Architecture tridimensionnelle des néphrons dans le rein normal et kystique

Contact : emily.li@wecistanche.com

Thomas Blanc1,2,7 , Nicolas Goudin3,7 , Mohamad Zaidan1,4,7 , Meriem Garfa Traore3 , Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1 , Serge Garbay1 , Clé´ment Nguyen1 , Martine Burtin1 , Gérard Friedlander1,6 , Fabiola Terzi1,8 et Marco Pontoglio1,8

Cistanche est bon pour les reins

MOTS CLÉS : maladie rénale kystique ; un rein; néphron; néphronophtise;compensation des tissus

La fonction rénale dépend de manière cruciale de la structure tridimensionnelle complexe des néphrons. Toute déformation de leur forme peut entraînerdysfonctionnement rénal. Les méthodes histologiques traditionnelles présentent des limitations majeures pour la reconstruction tissulaire en trois dimensions. Ici, nous avons combiné la compensation des tissus, la microscopie multiphotonique et le traçage numérique pour la reconstruction de néphrons uniques dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ensembles denéphronsdifférents par leur emplacement, leur forme et leur taille selon leur fonction ont été identifiés. Fait intéressant, les néphrons ont tendance à se trouver dans des plans. Lorsque cette technique a été appliquée à un modèle demaladie rénale kystique, on a constaté que les kystes se développaient uniquement dans des segments spécifiques du néphron. Le long d'un même segment, les kystes sont contigus à l'intérieur de tubules normaux non dilatés. De plus, les formes des kystes variaient selon le segment du néphron. Ainsi, nos découvertes fournissent une stratégie précieuse pour visualiser la structure complexe des reins au niveau du néphron unique et, plus important encore, fournissent une base pour comprendre les processus pathologiques tels que la cystogenèse.

Déclaration de traduction

Les méthodes de compensation fournissent un outil unique pour comprendre comment les changements morphologiques conduisent à des conséquences pathologiques. Les reins sont des organes essentiels qui maintiennent l'homéostasie du corps grâce à la manipulation de l'eau, des métabolites et des électrolytes, qui dépendent de manière cruciale de la structure dimensionnelle 3-complexe des néphrons. Lorsque cette organisation structurale est altérée, la physiopathologie rénale s'ensuit. Dans la présente étude, nous avons développé une méthode puissante basée sur la compensation optique,

microscopie multiphotonique et tracé numérique pour étudier le rein au niveau du néphron unique dans des conditions physiologiques et pathologiques. En particulier, nous fournissons la première reconstruction dimensionnelle 3- d'un rein polykystique à l'échelle de néphrons uniques. Cette méthode peut être appliquée à plusieurs contextes pathologiques, permettant de mieux comprendre le processus complexe de détérioration des reins et, par conséquent, de développer des stratégies thérapeutiques plus ciblées.

Le rein maintient l'homéostasie du corps via sa structure complexe de néphrons 3-dimensionnels (3D). Lorsque cette organisation structurale est altérée, la physiopathologie rénale s'ensuit.Maladies rénales chroniquesse caractérisent par le développement de lésions rénales. Curieusement, les pathologistes ont signalé une grande hétérogénéité dans la distribution des lésions au cours des maladies rénales chroniques.1,2 Si cela reflète le fait que des segments de néphrons spécifiques peuvent être endommagés différemment, ou alternativement, que certains néphrons ont des susceptibilités différentes à être blessés dans leur ensemble , est inconnue. Pour résoudre ce problème, il est obligatoire de reconstruire la forme 3D des néphrons dans des contextes pathologiques.

A notre connaissance,néphronsn'ont été entièrement reconstruites qu'à l'aide de coupes 2D en série.3–5 Bien que la coupe histologique standard fournisse une haute résolution, les reconstructions 3D sont laborieuses et difficiles à obtenir. Cela est principalement dû aux distorsions mécaniques, qui sont un effet inévitable de la procédure de tranchage. De plus, la reconstruction 3D à partir d'images 2D ne permet pas l'imagerie directe des structures 3D dans les tissus entiers.

La microscopie multiphotonique a amélioré notre capacité à détecter les changements morphologiques dans les coupes épaisses. Cependant, une limitation importante est la faible profondeur accessible en raison de la diffusion de la lumière. En minimisant les différences d'indice de réfraction, les agents de compensation ont considérablement amélioré la capacité d'imager les profondeurs.6,7 Malgré le fait que le premier agent de compensation a été introduit il y a un siècle,8 ce n'est que récemment que plusieurs protocoles de compensation ont été développés, principalement pour le cerveau. .9–17 Des études récentes ont démontré leur potentiel pour l'imagerie d'autres organes solides, tels que le foie, le pancréas ou les reins.18–26

cistanche pour les maladies rénales

Polykystose rénale, une maladie génétiquement hétérogène impliquant des mutations dans plusieurs gènes ciliaires, est la maladie rénale héréditaire la plus courante.27,28 La polykystose rénale se caractérise par le développement de kystes qui conduisent à la destruction complète du rein.28 développer soit comme une "poussée vers l'extérieur" d'un segment de néphron, comme dans la polykystose autosomique dominantemaladie du rein; sous forme d'expansion ectatique des canaux collecteurs (CD), comme dans la polykystose autosomique récessivemaladie du rein; ou exclusivement dans les tubules médullaires, comme dans la néphronophtise (NPHP).27,29 Cependant, la façon dont les kystes se développent en 3D et s'organisent les uns avec les autres et les tubules voisins normaux est encore inconnue.

Ici, nous avons combiné la compensation optique avec la microscopie multiphotonique pour fournir de nouvelles informations sur la façon dontnéphronssont façonnés et organisés dans des conditions physiologiques et comment ils sont modifiés au cours de la maladie, comme la cystogenèse. Nos résultats démontrent qu'il existe 3 types de néphrons et que les vaisseaux peuvent influencer l'organisation spatiale des néphrons. Fait intéressant, nous avons observé que les néphrons ont tendance à se situer dans des plans spécifiques. De manière inattendue, lorsque nous avons appliqué cette technique à des souris jck, nous avons observé que les kystes se développaient uniquement dans des segments de néphron spécifiques avec des kystes fusiformes entremêlés de tubules normaux.

RÉSULTATS

Montage expérimental

Pour étudier la forme de l'ensemblenéphronsen ce qui concerne leur environnement, nous avons adopté une technique basée sur la compensation optique et la microscopie multiphotonique (Figure supplémentaire S1A). En comparant différents protocoles de compensation optique, nous avons déterminé que pour le rein, l'alcool benzylique/benzoate de benzyle (BABB) était le plus approprié en termes d'efficacité (Figures supplémentaires S1B et C et Tableau supplémentaire S1).

La reconstruction 3D et le traçage numérique nécessitent des images de haute qualité avec une résolution élevée et un rapport signal sur fond élevé. Nous avons observé que le signal optique fourni par la fluorescence native n'était pas uniforme sur les coupes de rein. En particulier, les images de la moelle étaient peu contrastées avec un faible rapport signal sur fond (Figure supplémentaire S2). Pour améliorer le rapport signal sur fond, nous avons coloré les sections avec de l'acide périodique–Schiff (Figure supplémentaire S1D), car nous avons constaté de manière empirique que cette coloration provoquait un contraste élevé dans les sections minces pendant la 2-fluorescence photonique. Cependant, le signal n'était pas uniforme dans toutes les coupes épaisses de rein colorées à l'acide périodique Schiff (Figure supplémentaire S1E). Par conséquent, nous avons coloré des coupes de rein avec des lectines couplées au flfluorochrome : l'agglutinine d'arachide et l'agglutinine de germe de blé, qui colorent les glomérules et les tubules, et l'agglutinine de Griffonia simplicifolia, qui marque les vaisseaux sanguins. le rapport de fond a été considérablement augmenté dans l'ensemblesections de rein, avec une amélioration significative à la fois du plan xy et de l'axe z (Figure supplémentaire S1E et Film supplémentaire S1).

Visualisation 3D du segment de néphron

Pour visualiser la forme des néphrons entiers, nous avons tracé leurs trajectoires, commençant au pôle urinaire du glomérule et se terminant à la jonction CD (Supplémentaire Film S2). Malgré le fait que les lectines utilisées lient globalement tous les segments de néphron, nous avons remarqué que lorsqu'elles étaient soigneusement inspectées, ces lectines étaient caractérisées par un motif spécifique dans la façon dont elles coloraient les membranes basales ou luminales dans les différents segments de néphron. En d'autres termes, nous avons profité du modèle stéréotypé de coloration de la lectine pour identifier les différents segments de néphron. De cette manière, nous avons pu facilement identifier 6 entités : tubule proximal (PT), branche mince (TL) de l'anse de Henle (HL), branche ascendante épaisse (TAL) de HL, tubule contourné distal (DCT), tubule de connexion (CNT ) et CD. La transition entre PT et TL a été caractérisée par la perte soudaine du signal typique de bordure en brosse PT et par la diminution de la largeur de la lumière, qui était presque pratiquement absente dans TL (Figure 1a). À l'inverse, la transition entre TL et TAL a été caractérisée par une augmentation significative du diamètre tubulaire externe et une largeur de lumière relativement constante (Figure 1b). Dans toutnéphrons, la transition de TAL à DCT était systématiquement retrouvée au pôle vasculaire du glomérule. Cette transition était caractérisée par un élargissement soudain du diamètre tubulaire externe qui était principalement dû à une augmentation significative du diamètre de la lumière (Figure 1c). La transition entre DCT et CNT a été caractérisée par une réduction du diamètre tubulaire et de la lumière (Figure 1d). Enfin, la connexion entre le CNT et le CD cortical a été caractérisée par une augmentation soudaine du diamètre tubulaire et de la lumière (Figure 1e). La quantification de ces transitions morphologiques était statistiquement significative (Figure 1f) et sa pertinence a été vérifiée par une coloration avec des marqueurs tubulaires spécifiques (Figures supplémentaires S3-S5 et Film supplémentaire S3-S5).

La forme et la taille des PT diffèrent selon leur profondeur

La coloration d'épaisseursections de reinnous a permis de tracer les coordonnées de l'évolution spatiale de segments PT entiers. Fait intéressant, nous avons découvert que leur forme était extrêmement variable et déterminée par la position de leurs glomérules dans le cortex. Globalement, nous avons identifié 3 modèles. Le premier cor a répondu aux néphrons les plus superficiels (SN) (Figure 2a; Film supplémentaire S6), qui occupaient la partie la plus externe du cortex (les 30% les plus externes à proximité de la capsule rénale). Leurs parties alambiquées formaient des structures compactes avec seulement 6 à 7 circonvolutions autour de leur propre glomérule, occupant des espaces très petits et très serrés. La convolution de ces SN se terminait par une pars recta longue et droite qui descendait dans la moelle. À l'extrémité opposée de ce spectre, nous avons observé un deuxième modèle denéphronssitué dans la partie la plus profonde du cortex (40 % de profondeur interne supplémentaire), à ​​côté de la moelle (néphrons juxtamédullaires [JN]) (Figure 2a ; Figure supplémentaire S6 et Film supplémentaire S6). Leurs TP étaient caractérisés par une première boucle courte qui descendait systématiquement vers la papille puis se tournait en U pour remonter vers la capsule rénale. Contrairement aux SN, les tubules contournés proximaux de JN étaient caractérisés par de grandes bobines qui évoluaient autour de leur propre glomérule et occupaient de grands domaines lâches dans le cortex juxtamédullaire. La partie alambiquée du PT des JN avait 10 à 15 circonvolutions, formant de grands domaines. Enfin, le troisième modèle comprenait des néphrons situés dans la partie médiane du cortex (néphrons moyens [MN]) (Figure 2a ; Film supplémentaire S6). Fait intéressant, ces tubules avaient une forme et une orientation spatiale qui représentaient une transition entre les SN et les JN. En fait, ils contenaient 8 à 9 convolutions avec des bobines plus grandes que les SN, mais plus petites que les JN. De plus, les MN avaient une pars recta plus longue que les JN. Fait intéressant, une comparaison globale des formes des PT a montré que les SN et les MN avaient un schéma homogène alors que les JN étaient extrêmement hétérogènes (Figure supplémentaire S6). De plus, la reconstruction spatiale de plusieurs néphrons a révélé que les PT ne se mélangent jamais (film supplémentaire S6), indiquant que chaque néphron occupe son propre espace individuel dans le cortex.

Les analyses morphométriques ont confirmé les grandes différences de taille et de forme des SN et des JN, avec un aspect intermédiaire pour les MN. Le PT des JN était plus que 2- fois plus long que le PT des SN (Figure 2b) ; cependant, la rectitude était plus grande dans les SN que dans les JN (Figure 2c), ce qui correspond à l'observation selon laquelle les tubules JN étaient beaucoup plus tortueux (Figure 2a; Figure supplémentaire S6).

Figure 1|Critères morphologiques utilisés pour identifier les segments de néphron. (a–e) Morphologie des différents segments du néphron chez les souris témoins. Les néphrons ont été tracés du pôle urinaire du glomérule au canal collecteur (tubule proximal [PT] : turquoise ; branche fine [TL] de l'anse de Henle : gris clair ; branche ascendante épaisse [TAL] de l'anse de Henle : gris foncé ; tubule contourné distal [DCT] : rose ; tube de connexion [CNT] : jaune ; canal collecteur cortical [CCD] : orange). Les flèches indiquent le diamètre des différents segments de néphron. (A continué)

Figure 1|(Suite) (f) Quantification du diamètre tubulaire externe des différents segments de néphron. Les données sont exprimées en moyenne SEM. Analyse de variance suivie du test de Tukey-Kramer : **P < 0.01,="" ***p=""><>

Figure 3|La reconstruction tridimensionnelle (3D) des néphrons révèle 3 types différents de néphrons. ( a ) Images 3D représentatives d'un néphron entier (panneaux de gauche) des glomérules au canal collecteur dans le cortex superficiel (bleu), le cortex moyen (vert) et la région juxtamédullaire (rouge) chez les souris témoins. Segmentation des néphrons (panneaux de droite) pour les 3 différents types de néphrons. Barre ¼ 150 mm. (b) Quantification de l'interdistance entre les 2 membres de la boucle de Henle pour les 3 types de néphrons. (c) Quantification de la longueur du néphron pour le (suite)

Figure 3|(suite) 3 types de néphrons. (d) Quantification de la longueur des différents segments du néphron selon le type de néphron. Les données sont exprimées en moyenne -SEM. Analyse de variance suivie du test de Tukey-Kramer : néphron juxtamédullaire (JN) versus néphron superficiel (SN) : ###P < 0.001 ;="" jn="" par="" rapport="" au="" néphron="" moyen="" (mn) :="" *="" p="">< 0.05,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001.="" cnt,="" tubule="" de="" connexion ;="" dct,="" tubule="" contourné="" distal ;="" pt,="" tubule="" proximal ;="" tal,="" branche="" ascendante="" épaisse="" de="" l'anse="" de="" henle ;="" tl,="" branche="" fine="" de="" l'anse="" de="">

La taille des glomérules varie avec la profondeur

Nous avons ensuite analysé la profondeur et le diamètre des glomérules choisis au hasard dans chacune des 3 zones. Les analyses morphométriques ont révélé que les glomérules étaient situés en moyenne à 783 et 355 mm de la capsule rénale chez les JN et les SN, respectivement. Comme indiqué précédemment, nous avons observé que la taille des glomérules variait en fonction de leur profondeur. En particulier, le volume glomérulaire des JN était 3 fois supérieur à celui des SN et des MN (Figure 2d).

Reconstruction de néphron 3D

Nous avons ensuite tracé l'évolution spatiale des néphrons entiers de PT à CNT. La vue globale de leur reconstruction 3D a confirmé que la forme du néphron différait entre les SN, les MN et les JN (Figure 3a ; Film supplémentaire S7). Cette différence était principalement due à la structure de PT. De plus, nous avons observé que HL avait une organisation spatiale 3D différente. En particulier, TL et TAL étaient plus éloignés dans les JN que dans les SN et les MN (Figure 3b). Les analyses morphométriques ont révélé que les JN étaient globalement 2- fois plus longs que les SN (Figure 3c). La longueur accrue était répartie proportionnellement dans tous les segments, à l'exception de TAL et DCT, qui avaient tendance à avoir une longueur absolue similaire dans tous les types de néphrons (Figure 3d). Cela suggère que l'allongement du néphron est un processus étonnamment homogène.

Les vaisseaux arqués influencent la convolution PT juxtamédullaire

Pour avoir une vision plus globale de lastructure rénale, nous avons profité de la coloration à l'agglutinine de Griffonia simplicifolia, qui nous a permis de tracer les vaisseaux arqués et leurs branches dans les vaisseaux corticaux radiés (Figure 4a; Film supplémentaire S8). Fait intéressant, la reconstruction 3D concomitante des néphrons et des vaisseaux a montré que les vaisseaux arqués ont tendance à être dans une organisation spatiale parallèle surprenante avec les tubules à proximité. En particulier, nous avons observé que le chemin suivi par des JN spécifiques (JN contraints) a tendance à suivre le chemin du navire à proximité (Figure 4b; Film supplémentaire S9). Remarquablement, ce biais (observé uniquement dans un sous-ensemble de néphrons JN) expliquait la grande hétérogénéité des formes de PT (Figure supplémentaire S6). Les analyses morphométriques ont révélé que les PT "contraints" étaient significativement plus longs et plus tortueux (rectitude réduite) que les "non contraints" (Figure 4c et d). Il convient de noter que les parties alambiquées des SN et des MN étaient positionnées au-dessus des vaisseaux arqués et n'étaient pas contraintes.

Les tubules ont tendance à se trouver dans des plans

Fait intéressant, l'inspection des formes 3D des néphrons a indiqué qu'ils ont tendance à se trouver dans des plans (Figure 5a ; Film supplémentaire S10). Pour quantifier ce paramètre et évaluer l'éventuel biais statistique de cette conformation, nous avons mesuré la tendance générale des tubules à se courber hors du plan défini par leurs boucles. Nos mesures ont montré que par rapport à un modèle simulé de marche aléatoire généré avec le même ensemble d'angles mesurés consécutifs et de longueur entre des points consécutifs (Figure 5b), les tubules avaient tendance à évoluer avec un écart plus petit par rapport à un plan (Figure 5c). Cela indiquait que les tubules avaient tendance à restreindre leur trajectoire le long d'un plan. Les différences observées étaient hautement statistiquement significatives (P <>

cistanche peut améliorer la fonction rénale

La reconstruction 3D du néphron révèle un modèle spécifique de développement du kyste

Pour déterminer si notre protocole permet de tracer des néphrons dans des tissus pathologiques désorganisés, nous avons caractérisé les formes et la distribution spatiale des kystes chez les souris jck, un modèle largement utilisé de NPHP et de maladie kystique.31–33 3Les images D ont montré que malgré de l'apparition de kystes proéminents, l'évolution 3D générale des néphrons ne différait pas significativement de celle des souris témoins (film supplémentaire S11). De même, les analyses morphométriques ont confirmé que la longueur globale des néphrons, le volume glomérulaire et la longueur de chacunnéphronsegment étaient comparables à ceux des souris témoins (Figure supplémentaire S7). Il convient de noter qu'en raison du développement de kystes, nous n'avons pas pu différencier TL de TAL dans HL. Tous les néphrons ont développé des kystes fusiformes (Films supplémentaires S11 et S12). L'une des caractéristiques les plus frappantes était l'observation que des dilatations kystiques fusiformes se produisaient à plusieurs endroits le long du mêmenéphronsegment (Films supplémentaires S12 et S13). Curieusement, nous avons observé que les kystes ne se sont jamais développés dans les membres descendants PT et HL (Figure 6a; Film supplémentaire S12). En revanche, ils ont été principalement détectés dans les membres ascendants HL, les DCT, les CNT et dans la partie supérieure des CD, en continuité avec le CNT (Figure 6a; Film supplémentaire S12). En particulier, nous avons observé que le DCT, ainsi que les segments CNT, avaient une probabilité particulièrement accrue de développer des kystes dans leurs parties plus distales respectives (Figure 6b). Des analyses morphométriques quantitatives d'images de reconstruction 3D ont révélé que le volume total de kyste parnéphronétait particulièrement élevée en CNT (Figure 7a). De plus, nous avons observé que les agrandissements de kystes dans HL et DCT étaient plus importants dans les JN que dans les SN et les MN (Figure 7a; Film supplémentaire S12). De plus, l'incidence des kystes était significativement plus élevée dans les JN que dans les autres types de néphrons (Figure 7b). Nous avons également observé que l'interdistance glomérulaire moyenne (calculée sur les 5 glomérules les plus proches) avait tendance à être particulièrement augmentée chez les souris kystiques, en particulier dans le cortex plus superficiel (Figure supplémentaire S8).

La reconstruction 3D de nombreux kystes a révélé qu'ils étaient extrêmement variables en forme et en volume (Figure 6c ; Films supplémentaires S11 et S13). Dans le membre ascendant HL, les kystes avaient une forme fusiforme avec un petit diamètre. Dans la DCT, les kystes avaient une forme plutôt sphérique et plus large et étaient intercalés parmi des tubules non dilatés. Fait intéressant, la transition entre DCT et CNT était systématiquement caractérisée par une structure normale non dilatée. En revanche, en CNT, nous avons systématiquement observé une structure kystique dilatée contiguë directement au contact de la CD. Fait intéressant, dans la CD, cette structure s'est progressivement réduite à une taille de tubule normale. Plus distalement, aucun autre kyste n'a pu être détecté dans la partie contiguë du CD. Une autre caractéristique constante était l'organisation spatiale particulière des kystes dans le membre ascendant HL. En fait, bien que les kystes soient plus profonds et plus proches de la boucle dans les SN, ils étaient plus superficiels et plus proches du DCT dans les JN (Figure 6c). Encore une fois, les kystes occupaient une position intermédiaire dans les MN (Figure 6c).

Figure 5|Les tubules de néphron ont tendance à évoluer comme une structure plate. (a) Un trajet typique d'un tubule proximal de néphron. Cette trajectoire illustre sa tendance à se situer dans un plan. La planéité de l'évolution de la trajectoire peut être mieux vue lorsqu'elle est correctement tournée et alignée avec le point de vue de l'observateur (voir la représentation de droite du même segment tubulaire, qui, sur le côté gauche, est représenté sur un autre angle). (b) Représentation schématique d'un chemin tubulaire composé de 4 segments (entre 5 points définissant un chemin tubulaire donné montré à titre d'exemple). Le degré auquel les trajectoires ont tendance à « sortir de leur plan » peut être représenté par l'angle indiqué ici par « bêta ». (A continué)

Figure 5|(Suite) Cet angle est mesuré entre le segment p3-p4 par rapport au plan (défini par les points immédiatement précédents p3, p2 et p1) et représenté par un rectangle gris foncé dans le schéma. Le calcul des angles bêta a ensuite été calculé de manière récursive tout au long de l'ensemble des points d'un chemin tubulaire. Pour évaluer l'étendue du biais de ces angles bêta, nous avons simulé une marche aléatoire (simulation de Monte Carlo [MCs]) en utilisant le même ensemble d'angles alpha consécutifs de chaque trajet tubulaire (mesurés entre tous les segments consécutifs). Cette marche aléatoire a généré un chemin avec un ensemble identique d'angles alpha et d'angles bêta aléatoires. ( c ) Graphiques en violon de la distribution globale des angles bêta et du résultat des MC dans le tubule proximal (PT), la branche mince (TL) de l'anse de Henle, la branche ascendante épaisse (TAL) de l'anse de Henle, le tubule contourné distal ( DCT) et tubule conjonctif (CNT). MC, P <>

DISCUSSION

Les méthodes histologiques traditionnelles sont limitées dans leur capacité à détecter les changements pathologiques qui affectent la forme globale des néphrons. Ici, nous présentons une approche puissante basée sur la compensation des tissus qui a le potentiel de répondre à des questions cruciales sur l'architecture du rein avec des détails spatiaux sans précédent dans des conditions normales et pathologiques. Nos résultats ont confirmé l'existence de 3 types de néphrons, qui diffèrent par leur emplacement, leur forme et leur taille, conformément à leurs spécificités fonctionnelles. De plus, nous avons démontré que les néphrons ont tendance à se situer dans des plans et à s'adapter à l'organisation spatiale des vaisseaux. Curieusement, lorsque nous avons appliqué cette technique à un modèle demaladie rénale kystique, nous avons observé que des kystes se développent dans tous

néphrons, mais seulement dans des segments spécifiques. De manière intéressante, nous avons montré que la forme des kystes varie selon le segment du néphron, et que le long d'un même néphron, les kystes s'intercalent avec des tubules normaux non dilatés. Au total, ces résultats fournissent la première caractérisation 3D de l'arrangement spatial des néphrons et des vaisseaux et, surtout, fournissent la base pour comprendre un processus pathologique, tel que la cystogenèse.

La compensation optique du rein est difficile en raison des niveaux élevés d'autofluorescence et de densité cellulaire. En comparant différents protocoles de dégagement, nous avons identifié dans BABB une technique puissante pour mettre en œuvre la visualisation et la reconstruction des structures situées dans la partie la plus profonde duun rein, c'est-à-dire la moelle. De plus, BABB est rapide et évolutif et, une fois effacés, les échantillons peuvent être stockés pendant des mois avant l'acquisition des images. Un autre avantage majeur de cette technique est son faible coût. Les agents de compensation peuvent entraîner un rétrécissement ou un élargissement des structures.9–17 Cependant, comme ces modifications de la taille des reins sont isotropes, les mesures relatives ne devraient pas être affectées ou biaiser leur interprétation. L'une des limitations les plus importantes est l'annotation des structures qui prend beaucoup de temps. Néanmoins, il existe un nombre croissant de techniques basées sur l'apprentissage en profondeur qui devraient rapidement surmonter cette limitation.

Conformément aux résultats obtenus par les techniques classiques, notre étude a montré que les néphrons diffèrent par leur forme et leur longueur en fonction de leur position. En particulier, nous avons observé que les JN ont des PT convolutés plus développés et des glomérules plus gros et sont 2 fois plus longs que les SN. L'augmentation de la longueur est le résultat d'un processus harmonieux car l'allongement affecte proportionnellement tous les segments du néphron. Nous avons également observé que les JN ont un HL plus grand. Dans l'ensemble, ces données montrent clairement que la microanatomie des SN et des JN est significativement différente et que les MN présentent des caractéristiques intermédiaires. Fait intéressant, des études physiologiques ont montré que les néphrons sont également fonctionnellement différents.2 Les événements morphogénétiques qui sous-tendent ces différences ne sont pas encore connus. Il est donc tentant de supposer que la structure particulière des JN pourrait expliquer la spécificité de leurs fonctions.

Fait intéressant, en fournissant pour la première fois la reconstruction 3D des néphrons et de leurs vaisseaux environnants, nous avons découvert une contrainte spatiale entre les vaisseaux arqués et un sous-groupe de néphrons. Ainsi, il est concevable de penser que les navires peuvent dicter la voienéphronss'allonger au cours du développement.34,35 L'inspection des formes 3D des néphrons combinée à des simulations informatiques a également révélé que les néphrons ne se mélangent jamais et que chaque néphron a tendance à se situer dans un plan. La signification fonctionnelle de cette observation reste à élucider.

Développement de kystes pendantpolykystose rénaleest toujours un processus intrigant. Le NPHP, une condition pathologique caractérisée par le développement de kystes, est la maladie génétique la plus courante causant une insuffisance rénale terminale chez les enfants et les adolescents. Vingt gènes NPHP ont été identifiés à ce jour.36 Parmi eux, NEK8 code pour un membre de la famille des kinases liées à la mitose A, qui joue un rôle dans la fonction des cils et la progression du cycle cellulaire.37 Nek8 a été initialement caractérisé comme le gène muté dans souris jck.32 Notamment, il a été démontré qu'une mutation dans le même domaine protéique conduit à NPHP9 chez l'homme.38 2Des études D ont suggéré que le développement des kystes diffère considérablement entre les différentes formes de maladie polykystique des reins.27,29 En particulier , dans le NPHP, les kystes semblent provenir exclusivement de CD et de DCT.31 Bien qu'informatives, ces études immunohistochimiques ne peuvent pas réfuter la possibilité que la perte de marqueurs tubulaires spécifiques39 explique artificiellement cette observation. Ainsi, notre étude 3D fournit la première preuve claire que le développement du kyste est un processus qui peut impliquer uniquement des segments de néphron spécifiques. Fait intéressant, bien que NIMA (Never In mitosis gene A) – Related Kinase 8 (NEK8) soit exprimé dans le cytoplasme de tous les segments de néphron, son expression dans les cils est limitée au DCT et au CD. Parce que seuls ces segments sont susceptibles de développer des kystes,31 nous pouvons postuler que la perturbation de la fonction ciliaire NEK8 est l'événement crucial pour la formation de kystes. Curieusement, nous avons également observé que les kystes fusiformes sont en continuité avec les tubules normaux non dilatés. Le fait qu'une mutation germinale récessive ne conduise à un phénotype pathologique que dans un sous-ensemble de cellules suggère qu'un deuxième événement pourrait déclencher le développement de kystes dans ces cellules, comme suggéré pour la polykystose autosomique dominante.maladie du rein.40,41

Nous avons également observé que l'élargissement du kyste est plus prédominant dans les JN que dans les SN, du moins en considérant les kystes qui se situent entre PT et CNT. De manière constante, il a été rapporté que dans le contexte de la glomérulosclérose, les lésions glomérulaires se retrouvent plus fréquemment chez les JN que chez les SN.1,21,42 Si le surmenage dû à l'augmentationnéphronles taux de filtration glomérulaire et les activités de transport/enzymatiques expliquent la susceptibilité accrue des JN à se détériorer est une hypothèse intéressante qui mérite une enquête plus approfondie.

En résumé, nous décrivons une nouvelle technique pour imager les reins en 3D avec une spécificité et une résolution moléculaires suffisantes pour enregistrer directement la distribution spatiale et quantitative des structures internes spécifiquement étiquetées (néphrons, vaisseaux et kystes). Compte tenu de la commodité, de la rapidité et de la capacité de quantification directe, nous prévoyons que cette technique deviendra un outil puissant pour comprendre la physiopathologie rénale.

Figure 6|La reconstruction tridimensionnelle (3D) du néphron révèle que les kystes ne se développent que dans des segments de néphron spécifiques. (a) Images 3D représentatives avec rendu du volume de kyste d'un néphron entier (panneaux de gauche) des glomérules au canal collecteur dans le cortex superficiel (bleu), le cortex moyen (vert) et la région juxtamédullaire (rouge) chez les souris jck. Segmentation des néphrons (panneaux de droite) pour les 3 différents types de néphrons. Barre ¼ 150 mm. ( b ) Probabilité de développer des kystes dans les différents segments de néphron chez les souris jck. (A continué)

Figure 6|(Suite) L'axe horizontal est une longueur normalisée de néphrons correspondant à 50 bacs (tubule proximal [PT], turquoise ; anse de Henle [HL], blanc ; tubule contourné distal [DCT], rose ; tubule de connexion [CNT], jaune) . ( c ) Images de reconstruction de kystes 3D représentatives avec rendu du volume de kyste du membre ascendant de HL (panneaux de gauche), DCT (panneaux du milieu) et CNT et canaux collecteurs corticaux (CCD) (panneaux de droite) en surface (panneaux supérieurs), milieu (panneaux du milieu) et des néphrons juxtamédullaires (panneaux inférieurs) chez les souris jck. Barre ¼ 50 mm.

MÉTHODES

Animaux

Toutes les procédures animales ont été approuvées par les "Services Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" et par le comité d'éthique de l'Université Paris Descartes. Des souris FVB/N âgées de deux mois (n=20) ont été utilisées pour mettre en place les conditions expérimentales de compensation rénale. L'étude a ensuite été réalisée chez des souris mâles jck âgées de 2-semaines (n ¼ 4) et des compagnons de portée témoins (n ​​¼ 3).

Préparation des tissus rénaux

Avant de tuer, les souris ont été perfusées, par cathétérisme intracardiaque, avec 25 ml de solution saline héparinée (1000 UI/l) suivis de 75 ml de paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les expériences ont été menées sous anesthésie à la xylazine (Rompun 2 %, Bayer, Leverkusen, Allemagne, 6 mg/g de poids corporel) et à la kétamine (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, France, 120 mg/g de poids corporel).

Pour les études de compensation, les reins ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 4 heures et intégrés dans de l'agarose à 4 % et des sections de 1,5- mm d'épaisseur entourant le hile rénal ont été coupées et stockées dans du PBS à 4 °C.Sections de reinont d'abord été colorées puis effacées.

Pour les études immunohistochimiques sur coupes minces,reinsont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit et des sections incluses dans la paraffifine et 4- mm ont été coupées.

Coloration

Acide périodique–Schiff coloration. Les coupes de rein de 1,5-mm ont été incubées dans de l'acide périodique Schiff pur ou dilué à 1:100 avec du PBS pendant 5 minutes à température ambiante avant d'être nettoyées.

Immunohistochimie sur coupes minces incluses en paraffine. Des coupes de quatre micromètres de reins inclus en paraffifine ont été chauffées pour la récupération de l'antigène et incubées pendant une nuit à 4 ° C avec des lectines couplées au flfluorochrome pour tracer les tubules (rhodamine agglutinine d'arachide [RL -1072-5] et rhodamine agglutinine de germe de blé [RL {{ 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, dilué à 1 :200) et un anticorps primaire spécifique au segment pour représenter des segments tubulaires distincts (lectine de Lotus tetragonolobus biotinylée [B-1325], Vector Laboratories, dilué à 1 : 100 ; souris anti-Calbindin D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Allemagne, dilué à 1 :200 ; chèvre anti AQP2 [C-17], Santa Cruz, dilué à 1 :200) . Le lendemain, les coupes ont été incubées avec l'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante (conjugué Alexa Fluor 488 [S32354], Invitrogen; antigoat Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-souris Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA ; le tout dilué à 1:500) avant d'être coloré avec du 40,6-diamidino-2-phénylindole. Toutes les images ont été acquises avec un microscope Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne, France) et préparées à l'aide du logiciel FiJi (version 1.50).

Coloration à la lectine sur coupes épaisses. Les coupes de rein de 1,5- mm d'épaisseur ont été incubées à 4 C pendant 1 mois dans des lectines couplées au rouge Texas ou à l'isothiocyanate de fluorescéine : agglutinine d'arachide (RL-1072-5) et agglutinine de germe de blé (RL{{6} }), dilué à 1:100 dans 0,1 % d'azoture de PBS et 0,1 % de Triton-X. Les sections ont ensuite été lavées tous les jours pendant 2 semaines avec du PBS avant d'être nettoyées.

Dégagement optique

Pour la compensation des écailles, des sections de rein de 1,5- mm ont été incubées dans ScaleA2 (urée 4 M, 0.1 % Triton X-100, 10 % glycérol) ou ScaleB4 (8 M d'urée, 0,1 % de Triton X-100) pendant 2 semaines, jusqu'à 1 an, à 4 C.

Pour la compensation BABB, des sections de rein de 1,5- mm ont été déshydratées dans des rinçages séquentiels d'éthanol à température ambiante. Les échantillons ont ensuite été incubés dans BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) dans un rapport 1:2 pendant au moins 2 jours à 4 C.

Acquisition d'images en microscopie biphotonique

Les tissus ont été imagés avec un gel aqueux sur un microscope multiphoton inversé (LaVision BioTec) équipé d'un laser Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Figure supplémentaire S1A). La longueur d'onde d'excitation était de 815 nm à 8 % de puissance. Nous avons utilisé un objectif à immersion dans l'eau 20 (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokyo, Japon] ; ouverture numérique, 0,95 ; distance de travail, 2,0 mm). Pour l'acquisition de la fluorescence, nous avons utilisé un détecteur non décanné à 80 % avec un fifiltre passe-bande 593/40 nm.

La première étape consistait en l'acquisition d'images en mosaïque 2D au milieu de la pile z en utilisant des paramètres d'acquisition sous-optimaux (400 mm 400 mm et 1 011 1 011 pixels, avec un chevauchement de 10 % et une ligne moyenne à 2) pour guider la sélection des champs centraux les plus pertinents. (Figure supplémentaire S9A). Une fois la grille xy et les champs d'intérêt z définis, les paramètres ont été ajustés pour acquérir des images de haute qualité. Une telle approche a réduit la région d'intérêt à 5 12 fifields par pile z. Ensuite, nous avons acquis 850 piles z/tranches optiques (taille de pas de 1- mm) entourant le hile rénal dans la partie médiane dusection de rein.

Assemblage, traitement et traçage d'images

Chaque pile a été carrelée selon la méthode développée par Preibisch et al., 43 qui permet l'assemblage d'une large collection d'images en utilisant le plugin "Grid/Collection stitching" du logiciel Fiji (http://fifiji.sc/Fiji) . Parce que nous avons observé un décalage important entre 2 images adjacentes après l'assemblage, nous avons écrit un programme d'appariement personnalisé en Python. Ce programme compense le décalage d'image, nous permettant d'aligner correctement les images (Figure supplémentaire S9B). Les images cousues corrigées ont été analysées à l'aide de la version 8.4.2 d'Imaris (Bitplane, Zurich, Suisse). Les tubules et les vaisseaux ont été tracés à l'aide du mode manuel du package de traceurs de fifilaments d'Imaris et joints par un Imaris Xtension que nous avons développé avec MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Join{{12 }} Filament_Tool.zip?dl¼0) (Figure supplémentaire S9C). Les glomérules et les kystes ont été reconstruits en 3D en utilisant le mode manuel du package de surface d'Imaris. L'organisation spatiale des glomérules 3D a été affichée en utilisant le mode manuel du package de spots d'Imaris.

Morphométrie

La longueur du segment tubulaire, la longueur du néphron et la rectitude ont été déterminées à l'aide du package de traceurs de fifilaments d'Imaris. Selon le logiciel Imaris, la rectitude a été quantifiée comme le rapport entre la distance entre 2 points et la longueur du trajet du segment de néphron. Trente et un PT et 12 néphrons entiers ont été reconstruits et mesurés chez 3 souris de type sauvage, tandis que 37 PT et 17 néphrons entiers ont été reconstruits et mesurés chez 4 souris jck. Kyste et

les volumes glomérulaires ont été déterminés à l'aide du "package de surface" d'Imaris. Trente et un et 34 glomérules ont été mesurés chez des souris de type sauvage et jck, respectivement. Soixante-quatorze kystes ont été mesurés au total.

Les angles "hors du plan" des virages tubulaires (indiqués par "bêta") ont été mesurés entre le plan (défini par 3 points consécutifs) et la direction avec le quatrième point consécutif suivant dans l'espace (Figure 5b). Pour évaluer la signification statistique du biais observé, nous avons simulé la distribution des angles bêta avec une rotation aléatoire des angles bêta (simulation de Monte Carlo) dans des structures composées des mêmes segments avec le même ensemble d'angles alpha.

Pour le calcul de la probabilité de développer une lésion kystique le longnéphronsegments, nous avons représenté chaque néphron par un ensemble de points dans l'espace. Chaque point était annoté en fonction de la présence de kyste par rapport à la structure normale et du type de segment. La probabilité à chaque longueur standardisée (fixée à 50 bacs) a été calculée comme le rapport entre le nombre de points avec annotation kystique et le nombre total de points dans le bac.

Pour le calcul de l'interdistance glomérulaire moyenne, nous avons considéré pour chaque glomérule l'interdistance glomérulaire moyenne calculée sur les 5 glomérules les plus proches.

Analyses de données et statistiques

Les données sont exprimées en moyenne SEM. Les différences entre les groupes expérimentaux ont été évaluées à l'aide d'une analyse de variance suivie, lorsqu'elles sont significatives (P <{{0}}.05), du="" test="" de="" tukey-kramer.="" lorsque="" seulement="" 2="" groupes="" ont="" été="" comparés,="" le="" test="" de="" mann-whitney="" a="" été="" utilisé.="" les="" analyses="" statistiques="" ont="" été="" effectuées="" à="" l'aide="" du="" logiciel="" graph="" prism="" (san="" diego,="" ca,="" version="">

DIVULGATION

Tous les auteurs n'ont déclaré aucun intérêt concurrent.

REMERCIEMENTS

Nous remercions le Laboratoire d'Expérimentation Animale et Transgenèse (LEAT), les Plateformes d'Histologie et d'Imagerie de la Structure Fédérative de Recherche Necker pour l'assistance technique. Nous remercions Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler et Nicolas Kuperwasser pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, l'Université Paris Descartes, l'Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, l'Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, Roche Pharma Research and Early Development (Bâle , Suisse) et Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Paris, France).

LES CONTRIBUTIONS DE L'AUTEUR

TB, NG et MZ ont conçu et réalisé les expériences et analysé les données. FB, LT, MGT et SG ont également effectué des expériences et analysé les données. MB et CN ont réalisé les expériences sur la souris. TB et MZ ont également contribué à la rédaction du manuscrit. GF a révisé le manuscrit. FT et MP ont fourni le cadre conceptuel et conçu l'étude, supervisé le projet et rédigé l'article.

cistanche peut tonifier les reins

MATÉRIEL COMPLÉMENTAIRE

Fichier supplémentaire (PDF)

Figure S1. Montage expérimental, procédure d'acquisition et traitement d'image.

Figure S2. Limites du signal d'autofluorescence dans les résolutions xy et z.

Figure S3. Image bidimensionnelle de la transition entre PT et TL sur des coupes de rein de 4- mm incluses en paraffine.

Figure S4. Image bidimensionnelle de la transition entre TAL et DCT sur des coupes de rein de 4- mm incluses en paraffine.

Figure S5. Image bidimensionnelle de la transition entre DCT et CNT sur des coupes de rein de 4- mm incluses en paraffifine.

Figure S6. La reconstruction tridimensionnelle révèle 3 formes différentes de tubules proximaux.

Figure S7. La reconstruction tridimensionnelle révèle que la longueur et la segmentation des néphrons ne sont pas affectées par les kystes.

Figure S8. Densité des glomérules dans les reins témoins et kystiques.

Figure S9. Procédure d'acquisition et traitement d'image post-traitement.

Tableau S1. Comparaison des méthodes de compensation. Fichier supplémentaire (Films)

Film S1. La coloration à la lectine améliore nettement la résolution et le rapport signal sur fond.

Film S2. Tracé du trajet d'un tubule.

Film S3. Reconstruction tridimensionnelle d'un rein dégagé montrant la jonction entre le tubule proximal et la branche fine de l'anse de Henle.

Film S4. Reconstruction tridimensionnelle d'un rein dégagé montrant la jonction entre la branche ascendante épaisse de l'anse de Henle et le tubule contourné distal.

Film S5. Reconstruction tridimensionnelle d'un rein dégagé montrant la jonction entre le tubule contourné distal et le tubule de connexion.

Film S6. La forme et la taille des tubules proximaux diffèrent selon leur profondeur.

Film S7. Reconstruction tridimensionnelle du néphron chez des souris témoins.

Film S8. Traçage du trajet d'un vaisseau d'un vaisseau arqué à un vaisseau cortical radié.

Film S9. Les vaisseaux arqués modélisent la forme des tubules proximaux juxtamédullaires.

Film S10. Les néphrons ont tendance à se trouver dans un plan.

Film S11. La reconstruction tridimensionnelle du néphron montre un modèle spécifique de développement du kyste.

Film S12. La segmentation tridimensionnelle du néphron révèle que les kystes se développent dans des segments de néphron spécifiques.

Film S13. Disposition spatiale et interrelations des néphrons et des vaisseaux dans un rein polykystique

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