Système Laccase-Mediator utilisant un médiateur naturel comme agent blanchissant pour la décoloration de la mélanine Partie 1

Abstrait: Dans cette étude, un système laccase-médiateur (LMS) utilisant un médiateur naturel a été développé comme agent blanchissant pour la décoloration de la mélanine. Sept médiateurs naturels ont été utilisés pour remplacer les médiateurs synthétiques et surmonter avec succès le faible potentiel redox de la laccase et l'accès limité de la mélanine au site actif de la laccase. L'activité de décoloration de la mélanine des laccases de Trametes versicolor (lacT) et de Myceliophthora thermophila (lacM) a été significativement améliorée à l'aide de médiateurs naturels, notamment l'acétosyringone, le syringaldéhyde et l'acétovanillone, qui ont montré une faible cytotoxicité. Les groupes méthoxy et cétone des médiateurs naturels jouent un rôle important dans la décoloration de la mélanine. Les constantes de spécificité de lacT et lacM pour la décoloration de la mélanine ont été améliorées de 247 et 334, respectivement, lorsque l'acétosyringone a été utilisée comme médiateur. Le LMS utilisant de la dentelle et de l'acétosyringone pourrait également décolorer la mélanine présente dans le film d'hydrogel de cellulose, qui imite l'état de la peau. De plus, le LMS pourrait décolorer non seulement les analogues synthétiques de l'eumélanine préparés par l'oxydation de la tyrosine, mais également la mélanine naturelle produite par les cellules de mélanome.

Selon des études pertinentes,cistancheest une herbe commune qui est connue comme "l'herbe miracle qui prolonge la vie". Son composant principal estcistanoside, qui a divers effets tels queantioxydant, anti-inflammatoire, etpromotion de la fonction immunitaire. Le mécanisme entre cistanche etblanchiment de la peauréside dans l'effet antioxydant du cistancheglycosides. Mélaninedans la peau humaine est produit par l'oxydation de la tyrosine catalysée partyrosinase, et la réaction d'oxydation nécessite la participation d'oxygène, de sorte que les radicaux sans oxygène dans le corps deviennent un facteur important affectant la production de mélanine. Cistanche contientcistanoside, qui est un antioxydant et peut réduire la génération de radicaux libres dans le corps, ainsiinhibant la production de mélanine.

Cliquez sur les avantages de Rou Cong Rong pour le blanchiment

Pour plus d'informations:

david.deng@wecistanche.com WhatApp :86 13632399501

1. Introduction

Les laccases (EC 1.10.3.2, benzènediol : dioxygen oxydoréductases) sont des protéines multicuivres qui catalysent l'oxydation de divers composés phénoliques et non phénoliques via un mécanisme de réaction catalysée par les radicaux par la réduction de l'oxygène moléculaire [1,2]. Les laccases ont été utilisées comme biocatalyseurs pour les processus de biodégradation, tels que la bioremédiation des colorants [3,4], les produits pharmaceutiques [5,6], les herbicides [7] et la délignification [8-10]. Les laccases ont également été utilisées pour catalyser la polymérisation de précurseurs de colorants et de composés organiques [11]. En particulier, leurs propriétés intéressantes, telles qu'une faible spécificité de substrat, l'utilisation de l'oxygène comme accepteur final d'électrons, la génération d'eau comme sous-produit et l'absence de demande (ou de production) de peroxydes, les rendent intéressantes en biotechnologie et domaines environnementaux [1,11,12].

Quatre ions cuivre au site actif sont impliqués dans l'activité catalytique de la laccase. Le cuivre "bleu" (site T1) oxyde le substrat, et l'amas de cuivre trinucléaire (T2/T3) reçoit les électrons du site T1 pour réduire l'oxygène moléculaire [1,12,13]. En particulier, le potentiel redox du site T1 Cu est considéré comme un facteur majeur dans la détermination de la capacité catalytique des laccases [14]. Les laccases possèdent un potentiel redox relativement faible (0.4–0.8 V) par rapport aux peroxydases ligninolytiques (plus de 1 V) telles que la peroxydase de manganèse et la peroxydase de lignine. Les laccases ne peuvent pas oxyder directement les substrats non phénoliques avec un potentiel redox supérieur à 1,3 V [13,14]. Par conséquent, pour surmonter les limites de la laccase, les systèmes laccase-médiateur (LMS) utilisant de petits composés moléculaires, tels que le 2,20 -azinobis(3-éthylbenzthiazoline-6-sulfonate) (ABTS), { {24}}l'hydroxy benzotriazole (HOBt), l'acide violurique (VLA), le N-hydroxy phtalimide (HPI), le N-hydroxy acétanilide (NHA) et le TEMPO, qui agissent comme médiateurs redox, ont été suggérés [15–17].

Ces médiateurs permettent l'oxydation de composés volumineux par différentes voies d'oxydation. Le système laccase-ABTS oxyde les substrats en générant un radical ABTS cationique via un mécanisme de transfert d'électrons (ET). Les LMS avec HOBt, VLA, HPI ou NHA produisent des radicaux nitroxyle via le mécanisme de transfert d'atomes d'hydrogène (HAT) [1, 12, 17]. De plus, des médiateurs tels que TEMPO et ses analogues réagissent via des voies ioniques pour générer des ions oxoammonium [1,12,18]. L'utilisation de ces médiateurs peut oxyder un large éventail de composés dans diverses applications, telles que la dégradation des colorants [3,4], la dégradation des médicaments [5,6] et la dégradation de la lignine [8-10]. Néanmoins, les applications des médiateurs synthétiques dans les domaines industriels ont été limitées en raison de leur toxicité potentielle, de leur coût élevé et de leur effet d'inactivation enzymatique. Récemment, des molécules phénoliques dérivées de la lignine en tant que médiateurs naturels (par exemple, le syringaldéhyde, l'acétosyringone, la vanilline, l'acétovanillone, le vanillete de méthyle, l'acide férulique, l'acide sinapique, l'acide p-coumarique, etc.) ont été étudiées pour remplacer les médiateurs synthétiques [1,12] . Les avantages des médiateurs naturels sont leur faible coût et leur faible toxicité car ils sont obtenus à partir de sources naturelles et renouvelables [19].

La mélanine est un groupe de pigments naturels produits par la mélanogenèse par la polymérisation oxydative de la tyrosine par les mélanocytes. La mélanine naturelle peut être classée en cinq catégories : l'eumélanine, la phéomélanine, l'ensemble de la mélanine, la phéomélanine et la neuromélanine [20]. Récemment, diverses applications médicales et électrochimiques utilisant la mélanine ou des précurseurs de mélanine ont été étudiées [20,21]. La couleur de la peau humaine est principalement déterminée par la présence de mélanine. Dans l'industrie cosmétique, la dépigmentation directe de la mélanine à l'aide d'enzymes a été proposée pour le développement d'agents blanchissants pour la peau. Plusieurs peroxydases ont été étudiées pour décolorer la mélanine. Woo et al. ont montré que la mélanine synthétique peut être directement décolorée par la lignine peroxydase de P. chrysosporium [22]. Les groupes Keneko et Mohorˇciˇc ont également rapporté la décoloration enzymatique de la mélanine par la peroxydase de manganèse isolée de champignons (Sporotrichum pruinose et Phlebia radiata) [23,24]. Kim et al. ont rapporté que des mélanges d'enzymes brutes contenant de la peroxydase de manganèse, de la peroxydase de lignine et de la laccase présentaient une activité de dépigmentation de la mélanine [25]. Lorsque les peroxydases décolorent la mélanine, elles ont besoin de peroxyde d'hydrogène (H2O2) comme cofacteur qui peut irriter la peau. Ainsi, pour réduire l'utilisation de H2O2, la glucose oxydase ou la laccase a été introduite dans le système de combinaison enzymatique [26,27]. Les laccases peuvent décolorer la mélanine sans utiliser de peroxyde d'hydrogène. Khammuang et Sarnthima ont rapporté que la laccase de Lentinus polycarpous Lév présentait une activité de décoloration de la mélanine en utilisant l'ABTS, la vanilline et l'acide vanillique comme médiateurs [28].

2. Matériels et méthodes

2.1. Matériaux

2.2. Décoloration de la mélanine par LMS

La solution de mélanine saturée (1,4 mg/mL) a été préparée par la dissolution de 3 mg de mélanine synthétique dans 1,3 mL de NaOH 10 mM. La solution a été centrifugée à 8500 tr/min pendant 5 min pour éliminer la mélanine non dissoute, et le surnageant a été dilué avec 0.1 M de tampon phosphate d'acide citrique (pH 3, 4, 5, 5.5, 6 ou 7) et utilisé comme solution de substrat pour LMS. La concentration de mélanine dans la solution de substrat était de 63 µg/mL et confirmée par spectrophotométrie à 475 nm. La solution de substrat de mélanine 0.8 mL a été mélangée avec une solution de médiateur 0.1 mL (0–1 mM) dans un tube Eppendorf de 1,5 mL. La réaction de décoloration de la mélanine a été initiée en ajoutant 0,1 mL de solution de laccase (15,8 µg (0,6 U) lacT ou 19,2 µg (1,8 U) lacM) à un mélange de mélanine et du médiateur à 25 ◦C dans un bain-marie agité à 120 tr/min. . Après la réaction, le mélange réactionnel a été centrifugé et l'absorbance du surnageant a été mesurée à 475 nm. Le rendement de décoloration (pourcentage) a été calculé à l'aide de l'équation suivante :

Décoloration (pourcentage) {{0}} (A0 - À)/A0 × 100, (1)

2.3. Etude cinétique de la décoloration de la mélanine par LMS

2.4. Cytotoxicité des médiateurs naturels

La lignée cellulaire de mélanome B16F10 (Korea Cell Line Bank, Séoul, Corée) a été utilisée pour déterminer la cytotoxicité des médiateurs naturels pour le LMS. Un test au rouge neutre (NR) a été réalisé pour mesurer la cytotoxicité des médiateurs [29]. NR mesure la viabilité des lysosomes de cellules vivantes. Des cellules de mélanome avec une concentration de 3 × 104 cellules ont été distribuées dans chaque puits d'une plaque à puits 96-. Après 24 h de culture, les cellules ont été traitées avec des médiateurs naturels (1, 2, 5, 10, 22 et 46 mM). Après une culture supplémentaire pendant 2 jours, les cellules ont été traitées avec une solution de NR à 50 µg/mL dissoute dans du DMEM et incubées pendant 3 h. Après avoir retiré le surnageant par aspiration, une solution de désorption NR (1 % d'acide acétique glacial, 49 % d'éthanol et 50 % d'eau distillée) a été utilisée pour l'extraction de la couleur. Après le processus d'extraction, le changement d'absorbance a été mesuré à 540 nm.

2.5. Préparation et décoloration du film d'hydrogel de mélanine/cellulose

Pour mesurer l'activité de décoloration du LMS pour le film de mélanine / cellulose, le film d'hydrogel préparé a été découpé en une feuille de 1 × 2 cm. Le film d'hydrogel a été immergé dans 4 ml de tampon phosphate d'acide citrique 0.1 M (pH 5,5); par la suite, 0.5 mL d'acétosyringone 1 mM et 0.5 mL de solution de dentelle (2,5 U) ont été ajoutés au tampon. La réaction de décoloration a été réalisée dans un bain-marie avec agitation à 120 pm et 25 ◦C pendant 3 h. Après la réaction, le film a été lavé avec de l'eau distillée et fixé à l'intérieur de la cuvette pour mesurer le changement de spectre dans la plage de 400 à 800 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV/Vis. Des réactions témoins sans lacM ni médiateurs ont également été conduites dans les mêmes conditions. La libération de la mélanine du film ou le changement de couleur du film de mélanine/cellulose n'a pas été détecté dans les conditions de réaction. De plus, le changement des paramètres de couleur (valeurs L *, a * et b *) du film de mélanine / cellulose après la réaction de décoloration par LMS a également été enregistré à l'aide d'un colorimètre (KONICA MI NOLTA, Tokyo, Japon). Les valeurs ∆L (différence de luminosité métrique), ∆E (différence de couleur totale), YI (indice de jaunissement) et WI (indice de blancheur) ont été obtenues à l'aide des équations suivantes [30–32] :

2.6. Préparation de mélanine naturelle

La mélanine naturelle a été obtenue à partir de cellules de mélanome B16F10. Les cellules ont été traitées avec l'hormone de stimulation des mélanocytes alpha pour produire de la mélanine. Après 4 jours d'incubation, les cellules ont été capturées à l'aide de trypsine-EDTA et soniquées pendant 10 min. Le surnageant a été obtenu par centrifugation à 8000 rpm pendant 10 min puis ajusté à pH 1,5 à l'aide de HCl 6M. La solution a été bouillie à 100 ◦C pendant 4 h pour hydrolyser les fractions protéiques résiduelles. La solution contenant de la mélanine naturelle a été lavée avec de l'acétone, puis du chloroforme et de l'éthanol, puis lavée avec de l'eau déionisée pour éliminer les résidus, tels que les cellules, les composants du milieu et les fractions protéiques [33,34]. Tous les processus de lavage ont été effectués plus de deux fois. Enfin, la mélanine naturelle a été obtenue par lyophilisation et utilisée comme substrat pour le LMS.

3. Résultats et discussion

3.1. L'effet des médiateurs sur la décoloration de la mélanine par LMS

L'effet de divers médiateurs sur la réaction de décoloration de la mélanine par LMS a été étudié à l'aide de deux laccases de T. versicolor (lacT) et M. thermophila (lacM) (Figure 1).Lorsque lacT a été utilisé sans médiateur pour la décoloration de la mélanine, le rendement de décoloration n'était que de 1 % après 5 h de réaction. Lorsque HOBt a été utilisé comme médiateur pour lacT, le rendement de décoloration a été légèrement amélioré à 2% après 5 h de réaction. L'utilisation de divers médiateurs synthétiques, tels que HOBt, ABTS, VLA et TEMPO, dans l'oxydation catalysée par la laccase de composés phénoliques ou non phénoliques a considérablement amélioré les taux de réaction [10,15]. Lorsque l'accès des composés cibles au site actif de la laccase est limité par leur encombrement stérique, les radicaux médiateurs formés par la laccase peuvent oxyder efficacement les composés cibles par le mécanisme de transfert d'électrons ou d'atomes d'hydrogène [12]. HOBt est l'un des médiateurs synthétiques les plus couramment utilisés dans les LMS en raison de son potentiel redox élevé (1,1 V) [6]. Cependant, HOBt n'est pas un bon ingrédient cosmétique en raison de sa toxicité cellulaire potentielle et de sa capacité à inactiver la laccase. Ainsi, nous avons sélectionné sept médiateurs naturels, acétosyringone, syringaldéhyde, acide p-coumarique, vanilline, acide vanillique, alcool vanillylique et acétovanillone, pour la réaction de décoloration de la mélanine par LMS. Fait intéressant, tous les médiateurs naturels agissent comme des médiateurs plus efficaces que HOBt pour la décoloration de la mélanine par manque. Lorsque l'acétosyringone, le syringaldéhyde et l'acide p-coumarique ont été utilisés, les rendements de décoloration étaient de 28 %, 22 % et 18 %, respectivement, après 5 h de réaction. Ces résultats démontrent l'utilité des médiateurs naturels pour la réaction de décoloration de la mélanine par LMS. Les médiateurs du LMS sont oxydés en radicaux médiateurs par la laccase, et les radicaux médiateurs induisent l'oxydation et la décoloration de la mélanine. Lorsque le manque a été utilisé sans médiateur pour la décoloration de la mélanine pendant un temps de réaction suffisant, qui pourrait atteindre l'état d'équilibre, le rendement de décoloration était de 7 % après 24 h de réaction. Les médiateurs naturels, à l'exception de l'acide vanillique, agissent comme des médiateurs plus efficaces que HOBt pour la décoloration de la mélanine par lacT après 24h de réaction. Le rendement de décoloration après 24 h de réaction en utilisant l'acide vanillique comme médiateur était inférieur à celui après 5 h de réaction. Cela peut être dû à la faible stabilité de la forme radicalaire oxydée de l'acide vanillique. Lorsque l'acétosyringone, le syringaldéhyde et l'acétovanillone ont été utilisés, les rendements de décoloration étaient de 34 %, 30 % et 31 %, respectivement, après une réaction de 24 h. L'acide p-coumarique était plus efficace pour augmenter la vitesse de réaction initiale que l'acétovanillone, tandis que l'acétovanillone induisait un rendement de décoloration plus élevé à l'état d'équilibre que l'acide p-coumarique.

L'effet du médiateur sur la réaction de décoloration par LMS utilisant lacM était également très similaire à celui obtenu par LMS utilisant lacT. Lorsque la dentelle a été utilisée sans médiateur pour la décoloration de la mélanine, le rendement de décoloration n'était que de 2 % après 5 h de réaction. HOBt en tant que médiateur pour lacM n'a pas amélioré le rendement de décoloration au cours de la réaction de 5 h. Tous les médiateurs naturels, à l'exception de l'acide p-coumarique et de la vanilline, ont agi comme des médiateurs efficaces de la décoloration de la mélanine par lacM. Lorsque l'acétosyringone et le syringaldéhyde ont été utilisés, les rendements de décoloration étaient de 25 % et 22 %, respectivement, après 5 h de réaction. L'acide p-coumarique et la vanilline ont été utilisés comme médiateurs efficaces pour chacun, mais ils n'ont pas pu améliorer efficacement le taux de décoloration dans le LMS en utilisant de la dentelle. Cela peut être dû à la spécificité de substrat inférieure de lacM pour l'acide p-coumarique et la vanilline. Les rendements de décoloration après 24h de réaction de lacM avec l'acide p-coumarique et la vanilline sont similaires à ceux obtenus par lacT. Cela indique que les formes oxydées de l'acide p-coumarique et de la vanilline peuvent décolorer efficacement la mélanine, bien que leur taux d'oxydation par lacM soit bien inférieur à celui par lacT. Lorsque lacM sans médiateur a été utilisé pour la décoloration de la mélanine pendant un temps de réaction suffisant, le rendement de décoloration était de 5 % après 24 h de réaction. Les médiateurs naturels, à l'exception de l'acide vanillique, agissent également comme des médiateurs plus efficaces que HOBt pour la décoloration de la mélanine par lacM après 24h de réaction. Lorsque l'acétosyringone, le syringaldéhyde et l'acétovanillone ont été utilisés comme médiateurs pour lacM, les rendements de décoloration étaient de 34 %, 28 % et 31 %, respectivement, après 24 h de réaction. Lorsque l'acide vanillique a été utilisé comme médiateur pour lacT et lacM, il a montré le rendement de décoloration le plus faible. Cela peut être dû à la faible stabilité de la forme radicalaire oxydée de l'acide vanillique. Khammuang et Sarnthima ont rapporté que la vanilline et l'acide vanillique pourraient être utilisés comme médiateurs pour la décoloration de la mélanine en utilisant la laccase de Lentinus polycarpous [28]. Cependant, ils ont montré une activité de décoloration beaucoup plus faible pour la mélanine que l'acétosyringone lorsqu'ils ont été utilisés comme médiateurs pour lacT et lace.

Ces résultats indiquent que les médiateurs naturels sont plus efficaces pour la décoloration de la mélanine par LMS que HOBt. HOBt a été considéré comme un médiateur synthétique efficace pour la laccase en raison de son potentiel redox élevé et du rôle catalytique du groupe N OH de HOBt [5]. L'efficacité des médiateurs pour oxyder les substrats cibles dépend fortement de la capacité à former des radicaux stables ainsi que de l'encombrement stérique causé par les substituants alkyle volumineux plutôt que du potentiel redox des médiateurs [19, 35]. La faible stabilité de l'intermédiaire oxydé de HOBt a été déterminée par voltamétrie cyclique [6]. Par conséquent, le faible rendement de décoloration par LMS utilisant HOBt peut être causé par la faible stabilité de HOBt dans les conditions de réaction de la laccase. Bien que le potentiel redox du syringaldéhyde soit inférieur à celui du HOBt, le syringaldéhyde a montré une stabilité relativement plus élevée que le HOBt [6].

Comme le montre la figure 2, les médiateurs naturels utilisés dans ce travail ont divers substituants (par exemple, hydroxyle, méthoxy, carboxyle, cétone ou aldéhyde) à différentes positions sur le cycle benzénique [12,19]. Les médiateurs avec deux groupes méthoxy (acétosyringone et syringaldéhyde) ont montré des taux de décoloration plus élevés que ceux avec un groupe méthoxy. Le taux de décoloration obtenu par l'acide p-coumarique sans groupement méthoxy dépendait du type de laccase. L'acide p-coumarique avec lacT a montré un taux de décoloration plus élevé que ceux avec un groupe méthoxy, tandis que l'acide p-coumarique avec lacM a montré le taux de décoloration le plus bas dans la réaction de 5 h. Fillat et al. ont également montré des résultats similaires pour la décoloration des encres flexographiques par des laccases fongiques avec des médiateurs naturels [36]. Les médiateurs naturels phénoliques (acétosyringone, seringue de méthyle et syringaldéhyde) avec deux substituants méthoxy dans le cycle ont été oxydés par la laccase plus rapidement que l'acide p-coumarique sans groupe méthoxy. Cela indique que les groupes méthoxy jouent un rôle plus important en tant que donneurs d'électrons que la double liaison de la chaîne latérale de l'acide p-coumarique. Lorsque les médiateurs à un groupe méthoxy ont été comparés, le rendement de décoloration a augmenté dans l'ordre suivant : acétovanillone > vanilline > alcool vanillylique > acide vanillique. L'acétovanillone, qui a un groupe cétone, a montré un taux et un rendement de décoloration plus élevés que les médiateurs avec des groupes aldéhyde, hydroxyle et carboxyle. L'acétosyringone avec un groupe cétone a également montré un taux et un rendement de décoloration plus élevés que le syringaldéhyde avec un groupe aldéhyde.

Dans les expériences suivantes, l'acétosyringone, le syringaldéhyde et l'acétovanillone, qui ont montré une capacité élevée de décoloration de la mélanine, ont été sélectionnés comme médiateurs pour que le LMS décolore la mélanine. L'effet du médiateur sur la réaction de décoloration par LMS a été étudié au fil du temps (Figure S1). La réaction de décoloration utilisant lacT avec de l'acétosyringone, du syringaldéhyde et de l'acétovanillone a donné des rendements de décoloration de 21 %, 18 % et 1 % après 1 h de réaction, respectivement. La réaction de décoloration utilisant lacM avec de l'acétosyringone et du syringaldéhyde a donné des rendements de décoloration de 19 % et 18 % après 1 h de réaction, respectivement. Les deux laccases ont montré des profils de réaction similaires lorsque le même médiateur a été utilisé. L'acétosyringone et le syringaldéhyde ont considérablement amélioré le taux de décoloration au cours de la réaction initiale. Ces résultats montrent que l'acétosyringone et le syringaldéhyde contenant des groupes diméthoxy étaient plus efficaces pour augmenter la vitesse initiale de décoloration par LMS que l'acétovanillone contenant un groupe méthoxy. Fillat et al. ont également rapporté que les groupes méthoxy dans les structures cycliques des médiateurs agissent comme des accélérateurs pour l'oxydation des substrats [36]. D'autre part, le rendement de décoloration après 24 h de réaction par l'acétovanillone était similaire à celui du syringaldéhyde, bien que l'acétovanillone ait modérément augmenté la vitesse de réaction.

Pour plus d'informations : david.deng@wecistanche.com WhatApp :86 13632399501