Interférence des glycosides phényléthanoïdes de Cistanche Tubulosa avec le test MTT

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Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu et Yu-Qi Gao

Résumé:

Le test MTT, en tant que méthode de criblage, a été largement utilisé pour mesurer la viabilité et la prolifération des cellules. Cependant, il convient de noter que le test MTT peut ne pas refléter avec précision l'effet deCistanche tubulosaextrait éthanolique sur la viabilité des cellules EA.hy926. Pour étudier et identifier les composants responsables des observations contradictoires du test MTT, l'échinacoside et l'actéoside, deux glycosides phényléthanoïdes principaux, de l'extrait éthanolique de C. tubulosa ont été isolés. Les données dérivées des dosages CCK-8, Hoechst 33342 et annexine V-FITC/PI suggèrent que le groupe caféoyle présent dans les deux composés isolés était responsable des résultats contradictoires du dosage MTT. Ces données soulignent la nécessité d'utiliser une variété de méthodes différentes pour déterminer l'effet des agents médicinaux sur la viabilité cellulaire afin d'éviter de générer des résultats trompeurs.

Mots clés : test MTT ;glycoside de phényléthanoïde; acide caféique; viabilité cellulaire; ingérence

Introduction

La plante parasiteCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (famille des Orobanchaceae) est largement répandu dans les pays d'Afrique du Nord, arabes et asiatiques [1]. Les tiges deCistanche tubulosaetCistanche désertiquesont importants dans la médecine traditionnelle chinoise, ayant été utilisés pour le traitement de l'impuissance, de la stérilité, du lumbago et de la constipation due à l'inertie colique [2]. De plus, l'extrait éthanolique de Cistanche tubulosa a montré un effet protecteur significatif contre l'hypoxie cérébrale chez la souris [3].

Les cellules endothéliales jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de l'hypertension artérielle pulmonaire hypoxique. La lignée de cellules endothéliales EA.hy926 est considérablement similaire aux cellules endothéliales primaires. Au cours de notre propre étude de l'effet anti-hypoxique deCistanche tubulosaextrait éthanolique sur cellule endothéliale EA.hy926, nous avons remarqué que le 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-bromure de diphényltétrazolium (MTT) Le test, qui est couramment utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire dans les études de cytotoxicité et d'activité cytostatique, a généré des résultats contradictoires en montrant une augmentation de la viabilité des cellules EA.hy926 après le traitement.

Une évaluation précise de la viabilité cellulaire est essentielle pour identifier les effets cytotoxiques ou cytoprotecteurs potentiels d'un agent médicamenteux. Nous avons donc étudié les composants présents dans l'extrait éthanolique de C. tubulosa pouvant être responsables des résultats contradictoires observés avec le test MTT. Nous avons isolé deux principaux glycosides phényléthanoïdes (PhG) de l'extrait éthanolique de C. tubulosa, l'échinacoside (ci-après composé 1) et l'actéoside (ci-après composé 2), et déterminé leur effet sur la viabilité des cellules EA.hy926 à l'aide de diverses méthodes. De plus, afin de mieux préciser quel substituant des composés 1 et 2 peut être responsable des résultats contradictoires, nous avons testé leurs aglycones, l'acide caféique (ci-après composé 3) et le 3,4-dihydroxylphényléthanol (ci-après composé 4), sur la viabilité des cellules EA.hy926 en utilisant les mêmes méthodes.

Résultats et discussion

Identification des composés

Les structures des deux composés isolés de l'extrait éthanolique de C. tubulosa ont été identifiées par des analyses de résonance magnétique nucléaire (RMN) et de spectrométrie de masse (MS) et sont présentées à la figure 1. Le composé 1 a été identifié comme échinacoside par comparaison avec la RMN rapportée précédemment (tableau 1) et MS (m/z 785 [M−H]− ) données [4]. Les spectres RMN du composé 2 étaient très similaires à ceux du composé 1, à l'exception de l'absence d'un groupe -D-glucopyranosyle (tableau 1). Le composé 2 (m/z 623 [M−H]− ) a été identifié comme étant l'actéoside [5]. Il est important de noter que les deux composés ont le même aglycone, qui comprend l'acide caféique (composé 3) et le 3,4-dihydroxylphényléthanol (composé 4).

Essais de viabilité cellulaire

Les tests MTT et CCK{{0}} ont été utilisés pour analyser l'effet des composés 1 à 4 sur la viabilité des cellules EA.hy926. Le test MTT a montré que la viabilité des cellules EA.hy926 augmentait significativement après traitement avec 25 et 50 μM composé 1, 2 ou 3 (166,3 % et 174,1 % pour le composé 1, 205,8 % et 224,3 % pour le composé 2, et 164,8 % et 189,6 % pour le composé 3, respectivement ; p < 0,05),="" par="" rapport="" aux="" cellules="" témoins="" (figure="" 2a).="" de="" plus,="" une="" inspection="" morphologique="" des="" cellules="" a="" déterminé="" que="" le="" traitement="" avec="" 50="" μm="" de="" composé="" 1,="" 2="" ou="" 3="" augmentait="" la="" formation="" de="" cristaux="" de="" formazan="" violets,="" qui="" sont="" considérés="" comme="" une="" indication="" directe="" de="" la="" proportion="" de="" cellules="" vivantes="" (figure="" 3).="" à="" l'inverse,="" le="" test="" cck-8="" a="" suggéré="" que="" la="" viabilité="" cellulaire="" diminuait="" de="" manière="" significative="" après="" traitement="" avec="" 12,5,="" 25="" et="" 50 μm="" de="" composé="" 1,="" 2="" ou="" 3="" (75,5 %,="" 45,1 %="" et="" 43,7 %="" pour="" le="" composé="" 1,="" 85,5 %,="" 51,8="" %="" et="" 34,3="" %="" pour="" le="" composé="" 2,="" et="" 64,5="" %,="" 48,2="" %="" et="" 36,4="" %="" pour="" le="" composé="" 3,="" respectivement="" ;="" p="">< 0,05),="" par="" rapport="" aux="" cellules="" témoins="" (figure="" 2b).="" le="" composé="" 4="" n'a="" pas="" affecté="" la="" viabilité="" cellulaire="" dans="" le="" test="" mtt="" ou="" cck-8.="" l'écart="" entre="" les="" résultats="" obtenus="" avec="" les="" deux="" tests="" suggère="" que="" l'un="" des="" deux="" tests="" peut="" ne="" pas="" refléter="" avec="" précision="" les="" effets="" des="" composés="" 1="" et="" 2="" sur="" la="" viabilité="" des="" cellules="">

Évaluation de l'apoptose par coloration Hoechst

Hoechst 33342 est un colorant d'ADN perméable aux cellules qui est excité par la lumière ultraviolette et émet une fluorescence bleue de 460 à 490 nm. La chromatine condensée des cellules apoptotiques se colore plus vivement que la chromatine des cellules normales [6]. Alors que les cellules témoins présentaient une chromatine uniformément dispersée, des organites normales et des membranes cellulaires intactes, les cellules incubées avec 50 μM de composés 1, 2 ou 3 pendant 48 h ont montré la coloration typique des cellules apoptotiques (figure 4A). A l'inverse, l'exposition des cellules à 50 μM de composé 4 n'a pas augmenté le nombre de noyaux apoptotiques par rapport au traitement témoin.

Analyse cytométrique en flux des cellules apoptotiques

Le test de double coloration annexine V-FITC/PI identifie les cellules apoptotiques par la liaison de haute affinité de l'annexine V-FITC à la phosphatidylsérine, qui est externalisée dans les cellules en apoptose [7]. Dans ce test, les cellules viables ne se lient ni à l'annexine V ni à l'IP et ne sont donc pas colorées (quadrant inférieur gauche), les cellules apoptotiques précoces sont colorées en vert par la liaison de l'annexine V-FITC (quadrant inférieur droit) et les cellules apoptotiques tardives sont colorées en vert et en rouge par la liaison de l'annexine V-FITC à la phosphatidylsérine et de l'IP aux cellules nécrotiques, respectivement (quadrant supérieur droit). Comme le montre la figure 4B, les cellules incubées avec 50 μM de composés 1, 2 ou 3 pendant 48 h, le pourcentage de cellules apoptotiques est passé de 3,74 % (cellules témoins) à 10,32 %, 12,95 % et 11,30 %, respectivement. Par rapport aux cellules témoins, le composé 4 n'a pas augmenté le pourcentage de cellules EA.hy926 apoptotiques.

Conformément aux résultats obtenus avec le test CCK-8 et par coloration Hoechst 33342, le test de cytométrie en flux a montré que les composés 1, 2 et 3 induisaient l'apoptose dans les cellules EA.hy926. Dans l'ensemble, ces observations suggèrent que l'augmentation de la viabilité des cellules EA.hy926 observée avec le test MTT après traitement avec les composés 1 à 3 représentait un résultat faussement positif.

Discussion

En 1983, Mosmann a développé un test colorimétrique sur microplaque MTT pour mesurer la prolifération cellulaire et la cytotoxicité [8]. Ce test simple, et ses modifications, est maintenant largement utilisé dans les laboratoires de biologie cellulaire du monde entier. Des études de fractionnement dans des cellules de mammifères ont indiqué que le cofacteur de nucléotide pyridine réduit, NADH, est responsable de la plupart des réductions de MTT. Ceci a été soutenu par des études utilisant des cellules entières [9]. La réduction du MTT est donc associée aux cellules métaboliquement actives et est non seulement couplée à la respiration mitochondriale, mais aussi au cytoplasme et aux membranes non mitochondriales dont le compartiment endosome/lysosome et la membrane plasmique [10]. La charge positive nette sur la molécule MTT est le principal facteur de son absorption cellulaire via le potentiel de membrane plasmique.

Notamment, le test MTT peut parfois ne pas refléter avec précision l'effet réel qu'un composé testé a sur des cellules spécifiques. Cependant, les structures chimiques ou les groupes qui peuvent provoquer des résultats contradictoires dans le test MTT n'ont pas été identifiés. Des études récentes ont démontré que le test MTT pouvait sous-estimer l'effet anti-prolifératif du gallate de (−)-épigallocatéchine-3-, le polyphénol le plus abondant dans le thé vert [11]. Dans des études utilisant le test MTT pour détecter la chimiosensibilité tumorale, les agents chimiothérapeutiques anticancéreux, tels que l'épirubicine, le paclitaxel, le docétaxel et le mésylate d'imatinib (Gleevec), ont montré une viabilité cellulaire accrue [12,13]. De plus, un certain nombre d'études ont rapporté que certains extraits de plantes et polyphénols redox-actifs pourraient interférer avec le test MTT car ils réduisent directement le sel de tétrazolium MTT en l'absence de cellules [14].

La nécessité de solubiliser les cristaux de formazan MTT avant l'analyse spectrophotométrique dans un lecteur de microplaques et la nature inhérente du point final de la réaction limitent l'utilisation du test MTT à certaines applications. Cela a conduit au développement d'analogues de tétrazolium dans lesquels les fragments phényle étaient décorés avec des groupes sulfonate chargés négativement, tels que 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro- 5- sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxamide (XTT), un sel interne chargé négativement [15] et 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium (MTS), un sel interne faiblement acide étroitement lié au MTT [16] . Ces modifications ont abouti à la production de produits de formazan solubles dans le milieu de culture qui ont éliminé la nécessité d'une étape de solubilisation avant la quantification. De même, comme l'augmentation de la charge négative sur ces molécules réduisait leur capacité à se déplacer à travers les membranes cellulaires [17], les accepteurs d'électrons intermédiaires (IEA), tels que le 1-méthoxy-5-méthyl phénazinium méthylsulfate ({{25 }}méthoxy PMS) étaient nécessaires pour faciliter la réduction du colorant tétrazole ou pour augmenter le taux de réduction.

Plus récemment, une nouvelle génération de sels de tétrazolium hydrosolubles a été développée dont le WST-1 est le prototype [18]. WST-1, un sel interne disulfoné chargé négativement contenant un résidu d'iode, est plus stable que XTT et MTS en présence de 1-méthoxy PMS, son IEA obligatoire. Cela a conduit à la commercialisation de WST-1/1-methoxy PMS en tant que kit pratique de prolifération cellulaire à réactif unique. Plusieurs autres sels de tétrazolium de la série WST ont été développés, dont le plus utile est peut-être le WST-8 [19]. WST-8 semble avoir des propriétés de réduction cellulaire très similaires à WST-1 et est commercialisé indépendamment sous le nom de test CCK-8. Le WST-8 est imperméable aux cellules et est donc réduit de manière extracellulaire, via le transport d'électrons du NADH intracellulaire au WST-8 à travers la membrane plasmique médiée par le 1-méthoxy PMS. Bien que la réduction du MTT et du WST-8/1-méthoxy PMS soit pilotée par le NADH intracellulaire, la source de NADH semble différer dans ces deux méthodes. La réduction du WST-8/1-méthoxy PMS est plus fortement dépendante de la navette malate/aspartate qui relie le cycle de l'acide tricarboxylique mitochondrial-NADH à l'espace extramitochondrial [20].

Dans des expériences préliminaires, nous avons confirmé que les composés 1, 2, 3 et 4 ne pouvaient pas réduire directement le sel de tétrazolium MTT (non représenté). Dans la présente étude, l'influence directe des composés eux-mêmes avec le réactif a été éliminée en lavant soigneusement les microplaques avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant l'ajout de la solution MTT ou CCK-8, comme indiqué dans les protocoles du fabricant. Néanmoins, les résultats obtenus avec les deux méthodes restent contradictoires (Figure 2). Comme prévu, l'incubation des cellules avec les composés 1, 2 et 3 a augmenté la réduction du sel de tétrazolium en formazan violet, par rapport au groupe témoin (figure 3), suggérant que la simple réduction du sel de tétrazolium en présence d'un composé spécifique n'est pas suffisant pour juger de la capacité du composé à interférer avec le test MTT.

Pour déterminer si les composés 1, 2, 3 et 4 pouvaient induire l'apoptose dans les cellules EA.hy926, les changements morphologiques cellulaires et l'externalisation de la phosphatidylsérine ont été évalués. Conformément à la diminution de la viabilité cellulaire observée avec le test CCK -8, les résultats de la coloration Hoechst et de l'analyse par cytométrie en flux à l'aide de l'annexine V-FITC/PI ont suggéré que l'inhibition de la croissance observée après le traitement des composés 1, 2 et 3 était due, au moins en partie, à l'apoptose des cellules EA.hy926. Nos résultats ont également soutenu l'idée que le groupe caféoyle présent dans les composés 1 et 2 était responsable des résultats contradictoires obtenus avec le test MTT.

Semblable à nos découvertes, Rottlerin, un puissant ouvreur de canaux potassiques à grande conductance, n'a pas montré de réactivité vis-à-vis du MTT in vitro. Cependant, il a fortement amélioré la formation de cristaux de formazan à l'intérieur des cellules, un résultat qui était en conflit évident avec l'inhibition de Rottlerin de NF-κB et la prolifération cellulaire observée par l'analyse de l'incorporation de [ 3 H]-thymidine dans l'ADN [ 21 ]. Le mécanisme par lequel Rottlerin a amélioré la réduction du MTT a été attribué à son effet de découplage mitochondrial [22]. Rottlerin a un groupe substituant acide cinnamoyle. Comparé à l'acide cinnamoyle, le composé 3 possède deux résidus hydroxyle supplémentaires, qui sont situés en C-3 et C-4. Par conséquent, nous supposons que le mécanisme par lequel les composés 1 et 2 provoquent des résultats contradictoires dans le test MTT peut également être associé à leurs effets de découplage mitochondrial. Pour tester cette hypothèse, des études comparatives entre les composés 1, 2 et un découpleur chimique, tel que le trifluorocarbonylcyanure phénylhydrazone (FCCP), sont nécessaires.

Section expérimentale

Réactifs et produits chimiques

Le composé 3 (acide caféique en poudre, pureté=98,6 %) a été acheté auprès de Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Chine). Le composé 4 (huile de 3,4-dihydroxylphényléthanol, pureté=98,5 %) a été obtenu auprès de Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Chine). Le MTT et le diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Le test CCK-8 a été acheté auprès de Dojin Laboratories (Kumamoto, Japon). Les kits de détection d'apoptose Hoechst 33342 et annexine V-FITC/PI ont été achetés auprès du Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Chine)

Matériel végétal

Des tiges de C. tubulosa ont été collectées dans la préfecture de Yutian, dans la région autonome ouïghoure du Xinjiang, en Chine. Des spécimens de bons ont été déposés au Laboratoire clé de médecine de haute altitude, Troisième université médicale militaire (Chongqing, Chine) et authentifiés par Yi Zhang de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (Chengdu, Chine)

Extraction et isolement du matériel végétal

Les tiges de C. tubulosa (0.6 kg) séchées à l'air ont été réduites en poudre et extraites avec 50 % d'éthanol pendant 2 h à 70 degrés. Après élimination du solvant sous pression réduite, l'extrait éthanolique (212,5 g) a été dissous et mis en suspension dans de l'eau (2 L) et extrait avec du n-butanol (2 L x 3). L'extrait n-butanolique (110 g) a été chromatographié sur une colonne de polyamide et élue avec de l'éthanol/eau (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) produisant cinq fractions (A–E) . La fraction B (65 g) a été fractionnée sur une colonne ODS ; élution avec de l'éthanol : eau (1:9) composé séparé 1 (3 g). La fraction D (10,5 g) a été fractionnée sur une colonne ODS ; l'élution avec de l'éthanol/eau (1:4) a séparé le composé 2 (1 g).

Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker Avance 600 en CD3OD avec du tétraméthylsilane (TMS) comme étalon interne. Les spectres de masse ont été réalisés sur un spectromètre de masse BioTOF-Q.

Culture de cellules

Les lignées cellulaires EA.hy926 ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640, additionné de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal et de 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine dans un environnement humidifié avec 5 % de CO2 à 37 degrés.

Viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide des tests MTT et CCK{{0}}. Les composés 1 et 2 et leurs aglycones, l'acide caféique (3) et le 3,4-dihydroxylphényléthanol (4) ont été dissous dans du DMSO jusqu'à la concentration finale de DMSO < 0,1 % (v/v)="" dans="" le="" milieu="" de="">

Les cellules EA.hy926 ont été ensemencées sur des plaques 96-puits à raison de 4 × 103 cellules/puits. Après incubation pendant 24 h, les cellules ont été traitées avec 6,25 à 50 μM de composé 1, 2, 3 ou 4 pendant 24 h. Le milieu de culture a été retiré et les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Des aliquotes (10 μL) de solution mère de MTT (5 mg·mL-1 ) ont été ajoutées à chaque puits contenant 100 μL de milieu et incubées avec des cellules pendant 4 h. Après incubation, le milieu a été retiré et des aliquotes de 150 µL de DMSO ont été ajoutées à chaque puits pour solubiliser les cristaux de formazan. L'absorbance a été mesurée à 490 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). La viabilité cellulaire a été exprimée en pourcentage de réduction du MTT, en attribuant la valeur de 100 % à l'absorbance des cellules témoins. Toutes les expériences ont été réalisées trois fois et présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD).

Le test CCK-8 a été réalisé conformément à la littérature avec de légères modifications [23]. Plus précisément, les cellules ont été traitées avec 6, 25 à 50 μM de composés 1, 2, 3 ou 4 pendant 24 h et lavées deux fois avec du PBS avant l'ajout de 10 μL de solution CCK-8 et 100 μL de milieu de culture. Après incubation de la microplaque à 37 degrés pendant 2 h, l'absorbance a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaque. La viabilité cellulaire a été exprimée en pourcentage de cellules viables par rapport aux cellules témoins (100 %). Toutes les expériences ont été entreprises trois fois et exprimées en moyenne ± SD.

Évaluation de l'apoptose par coloration Hoechst 33342

Des changements morphologiques apoptotiques ont été observés par coloration Hoechst 33342. En bref, les cellules EA.hy926 ont été ensemencées sur des plaques 48-puits (2 × 104 cellules/puits) et traitées avec 50 μM de composé 1, 2, 3 ou 4 pendant 48 h à 37 degrés, lavées deux fois avec du PBS, et fixé avec du paraformaldéhyde à 4 % (v/v) pendant 15 min à température ambiante. Après rinçage deux fois avec du PBS, les cellules ont été colorées avec du Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) pendant 5 min à température ambiante et lavées deux fois avec du PBS. Les noyaux colorés par Hoechst ont été visualisés à l'aide d'un microscope à fluorescence (Olympus, Tokyo, Japon).

Analyse de l'apoptose par cytométrie en flux

Les cellules apoptotiques ont été détectées par double coloration à l'annexine V-FITC/PI et analyse par cytométrie en flux. En bref, après traitement avec 50 μM de composé 1, 2, 3 ou 4 pendant 48 h, les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans du PBS à 1 × 105 cellules·mL-1. Après centrifugation à 500 × g pendant 5 min à 25 degrés, 195 μL de tampon de liaison annexine V-FITC et 5 μL d'annexine V-FITC ont été ajoutés. Après un mélange doux au vortex, le mélange a été incubé pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité. Après centrifugation à 500 × g pendant 5 min à 25 degrés, 190 μL de tampon de liaison à l'annexine V conjugué à FITC et 10 μL de PI ont été ajoutés. Après un mélange doux au vortex, les échantillons ont été analysés à l'aide d'un cytomètre en flux FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) dans les 30 minutes.

Analyses statistiques

Toutes les données expérimentales ont été exprimées en moyenne ± SD. La signification des différences entre les échantillons expérimentaux et le contrôle correspondant a été évaluée par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) à l'aide du logiciel SPSS (version 11.5). La signification statistique a été fixée à p <>

conclusion

Nos résultats suggèrent que la surestimation du nombre de cellules viables observée dans le test MTT pourrait masquer la cytotoxicité de certains composés. Par conséquent, lors des processus de criblage de médicaments, nous vous recommandons d'utiliser diverses méthodes pour déterminer l'effet du composé spécifique sur la viabilité cellulaire (comme les tests CCK-8 et 3 H-TdR) afin d'éviter de générer des résultats trompeurs.