Les interactions entre les antioxydants polyphénoliques quercétine et naringénine dictent le comportement chimique et biologique distinctif lié à l'oxydo-réduction de leurs mélanges Partie 1

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Les recherches menées au cours des deux dernières décennies sur les bases moléculaires des maladies chroniques non infectieuses telles queathérosclérose, hypertension, le diabète et surtout le cancer qui suscitent un intérêt majeur a révélé que toutes ces maladies partagent un facteur de risque commun, qui est la perturbation de l'homéostasie redox souvent appelée stress oxydatif12. Il survient à la suite d'un niveau endogène accru d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) en raison de l'échec de la barrière antioxydante du corps et on pense qu'il favorise le développement de toutes ces maladies.3. Ainsi, l'hypothèse a suivi que les facteurs exogènes capables de neutraliser les ROS, par exemple les antioxydants végétaux, pourraient contrecarrer ou ralentir le développement des maladies chroniques et soutenir leur traitement. La vérification de cette hypothèse a initié des études détaillées sur les antioxydants présents dans les denrées alimentaires qui pourraient présenter un potentiel préventif4. En effet, plusieurs études résumées dans la méta-analyse comparant la consommation alimentaire et les maladies chroniques liées à l'alimentation ont révélé une diminution du risque dans le cas de régimes riches en fruits et légumes, en céréales complètes ainsi qu'en boissons telles que le vin, le café et le thé, d'où des produits riches en composés phytochimiques antioxydants. Sans surprise, il a été présumé que ces substances une fois isolées de leurs sources naturelles, purifiées, puis consommées sous forme de compléments alimentaires contenant des doses plus élevées que celles réalisables dans l'alimentation pourraient devenir de puissants agents chimiopréventifs. Cette hypothèse a été confirmée par un grand nombre de preuves provenant d'études exploitant divers modèles expérimentaux in vitro et in vivo de maladies chroniques, y compris le cancer. . Par exemple, deux méta-analyses d'enquêtes de cohorte humaine et de cas-témoins avec de la vitamine E8 ou des préparations de micronutriments" ont conclu que de faibles niveaux d'antioxydants n'avaient aucun effet, tandis que des doses élevées pourraient augmenter à la fois l'incidence et la mortalité du cancer et des maladies cardiovasculaires. Cependant, lorsque étaient à base de vraies plantes, comme un mélange spécifique d'aliments concentrés riches en polyphénols (grenade, thé vert, brocoli et curcuma), un effet protecteur significatif chez les hommes atteints d'un cancer de la prostate a été observé1.

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Les effets prometteurs des aliments entiers contrairement aux composés isolés sont conformes au concept de synergie alimentaire, qui est défini comme un additif ou plus que l'influence additive de la combinaison de différents ingrédients alimentaires sur la santé humaine. Notre étude antérieure a vérifié ce concept en comparant les bioactivités de vrais aliments avec leur principal antioxydant isolé. Cela a montré que les effets biologiques des extraits de baies diffèrent considérablement de ceux présentés par l'anthocyanine cyanidine-3-O-glucoside. Certains autres rapports ont également indiqué l'importance des interactions entre différents composés bioactifs et les composants de la matrice alimentaire qui se sont avérés être des facteurs coopérants, qui déterminent la bioactivité finale des aliments3-1. Nos récentes enquêtes mécanistes impliquant la reconstitution par étapes de la composition du cacao en bioactif ont également soutenu l'idée de synergie alimentaire, mais ont démontré que les effets biologiques d'échantillons aux compositions complexes ne sont pas simplement une combinaison des activités affichées par les composants individuels'3. Toutes ces observations suggèrent que lorsque l'on considère les bioactivités liées à l'oxydoréduction des antioxydants isolés par rapport à leurs mélanges, les interactions entre les composants doivent être prises en compte. La complexité croissante d'un mélange dephytochimiquessemblait créer un nouveausubstance redox-activeplutôt que d'enrichir le mélange avec de nouvelles activités caractéristiques du composé ajouté, ce qui est induit par le concept de synergie alimentaire.

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Dans la recherche actuelle, nous avons simplifié le système expérimental en le limitant à seulement deux structures centrales afin d'approfondir les détails de leurs interactions dans le contexte de la structure chimique, de la réactivité redox et des bioactivités liées au redox, afin de permettre une meilleure compréhension et prédiction du potentiel chimiopréventif des antioxydants. "Les composés phytochimiques utilisés à cette fin étaient des antioxydants courants présents dans diverses herbes, légumes et fruits, en particulier dans les agrumes, à savoir : les flavonols représentés par la quercétine (O) et son côté rhamno-rutine ( R) et des flavanones par la naringénine (N-) et sesnéohespéridosidela naringine (N plus ) ainsi que deux mélanges de ces composés (QN-, RN plus ). La composition chimique de l'étude comprenait des déterminations donnant un aperçu de la thermodynamique et de la cinétique des processus oxydatifs, du test ieDPPH, du titrage potentiométrique et de la voltamétrie différentielle à impulsions (DPV). Les tests biologiques ont examiné l'impact des échantillons étudiés sur la croissance cellulaire (test MTT), l'activité antioxydante cellulaire (test CAA), la génotoxicité (test des comètes), le niveau global de méthylation de l'ADN (version épigénétique du test des comètes) et l'expression de 84 redox -gènes apparentés (technologies basées sur des puces PCR en temps réel). Les expériences biologiques ont été réalisées en utilisant la lignée cellulaire HT29 d'adénocarcinome du côlon recommandée pour les études nutritionnelles comme modèle de l'épithélium intestinal qui peut être exposé à des concentrations relativement élevées d'antioxydants ingérés.

Résultats

Nos enquêtes antérieures comparant les propriétés liées à l'oxydoréduction de la poudre de cacao et de ses principaux constituants ont souligné l'importance des interactions entre les composants polyphénoliques du mélange sur l'activité antioxydante globale. Dans la recherche actuelle, nous avons simplifié le système expérimental pour examiner ces interactions plus en détail pour une paire de flavonoïdes qui sont des composants alimentaires courants. Deux flavonoïdes ont été choisis, à la fois sous forme d'aglycones et de glycosides. Les flavonols étaient représentés par la quercétine (Q) et sesrhamnoside-rutine(R) etflavanonespar la naringénine (N-) et sa naringine néohespéridoside (N plus ). Ces polyphénols diffèrent par le nombre et l'emplacement des groupes hydroxyle redox-actifs ainsi que par la capacité à former des liaisons H intramoléculaires, c'est-à-dire trois caractéristiques structurelles qui peuvent interférer avec la réduction des propriétés des composés antioxydants. Comme le montre la figure 1, les radicaux semiquinone intermédiaires formés lors de la première étape d'oxydation du groupement catéchol dans le cycle B

de Q ou R peut être stabilisé de deux manièresi8,19. La première manière est la conjugaison à la fois de la structure centrale sur les anneaux B et C et de la formation de la deuxième liaison H avec un groupe OH vicinal ou des substituants dans l'anneau C, en particulier dans R. la présence de groupes hydroxyle dans le substituant sucre en position 3 du cycle C peut encore améliorer cet effet de stabilisation en raison de plus de possibilités de formation de liaisons H (directement ou via la molécule d'eau), en revanche, le radical phénoxyle intermédiaire dans N plus ou N- n'est stabilisé ni par des doubles liaisons conjuguées impliquant également le cycle Liaison C ni H avec les substituants voisins. De plus, dans N plus, le fragment sucre est attaché au cycle A et est donc trop éloigné pour former une liaison H avec le radical du cycle B. On peut s'attendre à ce que ces caractéristiques structurelles influencent l'activité redox des flavonoïdes étudiés.

Activité antioxydante par des tests chimiques.

La détermination des propriétés réductrices des polyphénols étudiés et de leurs mélanges a été réalisée par deux essais chimiques à 37 degrés C pour correspondre aux conditions cellulaires des processus redox. La première méthode était le test DPPH spectrophotométrique par lots couramment utilisé; les résultats pour les flavonoïdes individuels et leurs mélanges sont présentés sur la figure 2A. Elles sont exprimées en valeurs de stoechiométrie n où le nombre 10 désigne la durée de la réaction - 10 min. En introduisant le paramètre temps dans les mesures, un aspect cinétique a été intégré dans l'évaluation de l'activité antioxydante comme cela a été décrit précédemment13. actifs que les flavanones. O était le composé le plus efficace pour piéger le radical DPPH et était suivi de R. Malgré une réactivité négligeable envers le DPPH, les deux flavanones, y compris N qui en soi ne présentaient aucune propriété redox dans la période de 10 minutes de la réaction, augmentaient significativement l'activité antioxydante totale du mélanges, dans le cas des aglycones ON- et des glycosides RN plus .

La deuxième méthode impliquait un titrage potentiométrique (PT) qui permet de mesurer le potentiel de réduction standard (E), et donc d'évaluer la capacité thermodynamique des composés purs à gagner des électrons. Les valeurs déterminées de ont confirmé que Q et R sont des composés réducteurs forts (Fig. 2B). Cependant, dans PT, R acceptait les électrons donneurs plus volontiers que Q. La détermination de E pour N- et N plus n'était pas possible en raison du transfert d'électrons très lent pendant le processus d'oxydation (plus lent pour N plus ). PT mesure la différence de potentiel entre l'électrode de référence et l'électrode de mesure après avoir ajouté chaque portion du titrant. Le potentiel stable signifie que le quotient de réaction (Q) entre le réactif et l'analyte est stable (constante Q=). Si le taux de transfert de charge lors d'une réaction est faible (faibles courants en voltamétrie), alors il faut beaucoup de temps pour stabiliser le Q en PT. Par conséquent, pour des réactions très lentes, la courbe de titrage potentiométrique est difficile à obtenir et donc, la valeur trouvée de E" est moins fiable.

Activité antioxydante par voltampérométrie pulsée différentielle,

Les tests chimiques utilisés suggèrent que l'élucidation de l'action antioxydante des polyphénols doit tenir compte des aspects cinétiques, où la stabilité des radicaux intermédiaires pourrait jouer un rôle. Comme illustré sur la figure 1, les radicaux semiquinone formés lors de la première étape de l'oxydation des flavanols sont bien mieux stabilisés que les radicaux phénoxyle résultant de l'oxydation des flavanones. Cette relation est illustrée sur la figure 1 et peut affecter le taux de processus redox. Par conséquent, les propriétés de réduction-oxydation des antioxydants purs étudiés et de leurs mélanges ont été analysées plus en détail à l'aide de la voltamétrie différentielle à impulsions (DPV). Comme cette technique permet de surveiller à la fois les aspects thermodynamiques et cinétiques des réactions d'oxydation, les deux sont finalement combinés dans un paramètre appelé pouvoir antioxydant (AOP)15.

Les observations faites avec les mesures DPV (Fig.2B-F) contredisent celles acquises avec le test DPPH (Fig.2A). De manière surprenante, DPV a révélé que Q décrit dans la littérature comme un excellent réducteur, en ne considérant que les aspects thermodynamiques (potentiel de pic anodique, E.), s'est avéré l'antioxydant le plus faible (Fig.2B, C). Thermodynamiquement, R était un antioxydant légèrement plus fort. Fait intéressant, N- et N plus sont considérés dans la littérature comme des antioxydants faibles, présentant thermodynamiquement les valeurs les plus élevées de E, ce qui signifie qu'ils étaient des agents réducteurs très puissants. Pour les deux classes de flavonoïdes, la fraction glycoside a augmenté l'activité antioxydante des aglycones. Cependant, les paramètres liés à la cinétique (Fig.2E, F), c'est-à-dire le courant anodique (I,.) et la densité de charge (Q), ont révélé que l'oxydation de N plus est le processus le plus lent par rapport à l'oxydation de Q et R. De même , le courant anodique (I) était plus faible pour N que pour Q et R, mais le transfert de charge pour ce composé a atteint la valeur la plus élevée.

Dans le cas des mélanges, deux pics anodiques (1er et 2ème) sur les courbes voltamétriques ont été détectés comme on pouvait s'y attendre pour le mélange à deux composants. Les valeurs déterminées des potentiels de pic anodiques (E.) ont indiqué que le 1er pic observé reflète l'oxydation des flavonols, tandis que le pic 2"d l'oxydation des flavanones (Matériel supplémentaire-Fig. S1). Dans la plupart des cas, la présence de l'autre composant dans un mélange influençait la thermodynamique et/ou la cinétique du processus redox par rapport à l'oxydation des composés purs Par exemple, pour QN-, la valeur de E., pour le 1er pic d'oxydation était égale au potentiel de pic anodique de Q Cependant, le pic anodique de 2 "correspondant à la N-oxydation et le potentiel de cette transition était supérieur au potentiel anodique du N- pur (Fig.2C). La situation inverse a été observée pour la cinétique de cette réaction. Le pic anodique I et Q du 1s de QN étaient proches des paramètres cinétiques de l'oxydation des composants purs (Fig. 2E, F), tandis que la charge échangée au cours de l'étape 2n de l'oxydation ON était bien inférieure à celle de la N-oxydation (Fig.2F). Ces effets thermodynamiques et cinétiques combinés ont entraîné l'amélioration de l'AOP (Fig. 2D) de ce mélange, ce qui est en accord avec les résultats du test DPPH.

Évaluation de la cytotoxicité.

L'impact des aglycones flavonoïdes étudiés (Q, N-), des glycosides (R, N plus) et de leurs mélanges (QN-, RN plus) sur la croissance des cellules intestinales a été évalué par le test MTT. La lignée cellulaire humaine d'adénocarcinome du côlon HT29 a été choisie comme modèle d'épithélium du tube digestif, c'est-à-dire le tissu en contact direct avec les ingrédients alimentaires ingérés tels que les polyphénols. Les cellules ont été traitées avec des flavonoïdes individuels et leurs mélanges à des concentrations physiologiques potentiellement présentes dans le sang (0.01-1 uM)22-2 ou à des concentrations accessibles dans le tube digestif (10-100 uM) après l'ingestion d'aliments25-27. Les courbes dose-réponse pour les traitements de 6, 24 et 72 h sont présentées sur la Fig.3.

Les composés individuels n'ont pas influencé de manière significative la croissance cellulaire à aucune des concentrations étudiées, ni pour les traitements courts ni prolongés. L'exception était la concentration la plus élevée de N-qui après 72 h inhibait la croissance cellulaire jusqu'à 75 % par rapport au témoin. En revanche, les mélanges étudiés (QN-, RN plus) ont stimulé de manière significative la croissance cellulaire d'une manière dépendante de la concentration pour tous les temps d'exposition testés. Cet effet a été observé à de faibles concentrations (0.01-1 uM) étant accessible dans la circulation sanguine et était encore plus puissant à des concentrations plus élevées (10-100 uM) auxquelles les cellules épithéliales du tube digestif peuvent être exposés. Seulement dans le cas de la concentration la plus élevée de QN-, après 72 h de traitement, la stimulation a cessé, probablement en raison des effets inhibiteurs observés dans de telles conditions pour N-. Activité antioxydante cellulaire. L'efficacité des flavonoïdes purifiés et de leurs mélanges pour soutenir la barrière antioxydante endogène des cellules HT29 a été vérifiée à l'aide du test CAA. Cette méthode repose sur la capacité d'un échantillon contenant des composés redox-actifs à inhiber ou favoriser l'oxydation de la sonde absorbée. par les cellules à sa forme fluorescente. L'atténuation de l'oxydation de la sonde, observée comme l'extinction de la fluorescence, est une mesure de la capacité réductrice des antioxydants dans les cellules (valeurs CAA positives), tandis que l'augmentation de l'oxydation de la sonde dénote leur activité pro-oxydante (valeurs CAA négatives)28 . Les déterminations ont été effectuées pour les aglycones et les glycosides à des concentrations reflétant à la fois les expositions intestinales physiologiques (endogènes) et d'origine alimentaire (exogènes). L'incubation avec les flavonoïdes étudiés a été réalisée pendant une durée standard recommandée de 1h18 pour les aglycones et les glycosides. Les traitements prolongés (3 et 6 h) visant à suivre la cinétique de réponse redox dans le modèle cellulaire appliqué n'ont été utilisés que dans le cas des aglycones, en raison de leur impact plus important sur l'activité antioxydante cellulaire.

Les flavanones et les flavonols étudiés différaient par leur impact sur le statut redox des cellules HT29. Dans le cas d'aglycones individuels, les réponses dépendantes de la concentration définies ont été observées après 1 h d'exposition. Cependant, l'activité antioxydante du flavonol-Q a augmenté avec la concentration appliquée, tandis que dans le cas de la flavanone-N-, l'amélioration progressive de l'effet pro-oxydant a été observée (Fig. 4A). La dépendance à la dose des glycosides individuels était moins évidente; seul R à sa concentration la plus élevée a augmenté de manière convaincante l'activité antioxydante cellulaire (Fig. 4A). Fait intéressant, les deux mélanges ont affiché une activité antioxydante accrue, apparemment non influencée par l'effet pro-oxydant observé pour les composés individuels.

La figure 4B présente la cinétique des modifications des valeurs de CAA déterminées après 1, 3 et 6 h de traitement des cellules HT29 avec des aglycones. Pour la concentration la plus faible (1 μM), correspondant aux expositions physiologiques, la dépendance temporelle n'a été observée ni pour les aglycones individuels ni pour leur mélange. Cependant, les influences d'une concentration plus élevée sur les valeurs de CAA étaient clairement dépendantes du temps. Les expositions prolongées ont diminué à la fois l'effet pro-oxydant du N- et l'activité antioxydante du Q et du QN-.

Les aglycones étudiés ont présenté une activité nutrigénomique différente, modifiée en outre par la concentration appliquée aux cellules.

La flavanone N-at l μM a significativement diminué l'expression de CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Cette flavanone appliquée aux cellules HT29 à 10 uM a influencé l'expression de 5 gènes, également régulés à la baisse par sa dose plus faible, à savoir : CCL5, CYGB.MT3(p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

dismutation des radicaux superoxydes en peroxyde d'hydrogène et en oxygène6. La légère augmentation de l'expression causée par N-at 10uM n'a été observée que pour le gène VIMP (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Cet article est extrait de www.nature.com/scientificreports