Les interactions entre les antioxydants polyphénoliques quercétine et naringénine dictent le comportement chimique et biologique distinctif lié à l'oxydoréduction de leurs mélanges Partie 3

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Activité antioxydante par test DPPH.

La détermination de l'activité antioxydante des antioxydants étudiés et de leurs mélanges a été réalisée parspectrophotométriquedosage employant le radical DPPH comme décrit précédemment 13,55. Tout d'abord, la solution mère de radical DPPH a été diluée avec du méthanol jusqu'à ce que l'absorbance atteigne 0.9±0.05 à 515 nm. Deuxièmement, les antioxydants et leurs mélanges ont été dilués de manière appropriée avec de l'éthanol à 70 % pour obtenir des concentrations comprises dans la plage linéaire du testi355. Ensuite, la solution DPPH (1 mL) a été mélangée avec les échantillons dilués (30 μL) et l'absorbance a été mesurée à 515 nm après 10 min à 37 °C. Toutes les réactions ont été effectuées dans des plaques à puits 48-. Les mesures d'absorbance ont été réalisées à l'aide d'un spectrophotomètre TECAN Infinite M200 (Tecan Group Ltd., Suisse). L'activité antioxydante de l'échantillon a été recalculée au coefficient de stoechiométrie ng comme décrit précédemment, avec des modifications5. Brièvement, le nombre de radicaux piégés par les échantillons testés a été calculé sur la base de la loi de Beer-Lambert et du coefficient d'extinction molaire du DPPH suite aux mesures effectuées après 10 min de réaction entre la solution d'antioxydant(s) et le radical55. La valeur de n est calculée comme une tangente de la relation linéaire entre le nombre de moles de DPPH récupérées par 1 mL deantioxydant(s)solutions dans une plage de concentration, où la solution "mère" a la concentration "100 %" et les autres concentrations sont une fraction de 100 % telle que définie par les facteurs de dilution.

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Activité antioxydante par titrage potentiométrique et voltamétrie pulsée différentielle.

Les potentiels de réduction standard (E) pour Q et R ont été mesurés par titrage potentiométrique (PT) comme décrit ailleurs5. En bref, les composés étudiés et le titrant (K, [Fe (CN)]) ont été dissous dans du PBS. La concentration des composés purifiés était de 0,3 mg/mL, les mélanges contenaient 0,3 mg/mL de chaque composé. Les mesures ont été effectuées à l'aide d'un équipement de micro-oxydo-réduction JENCO 6230 N ORP-146C (USA) à l'aide d'une électrode de référence AglAgCl (RE) et d'une électrode de mesure en platine. Les PT ont été effectués à 37 ± 0 0,01 degré, principalement maintenus par Ultra Thermostat (PolvScience, États-Unis). Le volume égal de titrant a été ajouté à l'analyte et le potentiel stable a été lu. En conséquence, les courbes de titrage, E=f(V..), ont été analysées à l'aide du logiciel SigmaPlot Version 13.0 (Systat Software Inc., Royaume-Uni) en ajustant les paramètres sigmoïdaux5-mathématiques modèle aux données expérimentales35. Le potentiel au point d'équivalence (EP vs. RE) a été lu directement à partir de ce modèle basé sur le paramètre a. Il est égal au volume de titrant ajouté au point d'inflexion. Enfin, les valeurs de EP versus SHE (potentiel de réduction standard, EO) ont été calculées. Le terme de correction du potentiel du RE(c) a été établi par titrage des couples redox, FeCl.6H,O, et Na,S,O3.5H,O, caractérisés par des potentiels de réduction standards connus.

À son tour, le pouvoir antioxydant (AOP) des composés étudiés et de leurs mélanges a été mesuré par voltamétrie différentielle à impulsions (DPV) comme indiqué précédemment avec des modifications. En bref, les mesures ont été effectuées à l'aide du potentiostat Gamry Reference 60{{10}} (Gamry Instruments, USA) contenant un système à trois électrodes. Une électrode de carbone vitreux (GC, 1,6 mm de diamètre), un fil de platine et une électrode AgAgCl (Hydromet SC, Pologne) ont été appliqués comme électrode de travail (WE), auxiliaire (AE) et référence (RE), respectivement13. Avant les expériences, la surface du WE a été polie à l'aide d'une suspension d'alumine （0.0Particules de 5 μm, Buehler, États-Unis） sur des tampons en micro-tissu (MF-1040, BASi, États-Unis) et puis nettoyé avec de l'eau distillée et du méthanol. Les composés étudiés ont été dilués dans du DMSO et du tampon phosphate de sodium (pH=7.4±0.1), de sorte que la concentration finale de tampon phosphate était {{30}}.1 M dans l'échantillon. Le tampon a servi d'électrolyte de support. La concentration des composés purifiés était de 3 mM. Les mélanges contenaient 3 mM de chaque composé. Afin d'éliminer l'oxygène électrochimiquement réactif, les solutions étudiées ont été désoxydées par percolation d'argon avant les mesures. Voltammogrammes DPV pour N-.N plus et mélanges : ON- et RN plus ont été enregistrés dans la plage-0.2 à plus 1,3 V, tandis que pour Q et R dans la plage-0.2 à plus 0,6 V par rapport à RE. Le taux de balayage potentiel de 0,1 V.s', la hauteur d'impulsion de 0,05 V et une durée d'impulsion de 0,1 s à 25 ± 0,01 degré ont été définis.

Les voltammogrammes DPV ont été analysés par le logiciel SigmaPlot Version 13.0 (Systat Software Inc., Royaume-Uni). Les valeurs AOP ont été calculées en deux étapes. Les calculs ont pris en compte non seulement le potentiel et le courant de crête anodique (E,; I,), mais également le potentiel défini et le courant mesuré à chaque point de la courbe voltamétrique. Elle a permis d'obtenir des valeurs plus précises que celles rapportées dans nos précédents travaux3. Tout d'abord, le paramètre d'énergie antioxydante (AOE) a été calculé selon l'Eq. 1:

où AwE est la surface du WE (égale à {{0}}.162±0.004 cm'dans notre étude), E est un potentiel de consigne versus RE [V], est un facteur de correction tenant compte de la présence de la jonction liquide entre le WE et le RE (ici 0,103 V), I est le courant mesuré par rapport au courant de fond [A], c'est le temps d'échantillonnage potentiel [dt=0 0,5 s].

Deuxièmement, AOP exprimé en unité W cm² a été calculé sur la base de l'Eq.2∶

où tt ; - est la différence entre l'instant du début du pic d'oxydation (t) et sa fin (t).

Afin de déterminer Awp, une voltamétrie cyclique pour une solution 1.10-3MK,[Fe(CN).] dans 0.1 M KCl a été réalisée. Cette valeur a été calculée sur la base de l'équation de Randles-Sevcik82 à partir de la pente du courant de crête anodique en fonction de la racine carrée de la vitesse de balayage, I, =f(pi/2). Celle-ci a été mesurée de la même manière que dans le titrage potentiométrique. De plus, dans le présent travail, le paramètre thermodynamique du processus d'oxydation était le potentiel de pic anodique corrigé par la jonction liquide entre WE et RE (E.,=E.. plus e), tandis que les paramètres cinétiques comprenaient la charge transférée ( Q) et courant anodique (I,).

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Culture de cellules. Dans l'étude présentée, la lignée cellulaire HT29 (côlon humainadénocarcinome) de l'ATCC a été utilisé comme modèle d'intestin humain, Les cellules ont été maintenues dans du milieu de McCoy additionné deantibiotiques(streptomycines 100 U/mL et pénicilline 100 g/L) et sérum bovin fœtal (100 mL/L)13. La lignée cellulaire HT29 a été maintenue à 37°C sous 5 % de CO, l'atmosphère d'un incubateur cellulaire (Heal Force)3. La lignée cellulaire a été employée entre les passages 6 et 11. Les cellules cultivées ont été testées pour la contamination par les mycoplasmes à l'aide du kit universel de détection des mycoplasmes de l'ATCC (États-Unis).

Évaluation de la cytotoxicité. Pour déterminer l'impact de la purificationantioxydants(Q, N plus, R, N-) et leurs mélanges (QN-, RN plus) sur la croissance des cellules HT29, MTTtest a été appliqué comme décrit précédemment3,5. En bref, les cellules à croissance exponentielle ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire 96-puits (5 × 10 cellules par puits dans 0.18 ml de milieu) et ont été laissées se déposer pendant 24 h à 37 degrés sous 5 % de CO, Ensuite, les cellules ont été traitées pendant 6, 24 ou 72 h avec 0.0 2 ml de différentes concentrations d'antioxydants purs ou de leurs mélanges3,5. Les antioxydants et leurs mélanges ont été dissous dans de l'éthanol (naringénine, naringine et mélanges—30 % (v/v), quercétine-40 % (v/v), rutine—20 % (v/v )). Les concentrations finales des composés purifiés variaient de 10 nM à 100 uM. Les mélanges contenaient des concentrations équivalentes de chaque composé（10 nM-100 μM）. La concentration finale d'éthanol dans les milieux de culture était de 2 % (v/v) dans le cas de la rutine, de 3 % (v/v) de naringénine, de naringine et d'un mélange, ainsi que de 4 % (v/v) de quercétine. Après 6 et 24 heures d'exposition, le milieu a été aspiré des puits et remplacé par 0,2 ml de milieu frais. Les cellules ont été incubées à 37 degrés jusqu'à 72 h du temps d'incubation total13,55. Après 72 h d'incubation, 0,05 mL de solution de MTT (4 g/L) a été ajouté à tous les puits et les cellules ont été maintenues pendant 4 h supplémentaires à 37 degrés C13,5. Ensuite, le milieu a été aspiré des puits et les cristaux de formazan ont été dissous dans 0,05 mL de DMSO. L'absorption des solutions obtenues a été mesurée à 540 nm à l'aide du lecteur de plaques TECAN Infinite M200 (Tecan Group Ltd, Suisse)15. Les traitements ont été effectués en quatre répétitions techniques. Trois répétitions indépendantes de chaque traitement ont été effectuées. L'impact des échantillons étudiés sur la croissance des cellules HT29 a été exprimé en pourcentage d'inhibition de la croissance des cellules exposées à des antioxydants individuels et à leurs mélanges par rapport aux cellules témoins traitées avec le solvant uniquement, dont la croissance a été considérée comme étant de 100 % 13,55

Dosage CAA (activité antioxydante cellulaire). Le test CAA (The OxiSelect Cell Biolabs, Inc. USA) a été utilisé pour évaluer l'activité antioxydante cellulaire des composés seuls (O, N plus, R, N-) et des mélanges (ON-, RN plus) dans les cellules HT29 comme décrit précédemment35. Les cellules à croissance exponentielle ont été ensemencées dans des plaques noires de culture tissulaire 96- avec des fonds transparents pour les mesures de fluorescence (3 × 1 0 4 cellules par puits dans 0.2 ml de milieu) et ont été laissé reposer pendant 24 h à 37 degrés sous 5 % de CO,i3,55. Tous les antioxydants ont été dissous dans 10 % d'éthanol. Les cellules ont ensuite été traitées avec une solution diluée 50{{50}} fois de diacétate de 2',7'-dichlorofluorescéine (0.05 mL) fournie avec le kit, et le même volume de différentes concentrations d'échantillons d'antioxydants pendant 1, 3 ou 6 h. Les concentrations finales de composés purifiés variaient de 1 à 100 uM. Les mélanges contenaient des concentrations équivalentes de chaque composé (1-100uM). Les cellules témoins ont été traitées avec 10 % d'éthanol uniquement (v/v). La concentration finale d'éthanol dans le milieu de culture était de 5 % (v/v). Tous les traitements ont été effectués en trois répétitions techniques et trois expériences indépendantes ont été réalisées. Les étapes suivantes ont été effectuées selon les recommandations du fabricant (https://www.cellbiolabs.com). Les calculs ont été effectués comme décrit précédemment, Effets génotoxiques. Pour déterminer les effets génotoxiques présentés par les antioxydants individuels (O, N plus, RN-) et leurs mélanges (ON-, RN plus) dans les cellules HT29, une procédure de dosage des comètes a été appliquée comme décrit précédemment. Les cellules HT29 à croissance exponentielle ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire à 24-puits (cellules de 10 degré par puits dans 1,8 mL de milieu) et ont été laissées se déposer pendant 24 h à 37 degrés sous 5 % de CO, 55, Ensuite, les cellules ont été traitées pendant 24h avec 0,2 ml de différentes concentrations des antioxydants seuls ou en mélanges. Les concentrations finales des composés purifiés variaient de 1 à 100 uM. Les mélanges contenaient des concentrations équivalentes de chaque composé (1-100 uM). La concentration finale d'éthanol dans le milieu de culture était de 3 % (v/v). Les cellules utilisées comme témoins négatifs ont été traitées uniquement avec du solvant. Après le temps de traitement, le milieu a été aspiré des puits et les cellules ont été lavées avec 0,5 mL de PBS. Les cellules ont ensuite été détachées à l'aide de 0,2 mL de solution de trypsine (0,5 g/L)55. L'activité de la trypsine a été stoppée en ajoutant 1,8 mL de milieu de croissance complet dans chaque puits. Les cellules ont été remises en suspension, comptées et aliquotées dans des tubes de 1,5 ml (30 × 103³cellules par tube). La suspension cellulaire a été centrifugée (100 x g, 5 min, 4 degrés). Les culots cellulaires ont été lavés avec 1 ml de PBS et centrifugés à nouveau (100 × g, 5 min, 4 degrés ） 5. Ensuite, le PBS a été jeté et les cellules ont été remises en suspension dans 150 μL d'agarose LMP à 0, 5% dans de l'eau pré- réchauffé à 42 °C et 40 μL de ce mélange ont été placés en deux points sur une lame de microscope pré-enduite d'agarose à 1 % de point de fusion normal (agarose NMP). Les lames ont été recouvertes de lamelles. L'agarose a été autorisé à être fixé par placer les lames de microscope sur un plateau glacé pendant au moins 5 min5. Trois lames avec deux répétitions sur chacune ont été préparées pour chaque concentration des substances testées. Après une nuit de lyse dans un tampon alcalin à haute teneur en sel (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA , Tris 0,01 M, Triton X100 1 %, pH 10), les lames ont été logées dans une plate-forme d'électrophorèse Bio-Rad Sub-Cell GT (Royaume-Uni), recouverte d'un tampon d'électrophorèse froid (NaOH 0,3 M, EDTA 1 mM, pH 13) et La chromatine a été laissée se détendre pendant 25 min avant l'électrophorèse. L'électrophorèse a été réalisée à 26 V et 300 mA (0,75 V/cm) pendant 30 min dans l'obscurité à 4-8 degré. Après cette étape, les lames ont été lavées dans un premier temps avec du PBS puis de l'eau. Ensuite, l'ADN a été coloré avec du SybrGreen dans du tampon TE (0,1 M Trizma-Base, 1 mM EDTA, pH 7,5) pendant 20 minutes. Après coloration, les lames sont lavées à l'eau distillée pendant 5 min. Les "comètes" d'ADN ont été analysées sous un microscope à fluorescence (Zeiss ImagerZ2, USA) couplé à un système informatisé de balayage de lames (Metafer4, Allemagne). L'analyse des comètes a consisté à compter 200 noyaux consécutifs par échantillon5. La génotoxicité des échantillons analysés a été exprimée en pourcentage d'ADN dans la queue de la comète. Trois répétitions indépendantes de chaque traitement ont été réalisées.

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Méthylation globale de l'ADN.

For the determination of global methylation of DNA, a modified comet assay procedure was developed. Methylation sensitive comet assay was performed according to Wentzel's procedure with significant modifications. The cells were seeded in 6-well tissue culture plates(4×105 cells per well in 3.6 mL of medium) and were allowed to settle for 24 h at 37°C under 5%CO,Then, the cells were treated with 0.4 mL, of different concentrations of the tested antioxidants or their mixtures for 24 h at 37C. The final concentrations of individual compounds and solvents were the same as used for genotoxic effect assessment. After incubation time, the medium was aspirated from the wells and the cells were washed with 2 mL of PBS. The cells were detached using 0.4 mL of trypsin solution (0.5 g/L). Then,3.6 mL of medium was added to each well. The cells were re-suspended, counted, and aliquoted into 1.5 mL tubes(30×10 cells per tube). The cell suspension was centrifuged (100×g,5 min, 4°C). The cell pellets were washed with 1 mL of PBS and centrifuged again(100×g 5 min,4℃C）.PBS was discarded and the cell pellet was re-suspended in 100μL of 1%LMP agarose in water pre-warmed to 45 °C. Then,40 μL of this mixture was placed as two spots on a microscope slide pre-coated with 1%normal melting point agarose(NMP agarose)5. The slides were then covered with coverslips and left to set on an ice-cold tray for at least 5 min to solidify agarose5. Each treatment embraced a set of 3 microscope slides. After overnight lysis in a high salt alkaline buffer(2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 0.01 M Tris,1% Triton X100, pH 10), the slides were washed twice with water>5. La chromatine serrée a été déroulée en traitant les noyaux avec une solution de protéinase K 1,5 mM (0.2 mL par lame)3. Les lames ont été recouvertes de parafilm, placées dans un récipient en plastique tapissé d'un tissu humide, laissées pendant 10 min à 37 degrés, puis lavées à l'eau3. De cette manière, les nucléoïdes ont été préparés pour la digestion avec des endonucléases de restriction (Hall et MspI). Les deux enzymes reconnaissent la même séquence de restriction (5'-CCGG-3') mais présentent une sensibilité différente envers la cytosine méthylée. HpalI est présumé digérer uniquement les séquences non méthylées. Mspl peut cliver des séquences non méthylées ainsi que des séquences entièrement méthylées. Ainsi, les niveaux relatifs de méthylation de l'ADN de la séquence CpG sont reflétés par la différence entre la quantité globale d'ADN dans la queue de la comète observée avec la digestion par Mspl et les nucléoïdes digérés par HpalI. Pour créer des conditions appropriées pour la digestion enzymatique.{{20}}.2 mL de tampon Tango dilué avec de l'eau de qualité moléculaire dans un rapport 1:9 (v/v) ont été appliqués sur chaque lame de l'ensemble. Les lames ont été recouvertes de parafilm, logées dans un récipient en plastique recouvert d'un tissu humide et laissées pendant 10 min à 37 degrés Ce. Ensuite, l'excès de tampon a été éliminé. Chacune des trois diapositives de l'ensemble a été traitée différemment. Sur la première lame (témoin), seulement 0.15 mL de tampon Tango dilué ont été appliqués. Les noyaux inclus dans l'agarose sur la deuxième lame ont été traités avec 0,15 ml d'enzyme Hall (0,37 μunités), tandis que sur la troisième lame, le même volume de MspI a été ajouté (0,26 μunités). Les solutions enzymatiques ont été préparées en utilisant du tampon Tango dilué. Les lames ont été recouvertes d'un parafilm et logées dans un récipient en plastique humide. La digestion enzymatique a été réalisée pendant 45 min à 37 degrés. Après digestion, les lames ont été lavées deux fois à l'eau. D'autres étapes du test des comètes, telles que l'électrophorèse et la coloration de l'ADN, ont été effectuées comme décrit dans la section "Méthylation globale de l'ADN". Les "comètes" d'ADN ont été analysées sous un microscope à fluorescence (Zeiss ImagerZ2, USA) couplé à un système informatisé de balayage de lames (Metafer4, Allemagne). L'analyse des comètes a été réalisée à l'aide du logiciel Comet score (USA) et a impliqué le comptage de 100 noyaux par échantillon. Le pourcentage moyen d'ADN dans la queue de la comète était une mesure de la fragmentation de l'ADN. Pour calculer l'ADN globalméthylation(pourcentage de méthylation CpG), l'équation suivante a été utilisée : pourcentage de méthylation CpG=100—Hpal/MspI×100, où Hpal/MspI est le rapport du pourcentage d'ADN dans la queue de comète du nucléoïde digéré avec HpalII et l'ADN pourcentage dans la queue de comète de nucléoïde digéré avec Mspl85. Les artefacts de dommages à l'ADN ont été pris en compte en soustrayant le pourcentage d'ADN dans la queue de l'échantillon témoin des valeurs obtenues pour les échantillons digérés avec des enzymes de restriction. Trois répétitions indépendantes de chaque expérience ont été effectuées.

Analyse de puces à ADN.

L'analyse génomique a été effectuée comme indiqué avanti355, les cellules HT29 ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire 24-puits (105 cellules par puits dans 1,8 ml de milieu) et ont été laissées se déposer pendant 24 h à 37 degré sous 5% de CO, Ensuite, les cellules ont été traitées pendant 24 h avec 0,2 ml de différentes concentrations d'antioxydants seuls (Q, N-) ou en mélange (QN-). Les concentrations finales des composés étudiés variaient de 1 à 10 uM. Le mélange contenait des concentrations équivalentes de chaque composé. Les cellules utilisées comme témoins négatifs ont été traitées avec le solvant uniquement. La concentration finale d'éthanol dans le milieu de culture était de 3 % (v/y). Isolement de l'ARN. la transcription inverse et la PCR en temps réel d'un réseau composé de 84 gènes impliqués dans la réponse antioxydante ainsi que l'analyse des données ont été effectuées comme décrit précédemment. Trois répétitions indépendantes de chaque traitement de cellules ont été effectuées.

Analyses statistiques.

Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD de trois expériences indépendantes, sauf indication contraire. La signification statistique des déterminations de l'activité antioxydante dans un système sans cellule utilisant les tests DPV et DPPH ainsi que dans les modèles cellulaires obtenus par le test CAA a été examinée par le test de Tukey non apparié (p inférieur ou égal à 0.{{ 6}}5). Les résultats de la génotoxicité et de la méthylation globale de l'ADN analysés par des tests de comètes ont été examinés par ANOVA unidirectionnelle avec le test post-hoc de Dunnett. Ces analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du progiciel Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc., États-Unis). La signification statistique des changements dans l'expression des gènes entre les échantillons et les témoins a également été évaluée par le test t de Student non apparié pour chaque gène d'intérêt à l'aide du GenGlobe Data Analysis Center (Qiagen, États-Unis). Le niveau de signification statistique a été fixé à p inférieur ou égal à 0,05.

Cet article est extrait dewww.nature.com/scientificreports