Inhibition de l'agrégation bêta-amyloïde et du dépôt d'extrait aqueux de Cistanche Tubulosa

1. Introduction

La démence est l’une des maladies chroniques liées au vieillissement les plus courantes. En 2015, le Rapport mondial sur la maladie d'Alzheimer estimait qu'environ 46,8 millions de personnes souffraient de démence, et ce nombre devrait atteindre 74,7 millions en 2030 et 131,5 millions en 2050. La population mondiale atteinte de démence augmentera d'année en année et deviendra incontrôlable à l'avenir. . Les dépenses mondiales de santé pour traiter la démence s'élevaient à près de 604 milliards de dollars américains en 2010 et ce montant devrait atteindre 1 000 milliards en 2030. Les patients atteints de démence courent un plus grand risque de décès accidentel et nécessitent donc davantage de soins médicaux. Il s’agit d’un lourd fardeau pour les soignants familiaux des patients atteints de démence. L’impact de la démence sur les soignants, la famille et la société peut produire un stress physique, psychologique, vital et économique considérable. Il existe deux principales formes de démence, la maladie d'Alzheimer (MA) et la démence vasculaire. La MA est la démence la plus courante et constitue un trouble neurodégénératif irréversible et progressif. La MA était la sixième cause de décès aux États-Unis en 2015.

CISTANCHE TUBULOSA NATUREL POUR LA PRÉVENTION DE L'AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Des études récentes soutiennent que la toxicité neuronale induite par l'agrégation du peptide amyloïde (A) (plaques) et de la protéine tau (enchevêtrements) est étroitement liée à la pathogenèse de la MA. L’accumulation d’A et de protéine tau dans le cerveau peut entraîner des lésions neuronales et une perte de mémoire. Les oligomères A insolubles s'agrègent en plaques extracellulaires et entraîneraient un dysfonctionnement synaptique, une toxicité neuronale et la mort cellulaire. Malheureusement, il n’existe jusqu’à présent aucun traitement efficace pour éliminer A et la protéine tau, inhiber la formation ou l’oligomérisation de A et suspendre ou guérir les lésions neuronales irréversibles. Les agents thérapeutiques actuels, tels que la galantamine et le donépézil, qui sont des inhibiteurs de l'acétylcholinestérase, ne peuvent améliorer que temporairement la perte de mémoire en augmentant le niveau des neurotransmetteurs. En 2012, aucun médicament candidat n’a réussi à réduire l’effet A dans les grandes études cliniques menées auprès de patients atteints de MA. Il est donc urgent de rechercher un nouveau traitement permettant de supprimer la prévalence de la maladie d’Alzheimer. Les ions métalliques ont récemment été considérés comme un facteur clé étroitement lié à l’agrégation de A. Les chélateurs de métaux, considérés comme des composés potentiels de premier plan, offrent une toute nouvelle stratégie pour l'approche anti-MA.

La tige séchée de Cistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, est largement récolté dans le désert de Xhinjang, en Chine. Il s'agit d'une médecine traditionnelle chinoise importante qui appartient à la médecine chinoise tonique répertoriée dans la Pharmacopée chinoise et utilisée depuis des milliers d'années pour le traitement de la faiblesse physique, de l'insuffisance rénale, de l'infertilité, de l'oubli, de l'impuissance et de la constipation sénile.Extrait aqueux de C. tubulosa (CTE)les capsules ont été approuvées comme médicament botanique pour la démence vasculaire en Chine. Selon un essai clinique portant sur 18 patients diagnostiqués avec une MA légère à modérée, les capsules de CTE ont donné aux patients un état de mémoire plus stable que les inhibiteurs de l'acétylcholinestérase. Dans notre étude précédente, le CTE diminuait les dépôts de peptide amyloïde (A) et améliorait la perte de mémoire chez les rats atteints de la maladie d'Alzheimer. Les glycosides phényléthanoïdes, l'échinacoside (1), l'acteoside (2) et l'isoacteoside (3) sont considérés comme les principaux composants du CTE. Le composé 1 a une activité neuroprotectrice contre la toxicité du 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP), 1-méthyl{{13. }}ion phénylpyridinium (MPP+) et 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Notre précédent rapport montrait que 1 supprimait l'oligomérisation et la toxicité de A dans une étude in vitro, inhibait le dépôt de A, améliorait la mémoire altérée et le dysfonctionnement cognitif chez les rats induits par A. Les composés 2 et 3 ont augmenté la dégradation de A et diminué l'oligomérisation de A in vitro. Le composé 3 a diminué le dépôt de A chez les rats induits par A. Sur la base de ces études, C. tubulosa a déjà prouvé qu’elle avait le potentiel de traiter la MA. Le CTE est étroitement lié à l’agrégation et au dépôt d’anti-A. Pour mieux comprendre le mécanisme du CTE, nous devons disposer d’une méthode pratique et efficace pour identifier le composant actif, ainsi que son contenu dans les échantillons de tissus cérébraux. La plupart des études ont été conçues pour la détermination quantitative deéchinacoside, acteoside et isoacteoside dans les herbesou des aliments par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), mais seules deux études concernaient la détermination dans le sérum ou les tissus. Cependant, il n'existe aucun rapport sur l'analyse simultanée de 1 à 3 dans les tissus cérébraux après administration orale de CTE. En outre, des études récentes ne permettent toujours pas de savoir si les composants actifs du CTE ou leurs métabolites ont réussi à traverser la barrière hémato-encéphalique et à agir sur les neurones du cerveau. Par conséquent, cette recherche fournit une méthode avancée et sensible avec des preuves convaincantes qui illustrent clairement le mécanisme sous-jacent du CTE contre l’agrégation et le dépôt de A.

2. Résultats

2.1. Isolement et identification de trois composés majeurs (1–3)

Les tiges séchées de C. tubulosa ont été extraites avec 75 % d'EtOH à température ambiante. L'extrait EtOH condensé à 75 % a été soumis à une chromatographie sur résine et sur colonne C18 pour fournir trois composés majeurs, l'échinacoside (1),acteoside (2) et isoacteoside(3). Leurs structures ont été élucidées par l'analyse de la spectroscopie RMN (résonance magnétique nucléaire) et de l'ESI-MS (masse d'ionisation par électrospray) et par comparaison avec les données de la littérature (Figure 1, Matériaux supplémentaires, Figures S3 à S11).

2.2. Analyse de la teneur en phényléthanoïdes glycosides (1–3) du CTE

La méthode de dosage a été validée pour l’analyse des glycosides phényléthanoïdes. Les composés 1 à 3 (5,0 mg) ont été pesés avec précision et mélangés avec 50 % de méthanol (40 ml). Les mélanges ont été soniqués pendant 5 min. Une solution standard de trois glycosides de phényléthanoïde (1 à 3) a été mélangée à la solution mère standard (100 ug/mL). La solution mère étalon a été utilisée pour préparer cinq concentrations différentes (5, 10, 25, 50 et 100 ug/mL) des solutions indiquées, respectivement, en diluant avec des volumes en série de 50 % de méthanol. Les courbes des glycosides phényléthanoïdes (1 à 3) ont été établies par chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) de 5 à 100 ug/mL et étaient respectivement linéaires (1, r2= 0,9999 ; 2, r{{25} }.9999 ; 3, r2= 0.9998). La précision intra-journalière et inter-journalière [% RSD (écart type relatif) était de 0,1 à 1,8%] et l'exactitude (95,6-104,2%) étaient acceptables par UPLC pour 1-3. UPLC a quantifié les teneurs 1, 2 et 3 du CTE comme étant respectivement de 254, 38 et 41 mg/g (Figure S2).

CISTANCHE TUBULOSA NATUREL POUR LE TRAITEMENT DES PATIENTS AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. Validation UPLC/MS/MS

Les glycosides phényléthanoïdes (1 à 3) ont été mélangés et enrichis avec un homogénat de tissu cérébral de rat et analysés à l'aide d'un spectromètre de masse en tandem par chromatographie liquide Ultra performance (UPLC/MS/MS) avec extraction en phase solide. La limite inférieure de détection (LLOQ) de 1 à 3 était de 0,2 ng/mL. La récupération des glycosides phényléthanoïdes a augmenté avec l'homogénat de tissu cérébral (10 ng/mL) à 91,39 % pour 1, 89,54 % pour 2 et 96,81 % pour 3, respectivement (Figure 2).

2.4. Analyse des tissus cérébraux de rats de type AD

Après 14 jours d'administration orale de CTE (200 mg/kg/jour), les tissus cérébraux de rats de type AD ont été collectés et divisés en deux parties, l'hippocampe et le striatum, et ont tous deux été homogénéisés. Parce que les homogénats d'hippocampe et de striatum de chaque rat étaient trop rares pour être chargés dans une extraction en phase solide et pour éviter des erreurs expérimentales excessives, les homogénats d'hippocampe et de striatum de quatre rats individuels ont été mélangés dans un échantillon analysé pour UPLC/MS/MS en utilisant le solide. méthode d’extraction de phase (Figure 3A, B). Les glycosides phényléthanoïdes (1 à 3) ont été observés dans l'hippocampe (Figure 3A) et le striatum (Figure 3B). Il n’y avait pas de pic significatif dans les tissus cérébraux vierges (Figure 3C). Dans l'hippocampe, la teneur en échinacoside était de 11,97 ± 0,34 ng/mL, la teneur en actéoside était de 1,25 ± 0,16 ng/mL et la teneur en isoacteoside était de 1,38 ± 0,08 ng. /ml. Dans le striatum, la teneur en échinacoside était de 22,60 ± 1,69 ng/mL, la teneur en actéoside était de 2,03 ± 0,61 ng/mL et la teneur en isoacteoside était de 4,90 ± 0,64 ng/mL. Comme le montre la figure 4, le CTE traverserait la barrière hémato-encéphalique selon les quantités détectables significatives de 1 à 3 dans l'hippocampe et le striatum. La teneur en 1 est bien supérieure à celle de 2 et 3 en CTE par analyse UPLC (Figure S2). Par conséquent, il est raisonnable d’observer que 1 est le niveau le plus élevé dans le tissu cérébral après administration orale de CTE.

2.5. L’activité chélatrice des métaux des glycosides phényléthanoïdes (1–3)

Dans la littérature, la détermination des composés exempts et de leur complexe métallique a été réalisée par HPLC. La mesure de l'activité de chélation a été analysée par UPLC dans cette étude. Les solutions à 50 µg/mL de chacun des glycosides phényléthanoïdes (1 à 3) ont été ajoutées à une solution à 10 µg/mL de cuivre (Cu), calcium (Ca), magnésium (Mg), zinc (Zn), fer (Fe ) ou du sérum de rat respectivement. Chaque composé avec chaque solution métallique ou sérum a été analysé par UPLC. Les glycosides phényléthanoïdes (1 à 3) présentaient une activité chélatrice des métaux avec le fer et le sérum (Figure 5, Matériaux supplémentaires, Figure S1).

2.6. Analyse de l'échinacoside (1) dans le sérum de rat in vivo

Pour comprendre la distribution de l'échinacoside dans le sérum de rat, le sérum a été collecté depuis le temps initial jusqu'à 720 minutes après l'administration orale d'échinacoside (1) (100 mg/kg) et analysé par UPLC. La figure 6 montre les profils de concentration en fonction du temps de l'échinacoside dans le sérum de rat.

3. Discussion

La démence, en particulier la MA, est une maladie chronique et vieillissante irréversible qui soulève un nœud gordien de questions. Cette maladie insurmontable entraîne de graves problèmes économiques avec un fardeau financier énorme et croissant. Dans le monde entier, les chercheurs sur la MA ont déployé de nombreux efforts pour étudiernouveaux médicaments anti-MAmais a échoué dans plusieurs grands essais cliniques ciblant A en 2012. À l'exception du ciblage direct de A , l'homéostasie des ions métalliques dans le cerveau est considérée comme la principale raison liée à l'agrégation et au dépôt de A qui conduisent à la formation de MA. Par conséquent, les ions métalliques jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de la MA et l’hypothèse de la chélation des métaux est devenue une direction de recherche importante.

D'après nos études précédentes,Le CTE a montré une activité anti-démence potentielle. Même dans les études cliniques chez l'homme, après 1 an de traitement avec des capsules CTE pour des patients atteints de MA modérée, le score de la sous-échelle cognitive de l'échelle d'évaluation de la maladie d'Alzheimer (ADAS-cog) ne montrerait pas de détérioration significative par rapport à avant le traitement. Le CTE a maintenu le score ADAS-cog des patients atteints de MA stable, mais pas les autres médicaments sur ordonnance. Le seul choix de médicaments sur ordonnance autorisés pourTraitement de la MACe sont les inhibiteurs de l'acétylcholinestérase (AChEI) tels que le donépézil et la galanthamine qui améliorent les symptômes de la MA à court terme, mais une détérioration survient après 1 an de traitement. Sur la base d'études cliniques, le CTE a l'opportunité de constituer un traitement potentiel pour le développement d'agents anti-MA. Sur la base de nos rapports précédents, l'échinacoside (1), l'acteoside (2) et l'isoacteoside (3) protégeraient les neurones des dommages causés par A , diminueraient l'oligomérisation de A in vitro et amélioreraient considérablement le dysfonctionnement cognitif induit par A in vivo. L'étude in vitro a indiqué que les doses actives de 1 à 3 allaient jusqu'à 5{{10}} µg/mL. Cependant, des études antérieures considéraient que la biodisponibilité orale de 1 et 2 était très faible (0,83 % pour 1 et 0,12 % pour 2) chez le rat. Le composé 1 n’a même pas pu être identifié dans le sérum humain après administration orale d’un comprimé d’échinacée. Les études actuelles montrent que 1 à 3 avaient une perméabilité membranaire et une absorption médiocres dans les cellules intestinales et que la plupart d'entre eux seraient métabolisés dans les conduits gastro-intestinaux. La teneur en composé 2 dans le sérum de rat n’était qu’environ 4,5 µg/mL après 15 minutes d’injection intraveineuse avec une dose de 10 mg/kg d’actéoside. Cependant, cette étude montre que 1 à 3 seraient détectés dans l'hippocampe et le striatum des tissus cérébraux de rat après administration orale de CTE (Figures 3 et 4). De plus, la figure 6 a montré que la teneur en composé 1 dans le sérum de rat a augmenté d'environ 5 fois, passant de 15 min à 720 min après l'administration orale du composé 1 (100 mg/kg). Nous avons considéré que les glycosides phényléthanoïdes du CTE traverseraient la barrière hémato-encéphalique et qu'il y aurait une action de chélation entre le CTE et le métal. La chélation est une réaction chimique réversible. Le fer est un élément essentiel du sérum et du cerveau [10,40]. La figure 5 montre que trois glycosides phényléthanoïdes auraient une activité chélatrice des métaux avec le fer et le sérum. Le fer et le sérum modifient la zone de temps de rétention maximale de trois glycosides phényléthanoïdes. La chélation du fer pourrait être la raison cruciale conduisant à une identification erronée de la très faible biodisponibilité des glycosides phényléthanoïdes. Par conséquent, l’activité chélatrice des métaux doit être prise en compte dans l’analyse du sérum sanguin et du cerveau des trois glycosides phényléthanoïdes CTE afin de récupérer la biodisponibilité et la pharmacocinétique réelles. De plus, les résultats ont indiqué que trois glycosides phényléthanoïdes (1 à 3) traverseraient la barrière hémato-encéphalique et arriveraient aux tissus cérébraux par la circulation corporelle. Cette étude a développé une méthode la plus rapide et la plus sensible pour l'analyse 1 à 3 utilisant UPLC/MS/MS et a fourni des preuves solides prouvant que les glycosides phényléthanoïdes (1 à 3) sont les principaux constituants bioactifs du CTE.

CISTANCHE TUBULOSA NATUREL POUR LA PRÉVENTION DE LA MALADIE D'ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. Matériels et méthodes

4.1. Matériel végétal

Des tiges de C. tubulosa ont été collectées en mai 2016 à Hangzhou, en Chine. La plante a été identifiée par les spécimens du Dr Lin HC Voucher (n° 20016CT) qui ont été déposés chez Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Chine.

4.2. Isolement et purification

La tige séchée de C. tubulosa a été broyée en poudre puis extraite cinq fois avec 75 % d'EtOH. Après évaporation du solvant sous pression réduite, l'extrait brut a été soumis à une chromatographie sur colonne de résine macroporeuse AB-8 avec des systèmes de solvants à gradient H2O/EtOH de 20 % d'EtOH jusqu'à 100 % d'EtOH. Selon la chromatographie sur couche mince, quatre fractions (Fr.1 ~ Fr.4) ont été collectées pour une séparation ultérieure. Le P. 2 a été soumis à une chromatographie liquide haute performance (HPLC) préparative sur une colonne COSMOSIL® 5C18-AR-II (diamètre intérieur 250 mm × 20 mm, 5 µm) en utilisant 18 % d'acétonitrile comme système de phase mobile. Le débit était de 15 mL/min. Trois pics d’intérêt majeurs ont été collectés de manière sélective. Les fractions contenant les composés ciblés ont ensuite été condensées à sec et ont produit respectivement 1, 2 et 3.

4.3. Analyse expérimentale

Les spectres RMN 1H et 13C ont été obtenus en utilisant des spectromètres Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, USA) avec du tétraméthylsilane (TMS) comme étalon interne. La HPLC préparative a été réalisée à l'aide d'une colonne en phase inverse (colonne Cosmosil C18-AR-II, 250 mm × 20 mm de diamètre intérieur ; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japon) sur une série Shimadzu LC-6AD. appareil équipé de détecteurs Prominence HPLC UV-Vis (Kyoto, Japon).

Echinacoside (1) : poudre blanche ; ESI-MS m/z : 785 [M-H]- ; RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) : δ 1.07 (1H, d, J=6,2 Hz, Rha-H-6), 2,79 ( 2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha-8), 3,79 (1H, m, H-30 ), 3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J {{4{ {80}}}}.9 Hz, H-10 ), 5.{{100}}0 (1H, t, J=9.6 Hz, H-40 ), 5,17 (1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-800 ), 6,58 (1H, dd, J=8.1,2,0 Hz, H-6), 6,67 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,77 (1H, d, J=8,2 Hz, H-500 ), 6,94 (1H, dd, J=8.3, 2,0 Hz, H-600 ), 7,05 (1H, d, J=2.0 Hz, H-200 ), δ 7,59 (1H, d, J=15,9 Hz, H-700 ); 13C-RMN (CD3OD, 125 MHz) : δ 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 125}} ), 70,5 (C-40 ), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50 ), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C-20 ), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30 ) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10 ), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200 ), 115,3 (C{{ 189}} ), 116,3 (C-500 ), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 204}} ), 127,6 (C-100 ), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 219}} ), 148,2 (C-700 ), 149,8 (C-300 ), 168,5 (C-900 ) (Figures S3 à S5).

Actéoside (2) : poudre blanche ; ESI-MS m/z : 623 [M-H]- ; RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz) : δ 0,94 (3H, d, J =5,9 Hz, H-6000 ), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H-100 ), 4,70 (1H, t , J=9.{{160}} Hz, H-400 ), 5.{{209}}1 (1H, s, H{{ 31}} ), 6,18 (1H, d, J=15,9 Hz, H-80 ), 6,48 (1H, dd, J=7,9, 1,4 Hz, H{{ 45}}), 6,62 (1H, d, J=7,1 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=2,0 Hz, H{{57} }), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz, H-50 ), 6,97 (1H, d, J=8,1 Hz, H-60 ) , 7,01 (1H, s, H-20 ), 7,44 (1H, d, J=15,8 Hz, H-70 ); RMN 13C : (DMSO-d6, 125 MHz) : δ 18,2 (C-6000 ), 35,1 (C-7), 60,8 (C-600 ), 68,8 (C{{95} } ), 69,2 (C-400 ), 70,3 (C-3000 ), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000 ), 70,6 (C{{110} } ), 71,7 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 79,2 (C-300 ), 101,3 (C-1000 ), 102,3 (C{{125} } ), 113,6 (C-80 ), 114,7 (C-20 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C{{140} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,6 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{155} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,7 (C{{170} } ) (Figures S6 à S8). Isoacteoside (3) : poudre blanche ; ESI-MS m/z : 623 [M-H]- ; RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz) : δ 1,07 (3H, d, J=6,1 Hz, H-6000), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H-100 ), 5,10 (1H, s, H-1000 ), 6,27 (1H, d, J=15 0,9 Hz, H-80 ), 6,45 (1H, dd, J=8.0, 1,8 Hz, H-6), 6,58 (1H, d, J=8 0,8 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H-50 ), 6,94 (1H, d, J=8,2 Hz, H-60 ), 7,04 (1H, s, H-20 ), 7,46 ( 1H, d, J=15,8 Hz, H-70 ); RMN 13C (DMSO-d6, 125 MHz) : δ 17,9 (C-6000 ), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600 ), 68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400 ), 70,6 (C-3000 ), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000 ), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 80,9 (C-300 ), 100,7 (C-1000 ), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20 ), 114,9 (C-80 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C-2 ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,5 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,6 (C-90 ) (Figures S9 à S11).

4.4. Préparation de l'extrait aqueux de C. Tubulosa (CTE)

La poudre de tige de C. tubulosa a été extraite deux fois par reflux avec de l'eau pendant 1,5 h et la solution d'extrait a été filtrée. L'extrait aqueux filtré (CTE) a été conservé à 4 ◦C avant utilisation.

4.5. Modèle animal et calendrier expérimental

Le modèle de rat de type AD et le calendrier expérimental utilisés dans cette étude étaient tels que prescrits dans notre étude précédente (19). Après avoir perfusé A 1–42 (300 pmol/jour) dans le ventricule cérébral pendant au moins deux semaines ou plus, les rats de type AD ont reçu du CTE (200 mg/mL) par voie orale le lendemain. Après 14 jours d'administration, des rats ont été sacrifiés pour collecter les tissus cérébraux. Pour éviter des erreurs expérimentales excessives, des échantillons de quatre rats individuels ont été combinés en un seul échantillon. Il y avait trois échantillons pour chaque groupe.

4.6. Produits chimiques et réactifs

Le méthanol (qualité HPLC) a été acheté auprès de Merck (Darmstadt, Allemagne). L'acide formique (98% pour analyse, ACS) a été acheté chez Panreac (Barcelone, Espagne). L'acétonitrile (qualité HPLC) a été acheté auprès de JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). L'eau pure a été préparée à l'aide du système ELGA (Woodridge, Royaume-Uni). L'hespéridine a été achetée auprès de Chromadex et utilisée comme étalon interne (IS) pour l'analyse UPLC.

4.7. Appareil UPLC/MS/MS

Le système de chromatographie liquide ultra-performance (UPLC)/MS/MS Waters Acquity TQD (Milford, MA, USA) a été utilisé pour l'analyse UPLC/MS/MS. Les expériences chromatographiques ont été réalisées sur une colonne Acquity UPLC BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm, Waters) sous élution par gradient à un débit de 0,4 ml/min. La phase mobile était composée d’acide formique-eau (1 : 1000, v/v) (A) et d’acide formique-acétonitrile (1 : 1000, v/v) (B). Le programme horaire était le suivant : 0 à 5 min, A à B (92 : 8, v/v) remplacé par A B (62 : 38, v/v) ; 5 à 7 minutes, AB (62:38, v/v) ; 7-7,1 min, AB (62 :38, v/v) remplacé par A–B (92 : 8, v/v) ; 7,1 à 9 minutes, (92 : 8, v/v). Le volume d’injection était de 5 µL dans le système UPLC/MS/MS avec une source d’ions à ionisation par électrospray négatif (ESI). Les chromatogrammes d'ions totaux (TIC) pour 1 à 3 ont été réalisés en utilisant le mode de surveillance des réactions multiples (MRM). Les paramètres de masse ont été optimisés pour obtenir les signaux les plus clairs et de haute intensité. Le meilleur choix de paramètres a été décrit comme étant une tension capillaire de 3 000 V, une tension de cône de 20 V, une température de source de 125 ◦C, une température de désolvatation de 400 ◦C, un débit de gaz de cône de 50 L/h, un débit de gaz de désolvatation de 900 L/h et une collision de 38 eV. énergie. Les données ont été traitées par le logiciel MassLynx 4.1 (Milford, MA, USA).

4.8. La préparation des échantillons

Le tissu cérébral de rat a utilisé 50 % de méthanol pour l’homogénéisation (1 g de tissu pour 5 ml de méthanol). L'homogénat a été centrifugé à 10,000 tr/min à 4 ◦C pendant 10 min. Le surnageant (50 µL) avec 10 µL IS (100 µg/mL) a ajouté de l’eau pure à 1 ml. Le mélange a été soigneusement chargé sur la cartouche Oasis HLB (équilibrée hydrophile-lipophile) (Waters, Milford, MA, USA), qui avait déjà été éluée avec 1 ml de méthanol puis équilibrée avec 1 ml d'eau sous vide. Après avoir utilisé 1 ml de méthanol à 10 % pour laver la cartouche, 1 ml de méthanol a été utilisé pour éluer afin d'obtenir l'échantillon analysé qui a été transféré dans un autre tube Eppendorf de 1,5 ml avec 10 µL de solution d'acide ascorbique à 1 % et séché par évaporation. Enfin, le résidu de l’échantillon analysé a été dissous dans 200 µL de méthanol à 50 % pour analyse.

4.9. Préparation de la courbe standard d'étalonnage

Les composés 1 à 3 ont été utilisés pour préparer des étalons d'étalonnage ajoutés respectivement à l'homogénat de tissu cérébral et à l'hespéridine comme étalon interne pour obtenir les concentrations finales des étalons d'étalonnage qui étaient de 1.0, 5.0, 1{{7. }}.0, 50,0 et 100,0 ng/mL.

4.10. Validation

La courbe étalon d'étalonnage a été obtenue à l'aide du test de linéarité en utilisant cinq concentrations différentes de 1 à 3, dans les plages 1.0, 5.0, 10.0 , 50.0 et 100,0 ng/mL, respectivement, et a été considéré comme linéaire avec un coefficient de détermination supérieur à 0,99 (R au carré). La limite inférieure de détection (LLOQ), définie comme ± 20 % de la concentration d'un échantillon testé, produit un pic de signal plutôt qu'un bruit. La crédibilité et l'exactitude de la méthode d'analyse ont été évaluées à l'aide d'un test de récupération à 10 ng/mL de 1 à 3.

4.11. Test d'activité chélatrice des métaux

L'UPLC a été utilisée pour analyser l'effet chélateur des métaux en utilisant la solution à 50 µg/mL de glycosides phényléthanoïdes CTE 1 à 3 contenant 10 µg/mL d'une solution métallique de cuivre, calcium, magnésium, zinc, fer ou sérum de rat. Chaque composé avec chaque solution métallique ou sérum a été analysé par UPLC. L'effet chélateur des métaux modifierait le temps de rétention de 1 à 3 en chromatographie liquide. Le pourcentage d'effet chélateur des métaux a été calculé comme ci-dessous et les données représentaient la moyenne ± écart-type (n=3).

5. Conclusions

Cette étude a démontré que 1 à 3 sont les composants actifs du CTE pour l'activité anti-MA. La chélation du fer est devenue le nouveau concept pour concevoir une nouvelle génération de médicaments pour le traitement de la MA.Le CTE est une médecine chinoise botanique anti-MA potentielleciblant l’agrégation et le dépôt d’A induits par la chélation du fer. De plus, nous avons en outre prouvé que 1 à 3 atteindraient le cerveau par le sang, la barrière hémato-encéphalique (BBB). La confirmation des composants actifs et du mécanisme sous-jacent du CTE facilitera grandement le contrôle de la qualité et la biodisponibilité des études de produits à l'avenir. Dans le même temps, la méthode d’analyse avancée et efficace présentée sera utile pour déterminer 1 à 3 dans les plantes, les aliments, le sang et les tissus cérébraux pour la recherche sur les empreintes chimiques et la pharmacocinétique.

CISTANCHE TUBULOSA NATUREL POUR TRAITER LA MALADIE D'ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%