Augmentation des taux de YKL-40 mais pas de protéine C-réactive chez les patients atteints de la maladie d'AlzheimerⅡ
Apr 11, 2023
2. Matériel et méthodes
2.1. Donneurs humains
Au total, 123 sujets ont été inclus dans cette étude : (1) sujets âgés non déments sans aucun signe de maladie neurodégénérative (témoins sains) classés comme témoins (n = 37) ; (2) MCI dû à des patients atteints de MA (MCI) (n=22) ; (3) patients probablement atteints de MA sporadique légère/modérée-sévère (n=34) ; (4) Patients parkinsoniens (n = 30). Les participants à l'étude provenaient de la clinique de la mémoire (témoins, sujets MCI et AD) et de l'unité des troubles du mouvement (participants PD) de l'hôpital universitaire 12 de Octubre (Madrid, Espagne). Les caractéristiques démographiques et cliniques des sujets sont répertoriées dans le tableau 1.
Tous les participants ont été classés à l'aide de critères de diagnostic établis parmi ceux atteints de MCI ou de démence probable de la maladie d'Alzheimer [43–45]. Le diagnostic était basé sur une évaluation clinique détaillée, une évaluation neuropsychologique et une neuroimagerie (IRM). L'atteinte fonctionnelle était mesurée par le score Clinical Dementia Rating (CDR) [46].
Les patients atteints de MP ont été diagnostiqués selon les critères de diagnostic clinique de la Movement Disorder Society (MDS) [47], et tous remplissaient les critères de la MP établie cliniquement. Les patients parkinsoniens ne se référaient pas à des troubles cognitifs et ne présentaient pas de symptômes de démence. Le groupe témoin était constitué d'individus cognitivement normaux âgés de 50 ans ou plus, sans signes cliniques de troubles cognitifs et sans antécédent de maladie neurologique ou psychiatrique.
Les critères d'exclusion pour chaque participant étaient une maladie cérébrovasculaire significative concomitante et la preuve de toute comorbidité neurologique, psychiatrique, médicamenteuse ou médicale non neurologique pouvant affecter la cognition ou la fonction motrice. L'approbation de l'étude a été obtenue auprès du comité d'éthique de la recherche de l'hôpital universitaire 12 de Octubre, et tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit.
2.2. Échantillon de fluide
Collecte Des échantillons de LCR ont été prélevés chez tous les sujets (y compris des patients sains et des sujets MCI, AD et PD) et traités selon des procédures standardisées par ponction lombaire dans des tubes en polypropylène stériles de 15 ml. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 3000 rpm à 4 ◦C pendant 10 min. Les aliquotes de surnageant ont été stockées à -80 ° C dans des tubes cryogéniques en polypropylène de 0, 5 ml avec un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Roche, Bâle, Suisse).
Des échantillons de sang ont été obtenus par ponction veineuse antécubitale de patients et de sujets sains. Le plasma a été isolé à partir de sang total prélevé dans des tubes EDTA-2Na de 7 mL. Le sang total a été centrifugé à 2000 rpm pendant 10 min à température ambiante. Les surnageants ont ensuite été collectés et aliquotés dans des tubes cryogéniques en polypropylène avec Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Bâle, Suisse) et stockés à -80 ◦C.
2.3. Échantillons de tissus
Du tissu de cortex orbitofrontal cérébral post-mortem a été obtenu à partir de donneurs de cerveau diagnostiqués avec la maladie d'Alzheimer et d'individus témoins. Les échantillons congelés ont été fournis par l'Institut de Neuropathologie Brain Bank IDIBELL-Hospital Universitari de Bellvitge (Hospitalet de Llobregat, Espagne). Le consentement du sujet a été obtenu conformément à la Déclaration d'Helsinki et l'approbation est venue du Comité d'éthique de la recherche de l'institution responsable.
Dans tous les cas, un consentement éclairé écrit était disponible. Les sujets ont été sélectionnés sur la base d'un diagnostic post-mortem de MA selon la pathologie de l'enchevêtrement neurofibrillaire et les plaques A [48]. Les cas de MA ont montré des changements neuropathologiques importants (stade de Braak V/VI et score de plaque neuritique modéré à fréquent). Les participants témoins ont été considérés comme ceux avec/sans symptômes neurologiques ou un faible degré de changement neuropathologique de la MA. Un total de 24 échantillons ont été classés en AD et témoins, comme présenté dans le tableau 2.
2.4. Purification de l'ADN et génotypage de l'apolipoprotéine E (APOE)
L'ADN génomique a été extrait du sang périphérique à l'aide du kit QIAmp DNA Blood Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne), conformément aux instructions du fabricant. Les polymorphismes humains APOE C112R et R158C ont été détectés pour identifier les allèles APOE ε2, ε3 et ε4, à l'aide du kit d'instruments LightCycler 480 II (Roche Diagnostics, Bâle, Suisse) en suivant les instructions du fabricant.
2.5. Analyse des protéines
Les concentrations plasmatiques et dans le LCR des biomarqueurs neuro-inflammatoires (YKL-40 et CRP) ont été analysées à l'aide de kits ELISA (Human Chitinase 3-like 1 Quantikine ELISA kit (DC3L10), R&D ; Human CRP Quantikine ELISA kit (DCRP{ {5}}), R&D) selon les instructions du fabricant. Les taux de protéines cérébrales YKL -40 et GFAP ont également été examinés par Western blot. Du tissu de cortex orbitofrontal cérébral post-mortem a été obtenu à partir de donneurs de cerveau diagnostiqués avec la maladie d'Alzheimer et d'individus témoins.
En bref, des échantillons de cortex orbitofrontal cérébral humain ont été incubés et homogénéisés dans un tampon de lyse (tampon Tris/HCl 50 mM, pH 7,4 contenant EDTA 2 mM, 0,2 % de Nonidet P-40, PMSF 1 mM, protéase, et Phosphatase Inhibitor Cocktails ; Roche, Bâle, Suisse) et centrifugé pendant 10 min à 14,000 tr/min à 4 ◦ C. Les surnageants ont été récupérés et conservés à -80 ◦C. La teneur en protéines a été déterminée à l'aide de la méthode BCA (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Des quantités égales de protéines (20 µg pour YKL -40 et 5 µg pour GFAP) ont été mélangées avec du tampon d'échantillon Laemmli additionné de -mercaptoéthanol, chauffé à 95 ◦C pendant 5 min, résolu par 10 % NuPAGE Bis-Tris Gels ( Thermo Fisher Scientific, MA, USA) et transféré sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (Millipore, MA, USA).
Ensuite, les membranes ont été bloquées et incubées pendant une nuit à 4 ◦C avec des anticorps primaires : un anticorps monoclonal de lapin recombinant anti-YKL-40 (ab255297, 1:500, Abcam) et un anticorps monoclonal de souris anti-GFAP (G3893, 1 :0000, Sigma Aldrich). Les membranes ont ensuite été incubées pendant 1 h avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) appropriés (G-21234, 1:5000, Thermo Fisher Scientific, MA, USA ; ab97023, 1:40000, Abcam).
La charge protéique a été surveillée à l'aide d'anticorps monoclonaux de souris conjugués à la HRP contre la -tubuline (ab40742, 1:5000, Abcam) pour YKL-40 ou contre l'actine (A1978, Sigma Aldrich) pour la détection du GFAP. Les complexes immuns ont été révélés par un réactif de chimiluminescence amélioré (ECL Clarity; Bio-Rad, CA, USA). La quantification densitométrique a été réalisée avec le logiciel Image Studio Lite 5.0 (Li-COR Biosciences, NE, USA). Les bandes de protéines ont été normalisées par rapport aux contrôles de charge et exprimées en pourcentage du groupe témoin
2.6. Analyses statistiques
L'analyse statistique et les graphiques ont été réalisés à l'aide du logiciel Stata/IC (Stata 16.1, StataCorp LLC, College Station, TX, USA) et Prism (GraphPad Software version 8.00, La Jolla, CA, USA). Après avoir évalué la normalité de la distribution, les différences de taux plasmatiques de YKL -40 et de CRP entre les groupes ont été analysées à l'aide du test de rang non paramétrique de Kruskal-Wallis. La valeur de p pour les comparaisons par paires est affichée avec la correction de Bonferroni. Un modèle de régression linéaire multiple descriptif a été réalisé pour tenir compte des variables de confusion (âge, sexe et APOE ε4) dans l'analyse d'association CSF YKL-40.
Les interactions des variables confondantes avec le diagnostic clinique ont été exclues du modèle (signification pour l'ensemble des interactions : p > 0.10). Le coefficient de régression est affiché sous la forme "b". Les différences dans la répartition par sexe, l'âge des participants, l'âge au début et les années depuis le début de la maladie entre les groupes ont été évaluées avec des tests du chi carré de Pearson et des tests ANOVA, le cas échéant.
Les associations entre les biomarqueurs et les caractéristiques démographiques ont été examinées avec des tests de corrélation de Pearson, des tests t de Student et des tests U de Mann-Whitney, le cas échéant. Un test de tendance non paramétrique (test de tendance de Jonckheere) a été réalisé pour évaluer l'existence d'une tendance lorsque l'exposition présentait des catégories ordinales. Les courbes ROC ont été construites après avoir modélisé la présence ou l'absence d'un diagnostic clinique donné avec une analyse logistique de régression.
Les niveaux d'expression de YKL{{0}} et GFAP Western blot ont été normalisés par rapport à leurs contrôles de charge respectifs ( -tubuline et -actine) et comparés à la moyenne du rapport de contrôle avec le test non paramétrique de Mann – Whitney U. Dans les graphiques, les niveaux de CSF et plasma YKL -40 et CRP sont indiqués sous forme de plage médiane et interquartile. L'expression cérébrale de YKL -40 est représentée par la moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Dans tous les cas, la signification statistique a été fixée à p < 0,05.
Le mécanisme de Cistanche traite la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson
Cistanche est une plante traditionnellement utilisée en médecine chinoise pour traiter une variété de problèmes de santé, y compris des troubles neurologiques comme la maladie d'Alzheimer (MA) et la maladie de Parkinson (MP). Cistanche contient plusieurs composés bioactifs, notamment des glycosides phényléthanoïdes et des glycosides iridoïdes, qui ont des effets antioxydants, anti-inflammatoires et neuroprotecteurs. Ces composés aident à protéger les cellules neuronales contre les dommages causés par les radicaux libres et les processus inflammatoires, qui sont censés contribuer au développement et à la progression de la MA et de la MP.
De plus, il a été démontré que Cistanche augmente les niveaux de certains neurotransmetteurs dans le cerveau, notamment la dopamine et l'acétylcholine, qui sont importants pour le fonctionnement normal du cerveau. En augmentant ces niveaux de neurotransmetteurs, Cistanche peut aider à améliorer la fonction cognitive et à réduire les symptômes de la MA et de la MP.
Dans l'ensemble, les mécanismes de Cistanche dans le traitement de la MA et de la MP impliquent ses effets antioxydants, anti-inflammatoires et neuroprotecteurs, ainsi que sa capacité à améliorer les niveaux de neurotransmetteurs dans le cerveau.
à suivre...
Víctor Antonio Blanco-Palmero 1,2,3,† , Marcos Rubio-Fernández 1,2,†, Desireé Antequera 1,2 , Alberto Villarejo-Galende 1,2,3 , José Antonio Molina 1,2,3, Isidro Ferrer 1,4,5,6 , Fernando Bartolomé 1,2,* et Eva Carro 1,2,*
1 Centre du réseau de recherche biomédicale sur les maladies neurodégénératives (CIBERNED), 28031 Madrid, Espagne ; victorb1989@gmail.com (VAB-P.); marcosrubio.imas12@h12o.es (MR-F.); eeara@yahoo.es (DA) ; avgalende@yahoo.es (AV-G.) ; cvillaiza@telefonica.net (CONFITURE ); 8082ifa@gmail.com (SI)
2 Groupe des maladies neurodégénératives, Institut de recherche de l'hôpital 12 de Octubre (imas12), 28041 Madrid, Espagne
3 Service de neurologie Hospital Universitario 12 de Octubre, 28041 Madrid, Espagne
4 Institut de recherche biomédicale Bellvitge (IDIBELL), Hospitalet de Llobregat, E08907 Barcelone, Espagne
5 Département de pathologie et thérapeutique expérimentale, Université de Barcelone, E08900 Barcelone, Espagne 6 Institut des neurosciences, Université de Barcelone, E08000 Barcelone, Espagne * Correspondance : fbartolome.imas12@h12o.es (FB) ; carroeva@h12o.es (CE); Tél. : plus 34-913908765 (FB & EC) ; Télécopie : plus 34-913908544 (FB et CE)
