San Jose, Californie, États-Unis).

Phytothérapie naturelle pour soulager la constipation-cistanche

Cistanche est un genre de plantes parasites appartenant à la famille des Orobanchaceae. Ces plantes sont connues pour leurs propriétés médicinales et sont utilisées en médecine traditionnelle chinoise (MTC) depuis des siècles. Les espèces de Cistanche se trouvent principalement dans les régions arides et désertiques de Chine, de Mongolie et d'autres régions d'Asie centrale. Les plantes Cistanche se caractérisent par leurs tiges charnues et jaunâtres et sont très appréciées pour leurs bienfaits potentiels pour la santé. En MTC, on pense que le Cistanche a des propriétés toniques et est couramment utilisé pour nourrir les reins, améliorer la vitalité et soutenir la fonction sexuelle. Il est également utilisé pour traiter les problèmes de vieillissement, de fatigue et de bien-être général. Bien que le Cistanche soit utilisé depuis longtemps en médecine traditionnelle, les recherches scientifiques sur son efficacité et sa sécurité sont en cours et limitées. Cependant, il contient divers composés bioactifs tels que des glycosides phényléthanoïdes, des iridoïdes, des lignanes et des polysaccharides, qui peuvent contribuer à ses effets médicinaux.

Chez Wecistanchepoudre de cistanche, comprimés de cistanche, capsules de cistanche,et d'autres produits sont développés en utilisantdésertcistecomme matières premières, qui ont tous un bon effet sur le soulagement de la constipation. Le mécanisme spécifique est le suivant : On pense que le cistanche présente des avantages potentiels pour soulager la constipation en raison de son utilisation traditionnelle et de certains composés qu'il contient. Bien que les recherches scientifiques portant spécifiquement sur l'effet du Cistanche sur la constipation soient limitées, on pense que de multiples mécanismes pourraient contribuer à son potentiel à soulager la constipation. Effet laxatif :Cistancheest utilisé depuis longtemps en médecine traditionnelle chinoise comme remède contre la constipation. On pense qu’il a un léger effet laxatif, qui peut aider à favoriser les selles et provoquer la constipation. Cet effet peut être attribué à divers composés présents dans le Cistanche, tels que les glycosides phényléthanoïdes et les polysaccharides. Humidification des intestins : Basé sur une utilisation traditionnelle, le Cistanche est considéré comme ayant des propriétés hydratantes, ciblant spécifiquement les intestins. Favoriser l'hydratation et la lubrification des intestins peut aider à adoucir les outils et à faciliter leur passage, soulageant ainsi la constipation. Effet anti-inflammatoire : La constipation peut parfois être associée à une inflammation du tube digestif. Cistanche contient certains composés, notamment des glycosides phényléthanoïdes et des lignanes, qui auraient des propriétés anti-inflammatoires. En réduisant l’inflammation des intestins, cela peut aider à améliorer la régularité des selles et à soulager la constipation.