Maladie rénale : comment le nickel induit-il l'autophagie dans le rein ?

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Partie Ⅰ : Le nickel induit l'autophagie via les voies PI3K/AKT/mTOR et AMPK dans le rein de souris

Heng Yin, Zhicai Zuo & et al.

1. Introduction

Nickel(Ni), un élément naturel, est largement distribué dans les compartiments environnementaux, notamment le sol, l'eau et l'air (Schrenk et al, 2020). Ni (Nickel)composés et Ni métallique (Nickel)ont de nombreuses applications industrielles et commerciales, telles que la production d'alliages, la galvanoplastie, les batteries nickel-cadmium et les catalyseurs dans l'industrie chimique et alimentaire (Genchi et al., 2020). Cependant, la vaste utilisation industrielle de Ni (Nickel)conduit à une pollution environnementale généralisée, ce qui augmente le risque d'exposition humaine au Ni par l'alimentation et l'eau potable (Das et al, 2018). Bien que Ni (Nickel) est un micronutriment essentiel pour les humains et les animaux, une surexposition au Ni est extrêmement dangereuse pour la santé humaine (Das et al., 2018).

Avec l'incidence croissante de Ni (Nickel)contamination au cours des dernières années, la toxicologie du Ni, y compris l'immunotoxicité, l'hépatotoxicité, la néphrotoxicité et la toxicité pulmonaire, a attiré une attention croissante (Gathwan et al., 2013 ; Deng et al., 2016 ; Hasanein et Felegari, 2017 ; Guo et al., 2020a 2020b). Laun rein, en tant qu'organe cible important de Ni (Nickel)toxicologie, avec une accumulation de Ni (Nickel)et Ni (Nickel)les composés qui y sont contenus par une exposition chronique peuvent induire des lésions rénales importantes (Elangovan et al, 2018). Les recherches existantes de notre équipe de recherche ont démontré l'induction du stress oxydatif, de l'apoptose, de l'inflammation et de l'arrêt du cycle cellulaire dans leun reindes poulets de chair par NiCl2 (Nickelchlorure 2) dans les aliments dépassant 300 mg/kg (Guo et al, 2014, 2016a,2016b). Plusieurs études ont suggéré que le mécanisme de la toxicologie rénale du Ni comprend des dommages oxydatifs, des ruptures de brins d'ADN et l'apoptose (Lee et al, 2001 ; Chen et al., 2010).

Jouant un rôle crucial dans l'homéostasie cellulaire,autophagiea été trouvé pour avoir une association avec l'incidence et la pathogenèse de diverses maladies (Martin et al, 2019). Des études récentes ont montré que la mort cellulaire peut être intermédiaire par une stimulation incontrôlable ou excessive deautophagie(Denton et Kumar, 2019). En tant que processus intracellulaire complexe et hautement ordonné,autophagiecommence par la formation de vésicules à double membrane appelées autophagosomes engloutissant une partie du cytosol et des organites (Martin et al, 2019). Par la suite, les autophagosomes participent à la protéolyse des substances englouties après passage aux lysosomes.

Autophagieest sensible à divers types de stress cellulaire, tels que la croissance ou la privation de facteurs nutritifs, l'hypoxie, les dommages à l'ADN, les espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'agrégation des protéines, les agents pathogènes intracellulaires ou les dommages aux organites (Dodson et al, 2013). C'est un processus extrêmement complexe à régulerautophagie, impliquant de nombreuses voies de signalisation, y compris la protéine kinase activée par l'adénosine monophosphate (AMPK), la phosphatidylinositol 3- kinase-I (PI3K) et les voies de la cible mammifère de la rapamycine (mTOR) (Cao et al2021). Et, la voie mTOR a un effet pivot dansautophagieinitiation. L'activité mTOR est un point de contrôle central deautophagie, dont l'effet inhibiteur conduit à la déphosphorylation de ULK1 soulageantautophagieinhibition (Parzvch et Klionsky, 2014). De plus, PI3K/Akt et AMPK sont les principaux régulateurs en amont de mTOR (Gong et al, 2020 ; Xu et al, 2020). Des recherches antérieures ont suggéré que les métaux lourds (tels que Cd, Hg, Cu et Pb) peuvent induire l'apparition deautophagie(Su et al, 2017). Bien que Huang et al. (2016) et Son et al. (2017) ont trouvé que Ni (Nickel)l'exposition pourrait induire efficacementautophagiedans les cellules épithéliales bronchiques, le mécanisme précis n'est pas encore clair,

L'effet de Ni (Nickel)surautophagiea été rarement rapportée, et seules quelques études sont disponibles sur les effets du Ni sur la fonction rénale.autophagiede souris in vivo. Par conséquent, les travaux en cours visent à confirmer si NiCl2 (Nickelchlorure 2)le traitement peut induireautophagieet d'évaluer le mécanisme potentiel de NiCl (Nickelchlorure)-induitautophagie, y compris les voies AMPK et PI3K/AKT/mTOR.

Le nickel affecte les reins et provoque des maladies rénales

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2. Matériels et méthodes

2.1. Produits chimiques et anticorps

Nickelchlorure(NiCl) a été fourni par Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd (Chengdu, Chine). Dans l'analyse par immunoblot, tous les anticorps ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology (CST, États-Unis), y compris la chaîne légère 3B (LC3B) de la protéine1 associée aux microtubules de lapin (n ° de catalogue 43566T), p62 anti-lapin (SQSTM1) (Cat n° 5114D), anti-lapin Beclin1 (Cat n° 3495T), anti-lapinautophagieprotéine apparentée12 (Atg12) (Cat n° 4180T), anti-lapin Atg5 (Cat n° 12994T), anti-lapin Atg16L1 (Cat n° 8089T), anti-lapin Atg7 (Cat n° 8558T), anti-lapin Atg3 ( Cat n° 3415T), anti-lapin mammifère cible de la rapamycine (mTOR) (Cat n° 2983T), anti-lapin p-mTOR (Cat n° 5536T), anti-lapin unc-51 comme la kinase 1 (ULK1 )(Réf. 8054D), anti-lapin p-UIK1 (Réf. 5869T), anti-lapin PI3K (Réf. 4292S), anti-lapin p PI3K (Réf. 4228T, anti-lapin Akt (Réf. .9272S), anti-lapin p-Akt (Cat n° 4060T), anti-lapin mTOR (Cat n° 2972S), anti-lapin p-mTOR (Cat n° 5536S), anti-lapin AMPK (Cat n° 5831S ), anti-lapin p-AMPK (Cat n° 2535S) et -actine (Cat n° 4970T).

2.2.Animaux et traitements

Au total, 160 souris ICR mâles en bonne santé âgées de huit semaines ont été fournies par Dashuo Biological Technology Company (Chengdu, Chine). Tous les animaux ont été maintenus dans des conditions constantes (température 25 ± 2 C ;12-h cycle lumière-obscurité) dans des environnements aseptiques, et nourris avec un régime de granulés standard et de l'eau ad libitum. Les souris ont été classées au hasard en quatre groupes, chacun contenant quarante micros après une acclimatation de sept jours. De l'eau distillée a été administrée par voie intragastrique au témoin, tandis que Ni (Nickel)(NiCl2 (Nickelchlorure 2).6H2O) avec des doses de 7,5, 15 et 30 mg/kg a été administré par voie intra-gastrique aux animaux des groupes expérimentaux. Le Ni adopté ici a été déterminé en fonction de la valeur de la dose létale médiane (LD50, 306,11 mg/kg) atteinte dans la recherche sur la toxicité orale aiguë des souris mâles. NiCl (Nickelchlorure),.6HZO a été dilué en utilisant de l'eau distillée avant de mener des expériences. Les quatre groupes ont reçu une dose de gavage de 1 ml par 100 g de poids corporel une fois par jour pendant 28 jours. Après un traitement de 14 et 28 jours, tous les animaux ont été sacrifiés sans cruauté pour recueillir leurun reinéchantillons pour analyse dans les sections ci-dessous. Tous les animaux expérimentaux et les procédures ont été menés conformément à l'accord ayant reçu l'approbation du comité de protection des animaux et d'éthique de l'université agricole du Sichuan (n° d'approbation :2012-024, Chengdu, Chine).

2.3. Détermination de l'index et des fonctions des reins

Toutes les souris ont été pesées chaque semaine et sacrifiées sans cruauté à la fin du traitement, puisreinsont été découpés et pesés. Laun reinl'indice utilisé était un rapport entreun reinpoids et poids corporel.

Les chercheurs ont mesuré l'azote uréique du sang (BUN) et les niveaux de créatinine sérique (CRE) en suivant les instructions des kits commerciaux produits par le Naniing Jiancheng Bioengineering Institute of China (Nanjing, Chine),

2.4. Détermination de l'accumulation rénale de Ni (Nickel)

Un reindes échantillons ont été prélevés le 28e jour de l'expérience. Ensuite, 1 mL HClO et 9 mL HNO. (Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd., Chine) ont été utilisés pour digérer par voie humide 0 une portion de 0,5 g d'échantillons pendant 24 h dans des tubes résistants aux hautes températures. Ensuite, ces tubes ont été placés sur une plaque chauffante pour évaporer tout le liquide, suivi d'une suspension du résidu en utilisant 10 mL 0,1 M/L HNO. Ensuite, les chercheurs ont analysé des échantillons en termes de Ni (Nickel)à l'aide d'un spectrophotomètre d'absorption atomique à flamme (AAS700, PerkinElmer, USA).

2.5. Observation histopathologique et ultrastructure

Après avoir été recueilli puis fixé dans du paraformaldéhyde à 4 %, leun reinles échantillons ont été déshydratés avec de l'alcool, inclus dans de la paraffine, tranchés à 5 um et traités pour colorer avec de l'hématoxyline et de l'éosine. Un appareil photo numérique (Nikon DS-Ri1, Japon) a été utilisé pour observer les tranches et prendre des photographies pour les changements histopathologiques. Dix champs microscopiques de chaqueun reinont été revus. Les images affichées dans le journal étaient les plus représentatives.

Pour l'évaluation ultrastructurale, du glutaraldéhyde à 2,5 % a été appliqué pour la fixationun reintissus (environ 1 mm5) à température ambiante. Cela a été suivi d'une post-fixation de ces tissus dans du tétroxyde d'osmium à 1 %, déshydratés dans de l'acétone et noyés dans de la résine époxy. Les tranches ultra-minces préparées ont été placées sur des grilles de cuivre puis colorées à l'aide d'acétate d'uranyle et d'acétate de plomb. Les images d'ultrastructure ont été capturées à l'aide d'un microscope électronique à transmission flash JEM -1400 (JEOL, Japon).

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2.6. Immunohistochimie

Après avoir été déparaffinées à l'aide de xylène, les tranches de paraffine ont été réhydratées à l'aide d'un ensemble gradué de solution d'éthanol. Cela a été suivi d'un lavage avec de l'eau distillée et du PBS, et d'un blocage de 15 minutes des activités de peroxydase endogène (EPA) par incubation en utilisant 3% de H, O. dans du méthanol pour tremper l'EPA. Pour faciliter la récupération de l'antigène, nous avons traité les tranches par chauffage aux micro-ondes pendant 15 min dans 0.0 Tampon citrate de sodium 1 M avec un pH de 6,0. Après avoir été saturé par du sérum de chèvre normal à 10 % pendant 30 min, les tranches ont ensuite subi une incubation en utilisant des anticorps primaires pendant une nuit à 4 degrés. L'anticorps secondaire IgG anti-lapin/souris biotinylé à 1 % de chèvre (Boster, Wuhan, Chine) a été utilisé pour incuber des tranches lavées avec du PBS à 37 degrés pendant 1 h, puis à 37 degrés, le complexe streptavidine-biotine (SABC ; Boster , Wuhan, Chine) a été utilisé pendant 30 min. Cela a été suivi par l'immersion des tranches dans du chlorhydrate de diaminobenzidine (DAB; Boster, Wuhan, Chine) pour la visualisation de l'immunoréaction. Enfin, après une légère contre-coloration à l'hématoxyline, les tranches ont été déshydratées à l'éthanol, clarifiées au xylène et montées, successivement.

La densité optique intégrée (IOD) a été utilisée pour la quantification des niveaux de protéines de LC3B et p62. La méthode analytique pour la valeur IOD fait référence à Fanget al.(2018). Un système de caméra de microscope numérique Nikon DS-Ril (Japon) a été adopté pour prendre des images. Les chercheurs ont ensuite sélectionné cinq champs (0.064 mm²) dans chaque zone d'images de chaque tranche pour analyse à l'aide du logiciel Image-Pro Plus v6.0 (Media Cy-bernetics Inc, Bethesda, MD, USA ).

2.7. Western blot

Extraction de protéines deun reinéchantillons a été réalisée en utilisant un tampon de lyse RIPA et le réactif de dosage de protéines BCA (P0010S, Beyotime Technology, Chine) a été utilisé pour mesurer la concentration. La SDS-PAGE a ensuite été réalisée pour les échantillons de protéines, qui ont ensuite été transférés sur des membranes de nitrocellulose. Bloquées à l'aide de lait écrémé à 5% pendant 1 h à température ambiante, les membranes ont été incubées avec l'anticorps primaire à 4 degrés pendant la nuit. Après avoir utilisé un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort pour incuber pendant 1 h, un Chemidoc XRS a été utilisé pour détecter les bandes de protéines sur les membranes à l'aide du kit ECL (P0018A, Beyotime Technology, Chine).

2.8. Réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (qRT-PCR)

Reinsont été prélevés et broyés avec de l'azote liquide dans un mortier à l'aide d'un pilon puis conservés à basse température (-80 degré), l'ARN total rénal a été extrait à l'aide d'ARNiso Plus (9108/9109, Takara, Otsu, Japon) suivant les recommandations de le fabricant. Cela a été suivi par la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc) avec un kit de réactifs RR047A Prim-ScriptTM RT produit par Takara au Japon en suivant les instructions. Par la suite, la qRT-PCR a été réalisée à l'aide d'un système de PCR en temps réel LightCycler ⑩ 480 (Bio-Rad, États-Unis) et d'un kit SYBR Premix Ex TaqTMII (DRR820A, Takara, Japon). Les amorces utilisées pour une PCR sont répertoriées dans le tableau 1. La -actine a été utilisée pour la normalisation de l'expression génique et l'expression relative de l'ARNm a été calculée par la méthode 2-4ac (Livak et Schmittgen, 2001).

2.9. analyses statistiques

Les données ont été exprimées sous forme de moyenne ± écart-type et analysées par LSD ou analyse de variance T3 de Dunnett. Le logiciel SPSS (version 22.0, IBM Corp, Armonk, NY, USA) a été utilisé pour toutes les analyses statistiques pour Windows. P<0.05 represents="" a="" significant="">

Tableau 1 : La séquence des amorces utilisées dans l'étude,

3. Résultats

3.1.NiClz (Nickelchlorure)altère la fonction rénale

Comme le montre la figure 1A, le poids corporel a diminué dans trois groupes traités avec NiCl2 (Nickelchlorure 2). Et, une diminution significative a également été constatée dans le poids relatif desun rein(P<0.05) in="" the="" 30="" mg/kg="" group="" at="" 28="" days="" (fig.="">

CRE et BUN sériques ont été utilisés comme biomarqueurs standard pour la fonction rénale. Les résultats de la fonction rénale ont été affichés dans les Fig.1C et D, et les concentrations de CRE et de BUN ont été significativement augmentées (P<0.05)in the=""> (Nickelchlorure 2)-groupes de traitement aux jours 14 et 28 apparentés au témoin.

La Fig.1E a montré que les trois Ni (Nickel)les groupes de traitement ont des concentrations significativement plus élevées de Ni dans les reins (P<0.05)compared to="" the="">

3.2. NiCl (Nickelchlorure)- induit des variations histopathologiques du rein

La figure 2 montre que NiClz (Nickelchlorure)le traitement a provoqué des variations histopathologiques de laun reinavec des doses et du temps, impliquant un glomérule gonflé avec un espace capsulaire rétréci, la dégénérescence vacuolaire et granulaire dans l'épithélium tubulaire rénal.

Figure 2. NiCl2 (Nickelchlorure 2)induit des changements histopathologiques dans le rein.

Les lésions histopathologiques comprenaient un glomérule gonflé avec un espace capsulaire rétréci (*), une dégénérescence vacuolaire (flèches noires) et une dégénérescence granulaire (flèches blanches) dans les épithéliums tubulaires rénaux. Coloration HE, barre d'échelle=50 µm.

3.3.NiCl (Nickelchlorure)induit l'autophagie et augmente les gènes et les protéines liés à l'autophagie dans le rein

LC3 et p62 sont les biomarqueurs cruciaux deautophagie(Gomez-San-chez et al..2016). Par rapport au témoin, les trois NiCl2 (Nickelchlorure 2) les groupes de traitement ont été témoins d'une augmentation significative du taux de protéines de LC3-I/I (P< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28,="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" protein="" level="" of="">< 0.05)(fig.3a-c).="" inconsistent="" with="" the="" protein="" experiment="" results,="" relative="" to="" the="" control="" group(fig.="" 3d="" and="" e),="" the="" treatment="" groups="" showed="" significantly="" increased="" mrna="" expression="" level="" of="" lc3=""><0.05)and significantly="" decreased="" mrna="" expression="" level="" of=""><0.05). otherwise,="">autophagieest également la détermination par TEM dans cette étude. Comme le montre la figure 3F, les observations TEM ont montré que le nombre d'autolysosomes était augmenté dans le tissu rénal après NiCl2 (Nickelchlorure 2)exposition.

Figure 3. NiCl2 (Nickelchlorure 2)augmente l'autophagie dans le rein des souris.

(A) Les résultats de Western blot de LC3 et p62. (B, C) La quantification de LC3-II/I et p62. (DE) L'expression de l'ARNm de LC3 et p62. (F)

La structure ultrastructurale de la cellule épithéliale du tubule contourné proximal (les figures de droite montrant l'agrandissement partiel des figures de gauche ; les flèches noires indiquant les structures des autolysosomes).

Les valeurs sont présentées avec la moyenne ± l'écart type (n {{0}}). Les colonnes marquées de lettres différentes sont des différences significatives (P <>

De plus, l'immunohistochimie a été utilisée pour mesurer les niveaux de protéines de LC3B et p62 dans leun reintissu dans la présente étude. Comme le montre la figure 4, les cellules positives colorées en brun et le LC3B et le p62 étaient principalement exprimés dans le cytoplasme des cellules épithéliales des tubules rénaux. En comparaison avec le contrôle, les valeurs IOD de LC3B ont montré une augmentation significative (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Nickelchlorure) aux jours 14 et 28. De plus, les valeurs IOD de p62 ont été significativement diminuées (P< 0.05)in="" these="" three="" treatment="" groups="" on="" days="" 14="" and="" 28="" when="" in="" comparison="" with="" the="">

Fig. 4. Résultats d'immunohistochimie de LC3B et p62 dans le rein de souris.

(A) Les images d'immunohistochimie de LC3B. (barre d'échelle=50 µm) (B) Les images d'immunohistochimie de p62 (barre d'échelle=50 µm)

(C) La densité optique intégrée (IOD) de LC3B. (D) La densité optique intégrée (IOD) de p62.

Les valeurs sont présentées avec la moyenne ± l'écart type (n {{0}}). Les colonnes marquées de lettres différentes sont des différences significatives (P <>

Gènes et protéines liés àautophagieet impliqué dans laautophagieflux ont été mesurés pour vérifier davantage les effets de NiCl (Nickelchlorure) surautophagie. Ceux-ci comprenaient Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 et Atg3 (Li et Zhang.2019 ; Nishimura et Tooze, 2020). Comme le montre la Fig.5A-C, par rapport au contrôle, les groupes de traitement de Ni (Nickel)montrent des niveaux significativement plus élevés de protéines de Beclinl, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 et Atg3(P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" additionally,="" the="" treatment="" groups="" of="" ni="" also="" exhibited="" significantly="" elevated="" mrna="" expressions="" of="" beclin1,="" atg5,="" atg12,="" atg16l1,="" atg7,="" and=""><0.05)on days="" 14="" and="" 28="" of="" the="" experiment="" (fig.6d-e)relative="" to="" the="">

Figure 5. NiCl2 (Nickelchlorure 2)augmente les gènes et les protéines liés à l'autophagie dans le rein des souris.

(A) Les résultats de Western blot de Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 et Atg3. (B&G) La quantification de l'expression des protéines Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 et Atg3.

(HM) L'expression de l'ARNm de Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 et Atg3. Les valeurs sont présentées avec les moyennes ± écart type (n=8). Les colonnes marquées de lettres différentes sont des différences significatives (P <>

3.4.NiCl2 (Nickelchlorure 2)induit les voies PI3K/Akt/mTOR et AMPK dans le rein

mTOR est un régulateur essentiel deautophagie(Wang et al., 2017). Et les voies de régulation en amont bien établies de mTOR incluent PI3K/Akt et AMPK (Gong et al..2020 : Xu et al..2020). Ainsi, cette étude a mesuré la protéine des voies AMPK et PI3K/Akt.

Comme Fg.6A et B montrent que les niveaux de protéines de p-PI3K, p-AKT et p-mTOR se sont avérés avoir une diminution significative (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Nickelchlorure 2)aux jours 14 et 28 de l'expérience par rapport au témoin. Les groupes de traitement présentaient des niveaux de protéines de p-AMPK et p-ULK1 significativement plus élevés (P<0.05)than those="" of="" the="" control="" on="" days="" 14="" and="" 28.="" it="" can="" be="" seen="" from="" fig.6="" chat,="" compared="" to="" the="" control.="" the=""> (Nickelchlorure 2)-les groupes de traitement présentaient une diminution significative des expressions d'ARNm de PI3K, AKT et mTOR (P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" ampk="" and="" ulk1="" of="" the="" treatment="" groups="" showed="" significant="" increases="" in="" mrna="">< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28="" in="" comparison="" with="" the="" control.="">Ces résultats révèlent queautophagieinduit par NiCl2 (Nickelchlorure 2)dans le rein de souris impliquait les voies AMPK et PI3K/Akt/mTOR.

Figure 6. NiCl2 (Nickelchlorure 2)induit les voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR et AMPK dans les reins de souris.

(A) Les résultats de Western blot de p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p-ULK1 et ULK1.

(BF) La quantification de l'expression des protéines p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-AMPK/AMPK, p-mTOR/mTOR et p-ULK1/ULK1. (G, K)

L'expression de l'ARNm de PI3K, AKT, AMPK, mTOR et ULK1. Les valeurs sont présentées avec les moyennes ± écart type (n=8). Les colonnes marquées de lettres différentes sont des différences significatives (P <>

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