Les nanozymes imitant la catalase détectant l'inflammation soulagent les lésions rénales aiguës en inversant le stress oxydatif local Ⅳ
Jun 19, 2024
Conclusion
Herbes biologiques pour les maladies rénales
Matériels et méthodes
Matériels
Synthèse et caractérisation de nanoparticules dMn3O4
La synthèse du lieur TK, du polyéthylèneglycol conjugué au lieur TK (PEG-TK) et du conjugué (PEG)-stéarine (C18) (PTC) a été réalisée conformément à notre publication précédente [15]. À titre de contrôle, nous avons également préparé un polymère (PC) non sensible aux ROS en conjuguant l'acide stéarique au PEG-AM. En bref, 200 mg de m-PEG amine ont été mis à réagir avec 160 mg d'acide stéarique avec 160 µl de TEA, 480 mg d'EDC et 290 mg de NHS dans 20 ml de DMF à 37 degrés pendant une nuit sous agitation sous purge de N2. L'échantillon a ensuite été purifié par dialyse (MWCO =12 – 14 KDa) contre DW pendant une journée, suivie d'une lyophilisation. Les structures chimiques du PTC et du PC synthétisés ont été confirmées par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 1 H) (400 Hz, Bruker : Billerica, MA, USA) dans le chloroforme (CHCl3). Des micelles vides PTC sensibles aux ROS et PC non sensibles aux ROS ont été préparées par auto-assemblage de PTC et de PC sous sonication et dialyse.
Préparation et caractérisation de l'enzyme sensible aux ROS (PTC‑M)
Le PTC-M a été préparé par la méthode de dialyse. En bref, 2 mg de dMn3O4 et 10 mg de PTC ont été dissous dans 1 ml de diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO). Le mélange a ensuite été ajouté goutte à goutte à 20 ml de DW sous sonication par sonde (amplitude 30 %, 5 s ON/OFF, 5 min). La solution a ensuite été dialysée (MWCO=12 – 14 KDa) contre du DW pendant une journée, suivie d'une lyophilisation. De même, des nanomicelles non sensibles aux ROS (PC-M) chargées de dMn3O4 NP ont également été préparées en tant que groupe témoin. Les diamètres hydrodynamiques et le potentiel zêta des nanomicelles vides préparées (PTC et PC) et des nanomicelles chargées de dMn3O4 NP (PTC-M et PC-M) ont été évalués par diffusion dynamique de la lumière (instrument Zetasizer Nano Z, Malvern, Royaume-Uni). La morphologie du PTC et du PTC-M préparés a été visualisée à l'aide de FE−TEM. La déstabilisation sensible aux ROS via la dégradation du lieur TK de PTC-M a été observée par analyse DLS et FE-TEM après traitement des échantillons avec 1 mM de H2O2. La teneur en dMn3O4 dans le PTC-M final a été analysée à l'aide d'un analyseur thermogravimétrique (TGA N-1000, Scinco, Séoul, Corée) et d'une analyse ICP-MS (820 ICPMS Varian Bruker, Billerica, MA, USA). .
La décomposition du H2O2 en eau et en oxygène a également été confirmée en utilisant le Ru(DDP) comme sonde pour la génération d'oxygène. En bref, 1 mM de H2O2 a été ajouté aux échantillons, suivipar l'ajout de 1 µM Ru(dDDP(DMF). Les échantillonsont été soigneusement mélangés et l'intensité de la fluorescenceà l'excitation 440 nm et à l'émission 530 – 730 nm étaitenregistré. Plus tard, la production d'oxygène a également été confirméeen déterminant la concentration d'oxygène dissous à l'aideun capteur d'oxygène dissous (RDO Optical Dissolved Sendirecteur, Thermo Scientific).
Culture cellulaire et réactifs
Les études in vitro ont été menées comme décrit précédemment [37]. En bref, des cellules épithéliales tubulaires proximales rénales humaines (cellules HK -2, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) ont été utilisées pour les études i vitro. Les cellules HK-2 ont été cultivées et passées tous les 3 à 4 jours dans des boîtes de 100- mm contenant une combinaison de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et de milieu Hams F-12 (Welgene, Daegu, Corée) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS ; Welgene), 100 U/ml de pénicillineet 100 mg/ml de streptomycine (Sigma-Aldrich). TeLes cellules HK-2 ont ensuite été incubées dans une atmosphère humidifiée.sphère de 5% de CO2et 95 % d'air à 37 degrés pendant 24 h, et souscultivé jusqu’à 70 – 80 % de confluence. Les cellules HK-2 étaientétalé sur des plats de 60- mm dans un milieu contenant 10 %FBS et incubé pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été encourues
Viabilité cellulaire
Absorption cellulaire
Cytométrie en flux
L'analyse par cytométrie en flux a été réalisée comme décrit précédemment (38). Un kit de coloration à l'annexine V FLUOS (SigmaAldrich) a été utilisé pour mesurer le niveau de liaison à l'annexine V conformément aux instructions du fabricant. En bref, après traitement avec 0 ou 1 mM H2O2 pendant 24 h avec ou sans 2 µg de prétraitement PTC-M, les cellules HK-2 ont été récoltées et lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate pré-refroidie et remises en suspension. dans un tampon de liaison contenant de l'annexine V. Après incubation dans l'obscurité pendant 15 min, les cellules ont été analysées par cytométrie en flux (Becton – Dickinson, San Jose, CA, USA). Plusieurs contrôles ont été utilisés pour optimiser les paramètres de l'instrument et déterminer le déclenchement pour la plate-forme Windows. Les cellules apoptotiques ont été définies comme PI négatives et positives à l'Annexine V-FITC.
Détermination de la génération de ROS intracellulaires
Pour déterminer la génération de ROS, nous avons utilisé le fluorophore DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) comme décrit précédemment (38). Les cellules HK-2 ont été incubées avec 0 ou 1 mM H2O2 pendant 24 h avec ou sans 2 µg de prétraitement PTC-M, et lavées deux fois avec la solution saline équilibrée de Hank, puis incubées avec le sel équilibré de Hank. solution (sans rouge de phénol) contenant du DCF-DA pendant 30 min à 37 degrés dans l'obscurité. Les images ont été obtenues avec un microscope à fluorescence (Nikon, Tokyo, Japon).
Animaux expérimentaux et protocoles
Biodistribution in vivo
Pour vérifier l'effet thérapeutique du PTC-M in vivo, le groupe de traitement a reçu une dose unique de 0,5 mg/kg de PTC-M par injection dans la veine caudale après la chirurgie. Les sourisont été euthanasiés après 48 heures de reperfusion. Des échantillons de sangont été recueillis du cœur, et lerein gaucheétaitrapidement retiré et traité pour le Western blot oufixé dans une solution de paraformaldéhyde à 4% pour immunohistochimie (IHC). Lerein droita été gelé à−80 degréspour l'analyse de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel.
Mesure NGAL plasmatique
Immunoempreinte semi-quantitative
L'analyse par Western blot a été réalisée comme décrit précédemment (37). Les tissus rénaux ont été homogénéisés dans une solution d'isolement glacée contenant du 0,3 M de saccharose, 25 mM d'imidazole, 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 8,5 mM de leupeptine et 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (pH 7,2). Les homogénats ont été centrifugés à 4000 × g pendant 15 min à 4 degrés pour éliminer les cellules entières, les noyaux et les mitochondries. La concentration totale en protéines a été mesurée à l'aide d'un kit de dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) (Pierce; Rockford, IL, USA). Tous les échantillons ont été ajustés pour atteindre les mêmes concentrations finales de protéines. Ils ont ensuite été dissous à 65 degrés pendant 15 minutes dans un tampon d'échantillon contenant du dodécylsulfate de sodium (SDS) et stockés à -20 degrés. Pour confirmer une charge égale des protéines, un gel initial a été coloré au bleu de Coomassie. L'électrophorèse sur gel SDS – Polyacrylamide (PAGE) a été réalisée sur des gels de Polyacrylamide à 9 ou 12%. Les protéines ont été transférées par électrophorèse sur des membranes de nitrocellulose (Hybond ECL RPN3032D; Amersham Pharmacia Biotech; Little Chalfont, Royaume-Uni) à l'aide d'un appareil Bio-Rad Mini Protean II (Bio-Rad; Hercules, CA, USA). Les transferts ont été bloqués avec 5 % de lait dans du PBS-T (Na2HPO4 80 mM, NaH2PO4 20 mM, NaCl 100 mM et 0,1 % de Tween-20 à pH 7,5) pendant 1 h ; incubé toute la nuit à 4 degrés avec des anticorps primaires ; et incubé avec des anticorps secondaires anti-lapin, anti-souris ou anti-chèvre conjugués à la peroxydase de raifort par la suite. Les immunoblots ont ensuite été visualisés à l’aide d’un système de chimiluminescence amélioré. Les niveaux de protéines ont été quantifiés par densitométrie. Les intensités relatives des signaux d'immunoblot ont été mesurées par densitométrie à l'aide du logiciel Scion Image pour Windows (Scion Corporation, 2000-2001. version Alpha 4.0.3.2. MD, USA) et exprimées sous forme de changements de pli par rapport aux contrôles. Les anticorps primaires et secondaires utilisés en immunoblot sont répertoriés dans le tableau S1.
Réaction en chaîne par polymérase en temps réel (PCR en temps réel)
L'analyse par réaction en chaîne par polymérase a été réalisée comme décrit précédemment (37). Les cortex rénaux ont été homogénéisés dans le réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). L'ARN a été extrait avec du chloroforme, précipité avec de l'isopropanol, lavé avec de l'éthanol à 75 %, puis dissous dans du DW. La concentration d'ARN a été déterminée par l'absorbance à 260 nm (Ultraspec 2000 ; PharMacia Biotech, Cambridge, Royaume-Uni). L'expression de l'ARNm des cytokines inflammatoires et des molécules d'adhésion a été déterminée par PCR en temps réel. L'ADNc a été fabriqué par transcription inverse de 5 µg d'ARN total en utilisant un amorçage oligo (dT) et une transcriptase inverse en exposant II (InvitRogen, Carlsbad, CA, USA). L'ADNc a été quantifié à l'aide d'un système Smart Cycler II (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) et SYBR Green a été utilisé pour la détection. Chaque réaction PCR a été réalisée dans 10 pM d'amorce directe, 10 pM d'amorce inverse, 2X SYBR Green Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC, Seta 3-4-1, Japon), 0,5 ul d'ADNc et H2O pour amener le volume final à 20. ul. Les niveaux relatifs d'ARNm ont été déterminés par PCR en temps réel, à l'aide d'un système de détection Rotor-GeneTM 3000 (Corbette Research, Mortlake, NSW, Australie). Les séquences des amorces sont répertoriées dans le fichier supplémentaire 1 : tableau S2. La PCR a été réalisée selon les étapes suivantes : 1) 95 degrés pendant 5 min ; 2) 95 degrés pendant 20 s ; 3) 58 à 60 degrés pendant 20 s (optimisé pour chaque paire d'amorces) et 4) 72 degrés pendant 30 s pour détecter SYBR Green. Les étapes 2 à 4 ont été répétées pendant 40 cycles supplémentaires, tandis qu'à la fin du dernier cycle, la température a été augmentée de 60 à 95 degrés pour produire une courbe de fusion. Les données de la réaction ont été collectées et analysées avec Corbett Research Software. Les valeurs de seuil critique comparatives issues de mesures en quatre exemplaires ont été utilisées pour calculer l'expression génique, avec une normalisation à GAPDH comme contrôle interne. Une analyse de la courbe de fusion a été réalisée pour améliorer la spécificité de la réaction d'amplification.
Histologie
La préparation du tissu rénal s'est déroulée comme décrit précédemment [37]. Les tissus rénaux ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 %, incorporés dans de la paraffine et coupés en sections de 3- µm d'épaisseur. La coloration périodique à l'acide Schif a été réalisée conformément aux instructions du fabricant (Abcam, Cambridge, MA, USA). Pour l'immunohistochimie, des coupes de tissus déparaffinées ont été récupérées par antigène par chauffage à 1{{10}}0 degrés pendant 15 min dans un tampon citrate, pH 6.0 (Sigma- Aldrich). Les coupes ont été incubées toute la nuit à 4 degrés avec des anticorps primaires dilués dans un tampon de blocage (1 % [p/v] d'albumine sérique bovine dissoute dans 0,3 % [v/v] Triton X-100 préparé dans du PBS [0,3 % PBS- T]). Après que les coupes aient été brièvement lavées trois fois avec du PBS-T à 0,3%, elles ont été incubées pendant 1 h à température ambiante avec des anticorps secondaires dilués dans un tampon de blocage. Les scores de lésions tubulaires ont été calculés par la méthode décrite précédemment (39, 40). Le score de lésion tubulaire a été mesuré par examen d'un HPF supérieur ou égal à 10 de la jonction corticomédullaire (grossissement × 200) dans des coupes colorées au PAS (n =5 –7). Les anticorps primaires et secondaires utilisés dans les analyses immunohistochimiques sont répertoriés dans le tableau S3. L'apoptose des cellules épithéliales tubulaires a été détectée par coloration TUNEL avec le kit d'apoptose in situ ApopTag Plus Peroxydase (Sigma-Aldrich), conformément aux instructions du fabricant. Des coupes de tissus de tous les principaux organes ont été recueillies, incluses en paraffine et colorées à l'hématoxyline/éosine (H&E) pour comparer les changements histologiques.
Analyse statistique
Les résultats sont exprimés en erreur type moyenne de la moyenne (SEM). Des comparaisons multiples entre les trois groupes ont été effectuées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) et du test de différence honnêtement significative de Tukey post hoc. Les différences avec des valeurs p inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.
