LIMIT est un ARNlnc immunogène dans l'immunité contre le cancer et l'immunothérapie

Abstrait

Le CMH-I présente des antigènes tumoraux aux lymphocytes T CD8+ et déclenche l'immunité anti-tumorale. Les humains peuvent avoir 30,000-60,000 ARN non codants longs (ARNlnc). Cependant, on ne sait toujours pas si les lncARN peuvent affecter l’immunité tumorale. Ici, nous identifions un LncRNA, capable d'induire le CMH-I et l'immunogénicité de la tumeur (LIMIT) chez l'homme et la souris. Nous avons découvert que l'IFN stimulait LIMIT, le cluster de gènes de la protéine de liaison au guanylate (GBP) activé par le cis LIMIT et que les GBP perturbaient l'association entre HSP90 et le facteur de choc thermique -1 (HSF1) - entraînant ainsi l'activation de HSF1 et la transcription du MHC-I. machines, mais pas PD-L1. L'activation CRISPR guidée par l'ARN de LIMIT a stimulé les GBP et le CMH-I, et a potentialisé l'immunogénicité tumorale et la thérapie par points de contrôle.

La désactivation de LIMIT, des GBP et/ou de HSF1 a diminué le CMH-I, altéré l'immunité antitumorale et atténué l'efficacité de l'immunothérapie. Cliniquement, les transcrits et les protéines de signalisation LIMIT, GBPs et HSF1- étaient corrélés au CMH-I, aux cellules T infiltrant les tumeurs et à la réponse au blocage des points de contrôle chez les patients atteints de cancer. Au total, nous démontrons que LIMIT est un lncRNA immunogène du cancer jusqu'alors inconnu et que l'axe LIMIT-GBP-HSF1 peut être ciblable pour l'immunothérapie du cancer.

Mots clés 

ARN long non codant ; LIMITE; CMH-I ; IFN ; GBP; HSF1 ; HSP90 ; PD-L1 ; PD-1 ; Immunité aux lymphocytes T ; immunothérapie contre le cancer

Introduction

Le blocage des points de contrôle libère le pouvoir immunitaire médié par les lymphocytes T CD8+ contre le cancer1. Le complexe majeur d'histocompatibilité-I (MHC-I) joue un rôle clé dans l'amorçage et l'activation des lymphocytes T CD8+2. Cependant, le CMH-I est fréquemment régulé négativement dans les cellules cancéreuses, ce qui entraîne une évasion immunitaire tumorale et une résistance à l'immunothérapie3,4. Il est important de comprendre comment récupérer l’expression tumorale du CMH-I et revitaliser la réponse immunitaire antitumorale5. Les ARNlnc émergent rapidement parallèlement aux progrès du séquençage profond de l’ARN, couvrant beaucoup plus de loci dans le génome humain que les gènes codant pour les protéines6. Les ARNlnc régulent les gènes codant pour les protéines à plusieurs niveaux7-9 et jouent un rôle central dans l'empreinte génomique10, la différenciation cellulaire11 et la progression du cancer12. Cependant, l’identité, le mode d’action, la fonction et la pertinence clinique d’ARNnc spécifiques dans l’immunité contre le cancer et l’immunothérapie restent inconnus. Ici, nous identifions LIMIT comme un ARNnc immunogène anticancéreux jusqu’alors inconnu. LIMIT affecte la machinerie MHC-I et l’immunité antitumorale. Nous avons découvert que LIMIT cible localement les GBP, formant ainsi une cascade moléculaire de LIMIT-GBP-HSF1-MHC pour modifier l'immunité antitumorale et l'efficacité de l'immunothérapie tumorale. Nos travaux révèlent non seulement la biologie jusqu'alors inconnue d'un lncRNA immunogène, LIMIT, mais suggèrent également que l'axe LIMIT-GBP-HSF1 pourrait être ciblable pour l'immunothérapie du cancer.

LIMIT est un lncARN immunogène

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Pour explorer les gènes régulateurs inconnus de l'immunité tumorale, sur la base de l'infiltration de lymphocytes T CD8+ tumoraux, nous avons divisé le mélanome humain (TCGA, SKCM) en types de tumeurs chaudes et froides et analysé les corrélations de gènes immunogènes. En plus des transcrits CD8A, IFN et MHC-I (HLA-ABC), nous avons constaté qu'un candidat ARNlnc était enrichi dans la tumeur chaude, parmi 3926 candidats ARNlnc annotés par GENCODE13 (Fig. 1a ; Tableau supplémentaire 1). Sur la base d'études fonctionnelles réalisées dans les expériences suivantes, nous avons désigné ce candidat lncRNA comme LIMIT : lncRNA Inducing MHC-I and Immunogenicity of Tumor (LIMIT). Dans l'ensemble de données sur le mélanome humain, les niveaux de LIMIT étaient positivement corrélés à ceux d'IFN, de MHC-I et de CD8 (Fig. 1b-d). Dans le même esprit, l'analyse d'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) a révélé que l'expression de LIMIT était en corrélation avec les gènes de réponse à l'IFN, la présentation de l'antigène via le MHC-I et l'activation immunitaire (Fig. 1e-h). De plus, les niveaux de LIMIT étaient corrélés à des taux de réponse améliorés à l'immunothérapie aux points de contrôle 14-17 (Fig. 1i) et étaient associés à la survie des patients atteints de mélanome (Fig. 1j). De plus, l'expression de LIMIT était en corrélation avec l'IFN, le MHC-I et le CD8 dans plusieurs types de cancer (Extended Data Fig. 1a-l). Ainsi, LIMIT est un ARNnc immunogène potentiel.

Nous avons validé si LIMIT est un lncRNA. Le Northern blot a montré que LIMIT mesurait environ 2 kb dans les cellules de mélanome humain A375 (Fig. 1k). Nous avons appliqué une amplification rapide des extrémités de l'ADNc (RACE) et caractérisé les extrémités de l'ADNc de LIMIT dans les cellules de mélanome humain (A375) et de souris (B16) (Fig. 1l, m). Ensuite, nous avons cloné toute la longueur de LIMIT chez l'homme et la souris et l'avons aligné avec les séquences génomiques correspondantes (Extended Data Fig. 2a, b). La LIMIT humaine était située dans le chromosome 1, avec 1967 nucléotides et 6 exons (Données étendues, Fig. 2a), tandis que la Limite de la souris était située dans le chromosome 3, avec 1634 nucléotides et 7 exons (Données étendues, Fig. 2b). LIMIT ne contenait pas de séquence Kozak valide. Lorsque nous avons préparé l'ARN à partir de fractions nucléaires et cytoplasmiques de cellules A375, LIMIT a été principalement détecté dans la fraction nucléaire (Fig. 1n). Ainsi, LIMIT n’a aucun potentiel de codage pour les protéines. Collectivement, LIMIT répond à tous les critères pour être défini comme un ARNnc. Notamment, dans le locus LIMIT, un candidat lncRNA, un pseudogène de GBP1 (GBP1P1) a été trouvé dans le carcinome hépatocellulaire (CHC)18. Cependant, LIMIT présentait de faibles similitudes avec GBP1P1 ou GBP1 (Extended Data Fig. 2c, Tableau supplémentaire 2). Ainsi, LIMIT n'est pas GBP1P1. Une forte corrélation entre la signature génétique sensible à LIMIT et à l'IFN (Fig. 1e) suggère que l'IFN peut stimuler l'expression de LIMIT. En effet, le traitement par IFN a induit l'expression de LIMIT, comme le montre le Northern blot (Fig. 1k) et le séquençage d'ARN dans les cellules A375, HT29, Meijuso et A549 (Fig. 1o). Cependant, le traitement avec d'autres cytokines, telles que l'IFN et le TNF, n'a pas réussi à induire l'expression de LIMIT (Fig. 1k). De plus, l'IFN n'a pas réussi à induire LIMIT dans les cellules A375 knock-out (KO) STAT1 (Fig. 1p). Par conséquent, LIMIT est un ARNnc réactif à l'IFN jusqu'alors inconnu dans les cellules humaines et de souris.

LIMIT augmente l'expression du CMH-I

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Pour étudier la fonction de LIMIT dans les cellules tumorales, nous avons d’abord neutralisé LIMIT avec de petits ARN en épingle à cheveux (shLIMIT). Nous avons utilisé l'outil Blast pour sélectionner les shRNA LIMIT qui n'ont aucun candidat hors cible (Tableaux supplémentaires 3-6). ShLIMIT n'a pas ciblé les gènes codant pour GBP (Extended Data Fig. 3a). Dans les cellules A375, shLIMIT a supprimé l'expression de LIMIT (Fig. 2a), mais n'a pas affecté la phosphorylation de STAT1 (Fig. 2b) en réponse à l'IFN, ce qui suggère que LIMIT n'a pas affecté la signalisation globale du gène IFN. MHC-I et PD-L1 sont des gènes cibles de l'IFN19-21. ShLIMIT a entraîné une diminution de l'expression du MHC-I (Fig. 2c), mais pas de PD-L1 (Extended Data, Fig. 3b), en réponse à la stimulation de l'IFN. Conformément à ces données humaines, la limite de silençage dans la cellule de mélanome murin YUMM1.7 ou la cellule de cancer du côlon CT26 a entraîné une réduction de l'expression du CMH-I en réponse à l'IFN (Fig. 2d-g). Dans les cellules A375, shLIMIT affectait non seulement l'expression du CMH-I (HLA-ABC, HLA-E et HLA-F), mais également l'expression du CMH-II (HLA-DRA et HLA-DMA) ; alors que LIMIT n'a pas modifié l'expression des autres gènes de signalisation de l'IFN (Extended Data Fig. 3c). Ainsi, LIMIT participe à la régulation de l’expression du CMH-I et du CMH-II induite par l’IFN sans altérer la voie de signalisation globale de l’IFN.

LIMIT est un gène interrompu avec de grands introns, occupant environ 17 kb dans le génome. Nous n’avons pas réussi à éliminer le locus LIMIT avec des sgRNA appariés et Cas9. Étant donné qu'il existe 5 sites de liaison STAT1/IRF1 prévus dans le promoteur LIMIT, nous avons conçu 4 sgARN appariés pour supprimer ces sites de liaison dans le promoteur LIMIT (Extended Data Fig. 3d). Nous avons généré des cellules A375 avec la suppression du promoteur LIMIT dans les 4 combinaisons de sgARN. Nous avons constaté que l'IFN n'était plus efficace pour induire l'expression de LIMIT et du MHC-I dans les cellules tumorales présentant une délétion du promoteur LIMIT par rapport aux cellules de type sauvage (Fig. 2h, i). Nous avons également utilisé un système d'activation CRISPR guidé par ARN pour activer l'expression Limit dans les cellules tumorales22. Nous avons établi 4 ARN guides ciblant la région promotrice de Limit (sgLimit) et co-exprimés avec dCas9-VPR, un activateur transcriptionnel tripartite fusionné avec Cas9 nul en nucléase, dans des cellules B16 (Extended Data Fig. 4a). Les 4 sgLimit ont amélioré l'expression de Limit, ainsi que celle de MHC-I (Extended Data Fig. 4b, c). Lorsque nous avons transfecté des cellules B16 avec un pool de sgLimit et des sgARN non ciblés (sgNT), sgLimit a induit l'expression de Limit et du MHC-I, mais pas de PD-L1 (Fig. 2j, k). Par conséquent, Limit cible sélectivement le MHC-I, mais pas le PD-L1. Au total, les expériences de perte et de gain de fonction démontrent que LIMIT peut modifier 1,5-3 fois l'expression du CMH-I dans plusieurs cellules cancéreuses chez la souris et l'homme. Nous avons ensuite étudié si l'expression du MHC-I modifiée par LIMIT avait un impact sur la destruction des tumeurs médiée par les lymphocytes T CD8+ spécifiques du TAA in vitro. À cette fin, nous avons d'abord inhibé génétiquement B2M avec des shRNA spécifiques dans l'ovalbumine (OVA) -- exprimant les cellules B16. Le shRNA-B2M a entraîné une réduction de 1,5- fois de l'expression d'OVA-H2Kb (Extended Data Fig. 4d). Lorsque des cellules B16-OVA portant shFluc et shB2M ont été incubées avec des cellules OT-I, nous avons observé une diminution de la destruction des cellules shB2M-B16-OVA médiée par OT-I par rapport à shFluc-B{{63. }}Cellules OVA (Données étendues Fig. 4e-g). Les données suggèrent que des changements d'un facteur 1,5-3- dans l'expression du CMH-I contrôlés par LIMIT pourraient être fonctionnellement pertinents pour affecter les activités CTL spécifiques au TAA. Pour valider cela, nous avons activé LIMIT dans les cellules B16-OVA exprimant la gomme laque et le shB2M. Comme prévu, l'activation CRISPR de LIMIT a induit une expression minimale du CMH-I dans les cellules shB2M, par rapport aux cellules témoins (Fig. 2l). En conséquence, les cellules OT-I ont provoqué une destruction minimale des tumeurs dans les cellules shB2M-OVA-B16 par rapport aux cellules témoins (Fig. 2m, n). Les données suggèrent que l'expression du CMH-I induite par LIMIT est importante dans l'activation et la fonction des lymphocytes T spécifiques du TAA. Les cellules présentatrices d'antigènes (APC), y compris les macrophages et les cellules dendritiques (DC), expriment le CMH-I, présentent des antigènes et activent les cellules T spécifiques du TAA. Nous avons étendu nos études des cellules tumorales aux APC. L'IFN puissamment stimulé Limite l'expression dans les CD et les macrophages dérivés de la moelle osseuse (Extended Data Fig. 4h, i). Nous avons transfecté des macrophages avec la limite de ciblage d'ARNsi marquée au 5'FAM (siLIMIT). La suppression de LIMIT a entraîné une expression plus faible du CMH-I en réponse à la stimulation de l'IFN, par rapport au contrôle (Extended Data Fig. 4j, k). Ainsi, LIMIT est un lncRNA sensible à l’IFN et peut favoriser l’expression du CMH-I dans les cellules tumorales et les APC.

LIMIT améliore l’immunité anti-tumorale

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Une expression insuffisante du CMH-I confère à la tumeur une évasion immunitaire et une résistance à l’immunothérapie3. Pour comprendre le rôle de Limit dans les réponses immunitaires antitumorales in vivo, nous avons inoculé des cellules tumorales YUMM1.7 de contrôle (shFluc) et de limitation (shLimit) dans des cellules NOD scid c-déficientes (NSG, immunodéficient) et C57BL/6 de type sauvage. (immunocompétentes) souris. Par rapport aux tumeurs témoins, les tumeurs shLimit YUMM1.7 se sont développées de manière comparable chez les souris NSG (Fig. 3a), alors qu'elles ont progressé plus rapidement chez les souris de type sauvage (Fig. 3b). De plus, nous avons inoculé des tumeurs shLimit CT26 à des souris BALB/c de type sauvage. Encore une fois, la limite de silençage a entraîné une croissance accrue de la tumeur CT26 dans le modèle immunocompétent (Fig. 3c). Les données suggèrent que la limite de silençage peut altérer l'immunité anti-tumorale et faciliter la croissance tumorale de manière immuno-dépendante. À l'appui de cela, nous avons détecté une réduction des cellules T CD3+, IFN + et TNF + dans les tumeurs shLimit YUMM1.7 (Fig. 3d, e). Ensemble, faire taire Limit altère l’immunité anti-tumorale. Pour déterminer l'expression du MHC-I et du MHC-I : SIINFEKL in vivo, nous avons établi des cellules YUMM1.7 exprimant de manière stable l'OVA (YUMM1.7-OVA) et transduites avec un shRNA ciblant Limit ou Fluc. Après le traitement à l'IFN, nous avons détecté une expression de surface réduite d'OVA-H2Kb dans les cellules shLimit-YUMM1.7 (Extended Data, Fig. 5a). Nous avons inoculé des cellules shLimit YUMM1.7-OVA et des cellules shFluc-YUMM1.7-OVA à des souris C57BL/6. Ensuite, nous avons disséqué les tissus tumoraux et détecté l’expression de H2Db et OVA-H2Kb dans les cellules tumorales. Nous avons observé une réduction de H2Db et OVA-H2Kb dans les cellules shLimit-YUMM1. 7-OVA par rapport aux cellules témoins (Extended Data Fig. 5b-f). Les données indiquent que Limit peut affecter l’expression de l’antigène MHC-I et MHC-I : in vivo. Nous avons également inoculé des cellules B16 de contrôle (sgNT) et d’activation de limite (sgLimit) à des souris C57/BL6 de type sauvage. Comme prévu, sgLimit (activation limite) a considérablement réduit la croissance tumorale (Fig. 3f). Cela s'est accompagné d'une augmentation du nombre et de l'activation de lymphocytes T infiltrant la tumeur (Fig. 3g, h). Le mélanome B16 est un modèle de tumeur relativement insensible au blocage de PD-L123. Conformément à cela, le blocage de PD-L1 n’a pas réussi à contrôler la croissance tumorale sgNT B16 chez la souris. Fait intéressant, limitez l'activation dans la tumeur B16 avec la réponse tumorale sensibilisée sgLimit au blocage de PD-L1, comme le montre la progression tumorale réduite (Fig. 3i). Au total, Limit potentialise l’immunité tumorale et sensibilise la réponse d’immunothérapie tumorale.

LIMIT cis-active les GBP pour renforcer le CMH-I et l’immunité tumorale

Nous avons ensuite exploré comment LIMIT affecte le CMH-I et l’immunité tumorale. Les LncRNA peuvent réguler localement l’expression des gènes voisins24. LIMIT est localisé étroitement dans un groupe de gènes, les protéines de liaison au guanylate (GBP), dans les génomes humain et murin (Extended Data Fig. 2a, b). Nous avons demandé si LIMIT pourrait réglementer l’expression des GBP. Silencing LIMIT a réduit les niveaux d'ARNm précurseurs et matures GBP (Fig. 4a) et de protéines GBP1-5 (Fig. 4b) dans les cellules A375 humaines en réponse au traitement par IFN. Les données suggèrent que LIMIT pourrait favoriser la transcription des GBP en cis. À l'appui de cette possibilité, la limitation au silence a également diminué l'expression de Gbp2 dans les cellules YUMM1.7 et CT26 de souris (Extended Data, Fig. 6a, b). De plus, l'activation CRISPR de Limit a induit l'expression de Gbp2 dans les cellules B16 (Fig. 4c). Pour tester si LIMIT pouvait trans-réguler les GBP, nous avons forcé l'expression de l'ADNc de LIMIT dans des cellules A375. Nous avons constaté que GBP1 et plusieurs facteurs immunitaires (notamment IRF1, HLA-ABC et PD-L1) n'étaient pas modifiés par la surexpression de LIMIT (Extended Data, Fig. 6c). Ainsi, LIMIT est un lncARN agissant en cis, capable d'induire l'expression de GBP. Parmi les membres de la famille Gbp, Gbp2 est un membre prédominant de la famille Gbp dans les cellules de souris (Extended Data, Fig. 6d). Pour tester si LIMIT peut réguler le MHC-I via les GBP, nous avons établi des cellules YUMM1.7 stables portant de la gomme laque, shLimit, shGbp2 ou shLimit plus shGbp2. Nous avons constaté qu'en réponse à la stimulation de l'IFN, shLimit et shGbp2 entraînaient une diminution comparable de l'expression de Gbp2 et du MHC-I ; faire taire simultanément Limit et Gbp2 n'a pas réussi à modifier davantage l'expression de Gbp2 et du MHC-I (Fig. 4d, e). De plus, nous nous sommes demandés si la surexpression de GBP pouvait sauver l'expression du CMH-I régulée négativement par Limiter l'abattage des cellules tumorales. Nous avons forcé l'expression de GBP1 dans les cellules shLIMIT A375 (GBP1OE) et traité ces cellules avec de l'IFN. Nous avons observé que shLIMIT entraînait une réduction de l'expression du CMH-I dans les cellules témoins, mais pas dans les cellules GBP1OE (Extended Data, Fig. 6e). L'expression de PD-L1 et IRF1 n'était pas affectée par shLIMIT ou GBP1OE (Extended Data Fig. 6e, f). Par conséquent, Limit peut réguler l’expression du CMH-I de manière dépendante du GBP. Nous avons ensuite inoculé des cellules YUMM1.7 avec le silençage Limit et/ou Gbp2- à des souris C57BL/6. De la même manière, la désactivation de la limite et la désactivation des GBP ont entraîné une croissance tumorale plus rapide par rapport au groupe témoin, tandis que la désactivation simultanée de LIMIT et des GBP n'a pas affecté davantage la progression de la tumeur (Fig. 4f). De plus, nous avons détecté une diminution du nombre de lymphocytes T infiltrant la tumeur et une activation dans les tumeurs shLimit, les tumeurs shGbp2 et les tumeurs shLimit plus shGbp2 (Fig. 4g et Extended Data, Fig. 6g). Ensemble, LIMIT augmente l'expression du CMH-I et l'immunité tumorale de manière dépendante du GBP. Les GBP sont des gènes sensibles à l'IFN dans les fibroblastes25 et les macrophages26 dans le contexte de la défense de l'hôte contre les agents pathogènes. Cependant, le rôle des GBP dans l’immunité contre le cancer est inconnu. Étant donné que la désactivation des GBP réduisait l'expression du CMH-I et l'activation des lymphocytes T CD8+ (Fig. 4g et Extended Data, Fig. 6g), nous avons émis l'hypothèse que les GBP pourraient affecter l'efficacité de l'immunothérapie anticancéreuse. Pour tester cette hypothèse, nous avons réduit au silence Gbp2 dans les cellules MC38, un modèle de tumeur sensible à l'immunothérapie23. Comme prévu, la désactivation de Gbp2 dans les cellules MC38 a réduit l'expression du CMH-I lors du traitement par IFN (Fig. 4h) et a largement annulé l'efficacité du blocage de PD-L1 (Fig. 4i). Ceci, ainsi que les données susmentionnées, suggèrent l'implication de LIMIT et des GBP dans le contrôle de l'efficacité de l'immunothérapie anticancéreuse. À l'appui de cette possibilité, l'analyse des données cliniques a révélé que des niveaux élevés d'expression de GBP étaient corrélés à LIMIT, à l'expression du CMH-I et à la réponse à l'immunothérapie (Extended Data Fig. 6h-j) chez les patients atteints de mélanome 14-17. De plus, les niveaux d'expression de GBP étaient positivement associés à la survie du patient (Extended Data Fig. 6k). Pour valider si les GBP sont des gènes sensibles à l'IFN dans les cellules cancéreuses, nous avons stimulé les cellules A375 avec l'IFN et d'autres cytokines. Les GBP ont été induits par l'IFN, mais peu affectés par d'autres cytokines immunitaires (Fig. 4j). Ensuite, nous avons utilisé le système CRISPR-Cas9 pour cibler les séquences partagées entre GBP1-5 et généré des cellules A375 knock-out (KO) GBP1-5 (Fig. 4k). Nous avons observé que l'IFN stimulait mal les transcrits de la machinerie génique du CMH-I (Fig. 4l) et les protéines HLA-ABC de surface dans les cellules GBP KO A375 (Fig. 4m). Par conséquent, LIMIT active les GBP pour renforcer la machinerie CMH-I et l’immunité tumorale.

Les GBP activent HSF1 pour stimuler le CMH-I et l'immunité tumorale

Pour démontrer comment les GBP peuvent réguler l'expression du CMH-I et l'immunité tumorale, nous avons forcé l'expression des GBP dans les cellules A375. Il est intéressant de noter que la surexpression des GBP a augmenté l'expression du CMH-I humain, comme le montre la qRT-PCR (Fig. 5a), la coloration de la surface de la membrane (Fig. 5b) et le Western blot (Fig. 5c). Les données suggèrent que les GBP pourraient activer le CMH-I au niveau transcriptionnel. De manière constante, la surexpression de Gbp2 a augmenté l'expression du CMH-I de souris dans les cellules YUMM1.7 et B16 (Fig. 5d). Pour identifier les facteurs de transcription qui régulent le CMH-I via les GBP en réponse à l'IFN, nous avons effectué une prédiction bioinformatique avec PROMO27. Nous avons trouvé 8 facteurs de transcription modifiés par l'IFN dans les cellules A375, qui pourraient cibler HLA-ABC, HSPA5, CALR et TAP1. Outre plusieurs facteurs bien connus, l'activité HSF1 était fortement induite par l'IFN (Extended Data Fig. 7a). En traitant les ensembles de données ChIP-seq dans ENCODE28, nous avons constaté que STAT1 et HSF1 étaient enrichis en promoteurs de gènes associés au CMH-I avec différents modèles de liaison (Extended Data Fig. 7b). Nous avons effectué un test ChIP avec un anticorps anti-HSF1 dans des cellules A375 stimulées par l'IFN. HSF1 était enrichi en promoteurs de HLA-ABC, HSPA5, CALR et TAP1, mais pas en HPRT1, un contrôle négatif (figure 5e). Les résultats suggèrent que HSF1 est un facteur de transcription pour le CMH-I. HSF1 est généralement activé par une interruption de la protéostasie29. Pour tester si l'activation de HSF1 améliorera l'expression du CMH-I, nous avons traité les cellules A375 avec une liste de facteurs de stress : choc thermique, stress oxydatif (Luperox), inhibiteurs de traduction (puromycine), protéasome (MG-132) et chaperon (17-AAG). Il est intéressant de noter que ces facteurs de stress ont universellement stimulé l'expression du CMH-I, alors que KRIBB11, un inhibiteur de HSF1, a réduit cet effet (Fig. 5f et Extended Data, Fig.7c). Ainsi, l’activation de HSF1 induit généralement l’expression du CMH-I. Nous nous sommes ensuite demandé si les GBP pouvaient activer le HSF1. L'expression forcée des GBP a induit l'activité luciférase du rapporteur HSF1 HSE-Luc (Fig. 5g), ainsi que la phosphorylation de HSF1 (Fig. 5h). Cela suggère que les GBP pourraient activer le HSF1. L'IFN n'a pas réussi à induire l'expression de HSPA5 dans les cellules GBP-KO A375 (Fig. 5i). Ainsi, l'IFN active HSF1 en induisant l'expression de GBP. De plus, le traitement avec KRIBB11, un inhibiteur de HSF1, a abrogé la régulation positive du CMH-I médiée par la surexpression de GBP1 (Fig. 5j). Par conséquent, les GBP stimulent l'expression du MHC-I de manière dépendante du HSF1-. Pour solidifier la relation mécanistique entre GBP et HSF1, nous avons réduit au silence Gbp2 et/ou Hsf1 dans les cellules MC38 (Fig. 5k). Lors du traitement par l'IFN, la désactivation de Gbp2 ou de Hsf1 seule a diminué l'expression du CMH-I, mais la désactivation simultanée de Gbp2 et de Hsf1 n'a pas réussi à moduler davantage l'expression du CMH-I (figure 5l). Pour démontrer la pertinence fonctionnelle de l'interaction entre les GBP et HSF1 dans l'immunité tumorale, nous avons inoculé des cellules tumorales MC38 exprimant la gomme laque, shGbp2, shHSF1 ou shGbp2 plus shHSF1 à des souris C57BL/6. Par rapport aux contrôles shFluc, la désactivation de Gbp2 et la désactivation de Hsf1 ont accéléré de manière comparable la croissance tumorale (Fig. 5m) et diminué le nombre et l'activation de lymphocytes T infiltrant la tumeur (Fig. 5n et Données étendues, Fig. 7d). De plus, la désactivation simultanée de Gbp2 et de Hsf1 n'a pas réussi à affecter davantage la croissance tumorale et les cellules T infiltrant la tumeur (Fig. 5m, n et Extended Data, Fig. 7d). Au total, les GBP stimulent l'expression du CMH-I et l'immunité antitumorale en activant HSF1.

L’axe LIMIT-GBP-HSF1 pilote le CMH-I et l’immunité tumorale

Avantages du cistanche pour les hommes : renforcer le système immunitaire

Nous avons ensuite examiné comment les GBP activent HSF1 pour modifier l'expression du CMH-I et l'immunité tumorale. Dans des conditions normales, HSF1 monomère est associé et supprimé par les chaperons, tels que HSP9031. L'interruption de leur interaction permet la trimérisation et l'accumulation de HSF1 dans le noyau, entraînant l'activation transcriptionnelle de ses gènes cibles32. Nous avons émis l'hypothèse que les GBP pourraient perturber l'association entre HSP90 et HSF1, entraînant l'activation de HSF1. Pour tester cette possibilité, nous avons traité des cellules A375 avec de l'IFN et effectué une Co-IP avec un anticorps HSP90. Nous avons constaté que les GBP endogènes induits par l'IFN étaient associés à HSP90 (Fig. 6a). De plus, nous avons transfecté des cellules A375 avec Flag-GBP1 exogène et réalisé l'expérience Co-IP avec l'anticorps Flag. HSP90 a été détecté dans le produit IP provenant de cellules transfectées par Flag-GBP1, mais pas dans les cellules témoins transfectées par un vecteur (figure 6b). La coloration par immunofluorescence a démontré que les GBP et les HSP90 étaient largement co-localisés dans le cytoplasme (Fig. 6c). Lorsque nous avons transfecté des cellules 293T avec des doses croissantes de plasmides GBP1, le HSF1 associé à HSP 90- a été réduit de manière dose-dépendante (Fig. 6d). Les données suggèrent que les GBP ont interagi avec HSP90 et que cette interaction a perturbé l'association entre HSF1 et HSP90. HSP90 est un chaperon pour le repliement et la stabilité de plusieurs protéines. Nous nous sommes demandé si les GBP pouvaient modifier l'activité chaperon de HSP90. Bien que l'inhibiteur de HSP90 ait supprimé l'expression des protéines clientes HSP90 (telles que RAF1, BCL2 et CDK433), la surexpression des GBP n'a pas réussi à le faire (Fig. 6e). Ainsi, les GBP interagissent avec HSP90 et libèrent le HSF1 associé à HSP90-, mais ne modifient pas l'activité de HSP90. Ensuite, nous avons directement examiné le rôle de HSF1 dans l’expression du CMH-I. Nous avons traité les cellules A375 avec de l'IFN en présence de l'inhibiteur de HSF1, KRIBB11. Comme prévu, le traitement par KRIBB11 a réduit l'expression de l'ARNm stimulée par l'IFN des gènes liés au CMH-I, notamment HLA-ABC, TAP1, HSPA5 et CALR, mais pas IRF1 (figure 6f). Il est intéressant de noter que KRIBB11 a réduit l'expression du CMH-I induite par l'IFN, mais a eu un effet minimal sur l'expression de PD-L1 (Fig. 6g). Ainsi, HSF1 peut réguler l’expression du CMH-I induite par l’IFN sans altérer la signalisation globale de l’IFN. Pour déterminer si le MHC-I régulé par HSF1-était fonctionnel, nous avons cultivé B16-OVA avec des cellules OT-I en présence de KRIBB11 et d'IFN. KRIBB11 a inhibé l'expression induite par l'IFN du MHC-I lié à l'OVA (Extended Data, Fig. 8a). Dans le même ordre d'idées, KRIBB11 a également supprimé les effets cytotoxiques à médiation cellulaire OT-I sur B 16-OVA (Extended Data Fig. 8b). Pour étendre nos observations à d'autres tumeurs, nous avons réduit au silence Hsf1 avec shHsf1 dans les cellules YUMM1.7 et CT26. La désactivation de Hsf1 a entraîné une diminution de l'expression du CMH-I dans les cellules YUMM1.7 (Fig. 6h, i) et CT26 (Extended Data, Fig. 8c) en réponse à la stimulation de l'IFN. Dans les cellules YUMM1.7, la désactivation de HSF1 n'a pas réussi à affecter l'expression de Gbp2 en réponse à l'IFN (Fig. 6h), ce qui indique que Gbp2 n'est pas un gène cible de HSF1. Dans les cellules shHsf1 YUMM1.7, KRIBB11 n'a pas réussi à supprimer l'expression du CMH-I stimulée par l'IFN (Extended Data, Fig. 8d). Les données suggèrent que HSF1 a amélioré l'expression du CMH-I en réponse à l'IFN, et que Hsf1 est la cible mécanistique de KRIBB11 pour réguler le CMH-I. Étant donné que HSF1 affectait l’expression du CMH-I, nous avons émis l’hypothèse que HSF1 régulait l’immunité anti-tumorale in vivo. Pour tester cette hypothèse, nous avons inoculé des cellules tumorales témoins et shHsf1 YUMM1.7 à des souris NSG et C57BL/6. Nous avons observé que l'inactivation de HSF1 ralentissait partiellement la progression tumorale YUMM1.7 chez les souris NSG (Fig. 6j), ce qui confirme que Hsf1 aidait à maintenir l'homéostasie protéique et la progression tumorale dans le modèle immunodéficient. Cependant, la désactivation de Hsf1 a considérablement accéléré la croissance de la tumeur YUMM1.7 chez les souris C57BL/6 de type sauvage (Fig. 6k). Les données indiquent que Hsf1 peut étonnamment favoriser une puissante immunité antitumorale dans le modèle immunocompétent. À l'appui de cela, nous avons détecté une réduction des pourcentages de cellules T CD3+, Ki67+, IFN + et TNF + infiltrant la tumeur (Fig. 6l et Extended Data Fig. 8e) dans les tumeurs shHsf1 YUMM1.7 par rapport aux contrôles de brouillage shFluc. De plus, nous avons inoculé des cellules shHsf1 CT26 à des souris BALB/c de type sauvage. Encore une fois, la désactivation de Hsf1 a entraîné une croissance accrue de la tumeur CT26 (Extended Data, Fig. 8f). Cela s'est accompagné d'une réduction des pourcentages de cellules T CD3+, Ki67+, IFN + et TNF + infiltrant la tumeur (Extended Data Fig. 8g, h). Dans l’ensemble, les données suggèrent que l’axe GBP-HSF1 pilote l’expression du CMH-I et l’immunité antitumorale. Pour connecter mécaniquement Hsf1 et LIMIT, nous avons réduit au silence LIMIT dans les cellules A375. Silencing LIMIT a réduit l'activité transcriptionnelle de HSF1 en réponse à l'IFN, comme déterminé par le test du rapporteur à la luciférase (HSE-luc) (Fig. 6m). Les données suggèrent que LIMIT contribue à l'activation de HSF1 en réponse à l'IFN. Pour tester une implication potentielle de HSF1 dans l'induction du CMH-I médiée par LIMIT, nous avons stimulé LIMIT via l'activation de CRISPR dans les cellules B16, en présence de KRIBB11. Nous avons observé que la régulation positive du CMH-I, induite par l'activation de LIMIT, était abrogée par un inhibiteur de HSF1 (Fig. 6n). Les données suggèrent que LIMIT stimule l'expression du MHC-I de manière dépendante du HSF1-. Enfin, nous avons analysé un lien entre LIMIT, GBP et HSF1 dans le contexte de l'expression du CMH-I, de l'immunité tumorale et de l'immunothérapie chez les patients atteints de cancer. L'analyse clinique a montré que les gènes de signalisation HSF1- étaient en corrélation avec l'expression du CMH-I, l'infiltration de lymphocytes T CD8+ et la survie du patient (Extended Data Fig. 9a-c). Dans une étude sur le blocage des points de contrôle immunitaire chez des patients atteints de carcinome basocellulaire34, l'analyse du séquençage de l'ARN unicellulaire a révélé 2 groupes de tumeurs ; un groupe de tumeurs était plus sensible au traitement anti-PD -1, comme le montre une population tumorale largement réduite (Extended Data Fig. 9d). Il est intéressant de noter que ce groupe de tumeurs sensibles aux points de contrôle immunitaires exprimait des niveaux plus élevés de gènes de signalisation HSF1- ainsi que de machinerie génétique MHC-I (Extended Data Fig. 9e). De plus, dans une étude sur le blocage des points de contrôle immunitaire chez des patients atteints de mélanome35, l'analyse protéomique a démontré que l'expression protéique des GBP, des gènes de signalisation HSF1 et du MHC-I était plus élevée chez les répondeurs cliniques que chez les non-répondeurs (Extended Data Fig. 9f). De plus, nous avons observé une corrélation positive entre les gènes de signalisation GBP1 et HSF 1- dans les cancers humains (Extended Data Fig. 9g). Les données confirment que l'axe LIMIT-GBP-HSF1 peut activer l'expression du CMH-I et favoriser l'immunité anti-tumorale (Extended Data Fig. 10).

Discussion

Plante de cistanche aux herbes chinoises-Antitumorale

Les humains ont 30,000-60,000 ARNnc. Cependant, l’identité et les fonctions biologiques de la grande majorité de ces ARNnc potentiels restent mal comprises. Dans le domaine de la biologie du cancer, les lncARN ont été largement étudiés dans le modèle immunodéficient, laissant un manque de connaissances sur les lncARN dans le contexte du système immunitaire. Une poignée d’ARNnc affecteraient la fonction des cellules immunitaires36,37, la progression du cancer et l’efficacité de la chimiothérapie38,39. Cependant, la question de savoir si des ARNnc spécifiques sont impliqués dans l’immunité antitumorale et la réponse immunothérapeutique reste sans réponse. Dans la présente étude, nous avons identifié que LIMIT est un ARNnc sensible à l'IFN jusqu'alors non caractérisé dans les cellules humaines et de souris. LIMIT peut induire l’expression du CMH-I et du CMH-II, favorisant la réponse immunitaire tumorale médiée par les lymphocytes T et améliorant l’efficacité de l’immunothérapie. Ainsi, LIMIT est un lncRNA immunogène tumoral jusqu’alors inconnu. La voie de signalisation de l'IFN joue un rôle clé dans la détermination de la réponse thérapeutique à l'immunothérapie anticancéreuse40 via de multiples mécanismes19,20,41,42. Les mutations génétiques dans les gènes de signalisation de l'IFN contribuent à la résistance au blocage des points de contrôle chez les patients atteints de cancer43-48. Cependant, la signalisation IFN peut induire une expression inhibitrice de PD-L149. Par conséquent, il est idéal d’identifier et de cibler un gène clé de signalisation de l’IFN qui médie sélectivement l’immunité antitumorale, plutôt que l’évasion immunitaire tumorale. Conformément à cette notion, nous démontrons que LIMIT intervient dans la régulation positive du CMH-I et du CMH-II, mais n'affecte pas l'expression de PD-L1 en réponse à l'IFN. Ainsi, LIMIT pourrait être particulièrement bien placé pour être une cible immunogène pour l’immunothérapie du cancer. Plusieurs stratégies ont été proposées pour cibler thérapeutiquement les ARNnc pathogènes50. Cependant, la manière d’élever les niveaux d’ARNnc bénéfiques reste un défi. Comme les ARNnc agissant en cis fonctionnent localement, l’expression forcée de ces ARNnc peut être incapable de les localiser avec précision51. Bien que les ARNnc agissant en trans puissent fonctionner à travers des structures secondaires spécifiques, la surexpression de ces ARNnc pourrait ne pas être en mesure de générer leurs structures naturelles en raison de l’absence de chaperons d’ARN appropriés52. En utilisant une stratégie d'activation CRISPR guidée par l'ARN22, nous avons directement activé l'expression de LIMIT dans les cellules tumorales dans des modèles précliniques. L’activation de CRISPR LIMIT guidée par l’ARN peut piloter l’expression du CMH-I tumoral et potentialiser le traitement par blocage des points de contrôle. Étant donné que la perte des signatures génétiques du CMH-I et de l'IFN se produit fréquemment dans les tumeurs humaines, nous suggérons que l'activation par CRISPR d'ARNnc bénéfiques, tels que LIMIT, puisse sauver l'expression du CMH-I tumoral et constituer une approche thérapeutique potentielle. En recherchant le mécanisme par lequel LIMIT affecte l’immunité tumorale, nous avons découvert que LIMIT cible les GBP de manière cis. Les GBP jouent un rôle dans l'immunité innée26,53,54. Les souris dépourvues de l’ensemble du groupe de Gbps manifestent une mauvaise réponse anti-Toxoplasma gondii55. Cependant, avant nos travaux, le lien mécanistique entre LIMIT et les GBP, ainsi que la fonction biologique des GBP dans l'immunité tumorale et l'immunothérapie, étaient indéterminés. Nous avons découvert que les GBP sont nécessaires à l'expression du CMH-I tumoral induit par l'IFN, à l'efficacité de destruction des lymphocytes T CD8+ et à une thérapie efficace par points de contrôle. Les données suggèrent que les GBP sont des gènes cibles potentiels pour stimuler l’immunogénicité des tumeurs. Nous avons découvert de manière inattendue que les GBP activent HSF1 pour stimuler l'expression des gènes liés au CMH-I et au CMH-I. L'activation de HSF1 médiée par les inhibiteurs de HSP90 est en corrélation avec le contrôle des tumeurs dans les modèles immunocompétents. Cependant, malgré de multiples essais cliniques avec les inhibiteurs de HSP90, aucun des inhibiteurs de HSP90 évalués n’a jusqu’à présent été approuvé par la FDA pour le traitement du cancer. Ce fait décevant soulève la possibilité que les inhibiteurs de HSP90 puissent nuire à l’immunité tumorale. La toxicité de ces inhibiteurs de HSP90 peut favoriser la destruction de plusieurs protéines clientes de HSP90, telles que RAF1 et BCL2, qui peuvent être critiques pour la prolifération et la survie des lymphocytes T effecteurs59,60. Étant donné que les GBP interagissent avec HSP90 et libèrent HSF1 leurré par HSP 90-, mais ne modifient pas l'activité de HSP90, nos données suggèrent que le ciblage des GBP pourrait être une stratégie sûre et méconnue auparavant pour activer HSF1 pour l'immunothérapie du cancer. En résumé, nous identifions LIMIT comme un lncRNA immunogène du cancer jusqu’alors inconnu. Nos travaux suggèrent que le ciblage de l’axe de signalisation LIMIT-GBP-HSF1 peut sauver l’expression et la fonction du MHC-I, présentant ainsi une approche immunothérapeutique prometteuse contre le cancer.

Méthodes

Expériences sur les animaux

Femelle NSG âgée de six à huit semaines (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, stock n° 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, stock n° 000664), BALB/c (BALB /cJ, Stock# 000651) et OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, Stock# 003831) ont été obtenues auprès du laboratoire Jackson. Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes. La salle des animaux a une température contrôlée (18-23 degrés), une humidité (40-60 %) et un cycle de 12 lumières/12 obscurités. Les cellules YUMM1.7 (1 × 105), CT26 (1 × 105), MC38 (2,5 × 106) et B16 (1 × 105) ont été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit des souris. Pour le traitement anti-PD-L1 dans le modèle MC38, 5 mg/kg d'anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) et d'anticorps témoin (InVivoMAb, LTF-2) ont été administrés par voie intrapéritonéale aux jours 6, 9, et 12 après l'inoculation de la tumeur. Pour le traitement anti-PD-L1 dans le modèle B16, 5 mg/kg d'anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) et d'anticorps témoin (InVivoMAb, LTF-2) ont été administrés par voie intrapéritonéale aux jours 0, 3, 6, 9, 12 et 15 après l'inoculation de la tumeur. Les diamètres des tumeurs ont été mesurés à l'aide d'un pied à coulisse. Le volume de la tumeur a été calculé par longueur × largeur × largeur/2. Des études sur les animaux ont été menées avec l'approbation du comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université du Michigan (PRO00008278). L'étude est conforme à toutes les réglementations éthiques pertinentes concernant la recherche animale. Dans aucune des expériences, la taille de la tumeur xénogreffe n'a dépassé 2 cm dans quelque dimension que ce soit, et aucun animal n'a présenté une distension abdominale sévère (augmentation supérieure ou égale à 10 % du poids corporel d'origine). La taille de l'échantillon a été choisie sur la base de données préliminaires. Après inoculation de la tumeur, les souris ont été randomisées et réparties dans différents groupes pour le traitement.

Réactifs

KRIBB11 et 17-AAG ont été achetés auprès de Cayman Chemical. MG-132, Puromycin et Luperox provenaient de Sigma-Aldrich. IFN humain recombinant (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL) et l'IFN de souris (485-MI) provenaient de la R&D.

Plasmides

Pour générer HSE-LUC, des séquences d'ADN correspondant aux éléments de choc thermique (HSE) ont été synthétisées, recuites et ligaturées dans un plasmide PGL3-basique (Promega). FLAG-HSF1 était un cadeau de Stuart Calderwood (Addgene #32537). Pour l'expression forcée des GBP1, GBP2, GBP5 humains et des Gbp2 de souris, les séquences codantes respectives ont été amplifiées par PCR à partir de l'ADNc généré à partir de cellules A375 ou de cellules B16 prétraitées par l'IFN, puis insérées dans le plasmide PCI-Flag. Le plasmide PCI-Flag a été préparé en insérant la séquence Kozak suivante plus l'étiquette Flag plus la séquence 5 × Glycine dans le plasmide PCI-neo (Promega) entre NheI et XhoI. Pour neutraliser LIMIT humain et LIMIT de souris, des shARN ont été conçus et insérés dans le plasmide PLKO.1 (Addgene #10879). Le shRNA ciblant la luciférase de luciole (shFluc) a servi de contrôle négatif. Pour cibler la région promotrice de Limit pour l'activation de CRISPR, des sgARN (sgLimit) ont été conçus et insérés dans le plasmide sgARN phU6- (Addgene #53188). Le sgRNA non ciblé (sgNT) a servi de contrôle négatif. Pour supprimer les sites de liaison STAT1/IRF1 dans le promoteur LIMIT, des sgRNA appariés (psgLIMIT) ont été conçus et insérés dans le plasmide PX459 (Addgene #48139). Pour éliminer les Hsf1 et Gbp2 de souris, des shARN ont été conçus et insérés dans le plasmide PLKO.1 (Addgene #10879). Pour éliminer GBP1-5, le sgRNA a été conçu et inséré dans le plasmide PX459 (Addgene #48139). Les séquences cibles sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 7. Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 8.

Culture de cellules

Lignée cellulaire de mélanome humain A375 (CRL-1619), lignées cellulaires de mélanome de souris, B16-F0 (CRL-6322) et YUMM1.7 (CRL-3362 ), les lignées cellulaires de cancer du côlon de souris CT26 (CRL-2638) et 293T (CRL-3216) ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC). La lignée cellulaire de cancer du côlon de souris MC38 a été utilisée précédemment dans le laboratoire Zou23,48. Des cellules B16- OVA ont été établies comme indiqué précédemment42. Des lignées cellulaires de suppression du promoteur A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO et A375 LIMIT ont été générées dans cette étude. Toutes les lignées cellulaires ont été testées régulièrement pour détecter la contamination par les mycoplasmes et ont été confirmées négatives pour les mycoplasmes. Les cellules ont été cultivées dans du milieu RMPI (Gibco # 11875) additionné de 10 % de FBS, à l'exception des cellules A375 et 293T, ces 2 dernières lignées ont été cultivées dans du DMEM (Gibco # 11965) additionné de 10 % de FBS. Toutes les cellules ont été maintenues à 37 degrés et 5 % de CO2. Pour le choc thermique, les cellules ont été placées dans un incubateur à 43 degrés et 5 % de CO2 pendant 2 heures. Pour générer des lignées cellulaires knockdown, des particules lentivirales ont été produites par transfection du plasmide shRNA PLKO.1 avec psPAX2 (Addgene # 12260) et pMD2.G (Addgene # 12259) (4: 3: 1) dans des cellules 293T, puis transduites dans la tumeur. cellules avec du polybrène (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) pendant la nuit. 48 heures après la transfection, les cellules ont été sélectionnées avec de la puromycine (1-2 ug/ml) pendant 2 semaines supplémentaires. Pour établir des lignées cellulaires knock-out, des plasmides sgRNA PX 459- ont été transfectés dans des cellules tumorales pendant 2 jours et sélectionnés par de la puromycine (1-2 ug/ml) pendant 2 jours supplémentaires. Les cellules ont ensuite été diluées en série et ensemencées dans des plaques à 96 puits. Après 2-3 semaines, les colonies unicellulaires ont été dissociées et replacées dans des plaques à 6 puits. Lors de la confluence cellulaire, la moitié des cellules ont été récoltées et validées pour leur efficacité knock-out (KO) via Western blot. Pour appliquer le système d'activation CRISPR pour activer la limite de la souris, les phU6-sgRNA ont été transfectés avec SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) dans des cellules B16. Toutes les transfections ont été réalisées avec de la lipofectamine 2000 (Thermofisher) à un rapport de 1 µg de plasmide : 2 µl de régent de transfection. La dose de transfection a été déterminée par titrage.

Test d'activité luciférase

Les cellules A375 ont été transfectées avec HSE-LUC et PRL-SV40P (Addgene #27163) pendant 24 heures, ainsi qu'avec PCI-neo (vecteur) ou GBP1, GBP2 pendant 48 heures. Les cellules A375 shFluc ou A375 shLIMIT ont été transfectées avec HSE-LUC et PRL-SV40P (Addgene # 27163) pendant 24 heures, puis traitées avec de l'IFN pendant 48 heures supplémentaires. L'activité luciférase de la luciférase de luciole (HSE-LUC) et de la luciférase renilla (PRL-SV40P) a été mesurée avec le système de test Dual-Luciferase Reporter (Promega). L’activité relative de la luciférase de luciole a été normalisée avec l’activité de la luciférase de Renilla.

Coloration de surface et analyse par cytométrie en flux (FACS)

Les cellules ont été trypsinisées et lavées avec du tampon MACS (PBS, 2% FBS, EDTA 1 mM). La coloration de surface a été réalisée en ajoutant les anticorps suivants à la suspension cellulaire dans 50 ul de tampon MACS : anti-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), anti-H2-Db (KH95, BD Biosciences), anti-H2-Dd (34-2-12, BD Biosciences), anti-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, eBioscience) et anti-PD-L1 (MIH1, BD Biosciences). Après 30 minutes d'incubation, les cellules ont été lavées avec du tampon MACS et analysées sur un cytomètre en flux BD Fortessa.

Analyse PCR quantitative (qPCR)

L'ARN total a été isolé des cellules par purification sur colonne (kit Direct-zol RNA Miniprep, Zymo Research) avec traitement à la DNase. L'ADNc a été synthétisé à l'aide du kit de synthèse d'ADNc RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific) avec des amorces hexamères aléatoires. La PCR quantitative (qPCR) a été réalisée sur l'ADNc à l'aide du Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) sur un système de PCR en temps réel StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific). L'expression des gènes a été quantifiée à l'aide des amorces répertoriées dans le tableau supplémentaire 8. Les modifications de l'expression de l'ARNm ont été calculées par la méthode ΔΔCt en utilisant ACTB comme contrôle endogène. Les résultats sont exprimés sous forme de changement de pli par normalisation par rapport aux contrôles.

Transfert du Nord

L'analyse par transfert Northern a été réalisée avec 10 µg d'ARN totaux préparés à partir de cellules A375 prétraitées par IFN, IFN et TNF. Les ARN ont été résolus par électrophorèse dénaturante sur gel d'agarose (Ambion) et transférés sur des membranes Hybond-XL (GE Healthcare). LIMIT a été détecté à l’aide de sondes ADN marquées à la digoxine avec le kit DIG Northern Starter (Roche). Les séquences de sonde ciblant LIMIT sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 7.

Amplification rapide des extrémités de l'ADNc (RACE)

RACE a été réalisé pour identifier les extrémités d'ADNc de LIMIT humain ou de souris Limit avec le kit d'amplification d'ADNc SMARTer RACE (Clontech). Les amorces pour RACE sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 8.

Clone de LIMIT complet

Après avoir obtenu les séquences terminales de l'ADNc, LIMIT complet a été amplifié par PCR et inséré dans le plasmide PCI-neo entre XhoI et NotI. Les amorces clones pour LIMIT humain et Limit de souris sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 8.

Fractionnement cellulaire pour RT-PCR

Les cellules A375 prétraitées à l'IFN ont été collectées à partir de plaques de 15 cm par grattage et lavées une fois avec du PBS froid. Les cellules ont été agglomérées par centrifugation à 700 g pendant 5 minutes et lysées avec un tampon de lyse hypotonique (Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, 0,3 % (vol/vol) NP{{ 12}}, 10% (vol/vol) glycérol) pour recueillir la fraction cytoplasmique. L'ARN cytoplasmique a été obtenu par précipitation à l'éthanol pendant une nuit à -20 degrés, suivie d'une réextraction à l'aide du réactif TRIZOL. Le culot nucléaire restant a été lavé trois fois avec le tampon de lyse hypotonique, suivi d'une extraction avec le réactif TRIZOL selon les instructions du fabricant. Les ARN isolés de fractions nucléaires ou cytoplasmiques ont été transcrits inversement et RT-PCR pour LIMIT avec les amorces indiquées. Les ACTB non épissés ou matures ont été utilisés comme contrôles pour l'ARN nucléaire ou cytoplasmique. Les amorces pour ACTB sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 8.

Western blot

Les cellules ont été lavées dans du PBS froid et lysées dans un tampon de lyse 1 × RIPA (Pierce) avec 1 × inhibiteur de protéase (Pierce). Les lysats ont été incubés sur de la glace pendant 10 minutes et clarifiés par centrifugation à 15,000g pendant 15 minutes. La concentration en protéines a été quantifiée à l'aide d'un kit de dosage de protéines BCA (Thermo Fisher). Trente microgrammes de protéine ont été mélangés avec un tampon d'échantillon (Thermo Fisher) avec du -ME et dénaturés à 95 degrés pendant 5 minutes. L'échantillon a été séparé par SDS – PAGE et transféré sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad). Les membranes ont été bloquées avec 5 % p/v de lait écrémé en poudre et incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 degrés et des anticorps secondaires conjugués à la HRP (CST) pendant 1 heure à température ambiante. Le signal a été détecté à l’aide des substrats de transfert Western ECL Clarity et Clarity Max (Bio-Rad) et capturé à l’aide du système d’imagerie ChemiDoc (Bio-Rad). Les anticorps étaient les suivants : anti-humain GBP1-5 (Santa Cruz, 166960, 1 : 500), anti-HSF1 (CST, 12972, 1 : 1,000), anti-Phospho HSF1 (Abcam , 76076, 1 : 1000), anti-GBP1 (Proteintech, 15303, 1 : 1,000), anti-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1 : 1,000) , anti-HSP90 (CST, 4877, 1 : 1,000), anti-HSPA5 (CST, 3177, 1 : 1,000), anti-STAT1 (CST, 9172, 1 : 1 ,000), anti-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1 : 1000), anti-RAF1 (CST, 9422, 1 : 1000), anti-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), anti-CDK4 (CST, 12790, 1 : 1000) et anti-GAPDH (Proteintech, 60004, 1 : 5 000). Pour le Western Blot du CMH-I humain, les lysats cellulaires totaux ont été dénaturés dans le tampon d'échantillon sans -ME (non réducteur) pour maintenir les ponts disulfure et la conformation des protéines à détecter par l'anticorps anti-HLA-ABC (W6/32 , Novus Biologicals, 64775, 1 : 1 000).

Co-immunoprécipitation (Co-IP)

Les cellules ont été collectées avec un tampon de lyse IP (Pierce, 87787) plus un inhibiteur de protéase. La concentration en protéines a été déterminée avec un kit de dosage de protéines BCA. 200-500 µg d'échantillons de protéines ont été ajoutés à 1-3 µg d'anticorps primaires anti-HSP90 (Proteintech, 13171) ou anti-HSF1 (CST, 12972) et incubés sous oscillation douce à 4 degrés pendant la nuit. Ensuite, les échantillons ont ensuite été incubés avec 20 ul de protéine A/G PLUS-agarose (Santa Cruz, sc-2003) pendant 2 heures à 4 degrés ; et centrifugé à 7 500 ×g pendant 30 secondes à 4 degrés. Les culots cellulaires ont été lavés 4 fois avec un tampon de lyse IP, remis en suspension avec 40 ul de tampon d'échantillon 2 × avec -ME et chauffés pendant 5 minutes à 95 degrés. Les échantillons de protéines dénaturées ont été analysés par Western blot. Pour Flag IP, les lysats cellulaires ont été incubés avec 20 ul de gel d'affinité EZview Red ANTI-FLAG M2 (Sigma Aldrich) et lavés, dénaturés et analysés comme décrit ci-dessus.

Coloration par immunofluorescence

Les cellules A375 montées sur des lamelles ont été traitées avec de l'IFN pendant 24 heures. Après avoir lavé 2 fois avec du PBS, les cellules ont été fixées avec du PFA à 4 % pendant 15 minutes et lavées 2 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. Ensuite, les cellules ont été perméabilisées avec du 0,5 % de triton x-100 dans du PBS pendant 10 minutes et rincées 2 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. Les antigènes ont été bloqués avec 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS pendant 30 minutes. Ensuite, des anticorps primaires ont été ajoutés à des dilutions au 1:50 d'anticorps de souris anti-humain GBP1-5 (Santa Cruz, 166960) ou d'anticorps de lapin anti-humain HSP90 (CST, 4877), et incubés à 4 degrés pendant la nuit. Ensuite, les cellules ont été lavées et incubées avec des dilutions au 1/500 d'anticorps secondaire de chèvre anti-souris marqué Qdot 605 (Thermo Fisher, Q11002) ou d'anticorps secondaire de chèvre anti-lapin marqué AF488- (Thermo Fisher, A11034), puis monté sur des lames de verre avec le réactif ProLong Gold contenant du DAPI. Des images de fluorescence confocale ont été collectées à l'aide d'un objectif à immersion dans l'huile 63X (confocal Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM).

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Les puces ont été réalisées avec de la chromatine réticulée provenant de cellules A375 traitées à l'IFN et soit de l'anticorps HSF1 (CST, 12972), soit de l'IgG de lapin normal (CST, 2729), à l'aide du kit IP de chromatine enzymatique Simple ChIP Plus (perles magnétiques) (CST, 9005). L'ADN enrichi a été quantifié par PCR en temps réel à l'aide des amorces répertoriées dans le tableau supplémentaire 8. La quantité d'ADN immunoprécipité dans chaque échantillon a été représentée sous forme de signal par rapport à la quantité totale de chromatine d'entrée, qui équivaut à 1.

Isolement de cellules OT-I et co-culture avec des cellules tumorales OVA+

Des souris C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) (stock JAX n° 003831) ont été achetées auprès du Jackson Laboratory. La rate a été homogénéisée et les cellules individuelles ont été mises en suspension dans 2 ml de tampon de lyse des globules rouges (Sigma-Aldrich) pendant 1 minute. Les splénocytes ont été agglomérés, lavés et remis en suspension à raison de 2 × 106 cellules par ml dans un milieu de culture RPMI contenant 1 ug/ml de peptide OVA257-264, 5 ug/ml d'IL recombinante de souris-2 et 40 μM { {15}} mercaptoéthanol. Les cellules ont été incubées à 37 degrés pendant 5 jours. Pour mettre en place la co-culture de cellules tumorales OT-I et OVA+, des splénocytes ont été collectés après 5-jour d'activation. Les cellules OT-I ont été purifiées à l'aide du kit d'isolation de cellules T CD 8+ de souris EasySep (Stemcell). Les cellules B16-OVA ont été ensemencées pendant la nuit. Les cellules OT-I ont ensuite été ajoutées à la culture selon différents ratios. Toutes les cellules ont été collectées par trypsinisation et analysées par cytométrie en flux (FACS).

Cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC) et macrophages (BMDM)

La moelle osseuse a été isolée des fémurs de souris C57BL/6 et cultivée dans un milieu complet RPMI1640 avec 20 ng/ml de GM-CSF (R&D). Les cellules ont été incubées à 37 degrés et 5 % de CO2. Un milieu supplémentaire de 10 ml contenant 20 ng / ml de GM-CSF a été ajouté au jour 3. Au jour 7, les cellules non adhérentes et faiblement adhérentes dans le surnageant de culture ont été récoltées par lavage doux avec du PBS et considérées comme des BMDC. Les cellules adhérentes étaient considérées comme des BMDM.

Profilage des cellules immunitaires intratumorales

Pour quantifier l'expression des lymphocytes T intratumoraux et des cytokines effectrices des lymphocytes T, des suspensions unicellulaires ont été préparées à partir de tissus tumoraux frais en passant physiquement à travers des tamis cellulaires de 100 μm. Les cellules immunitaires ont été enrichies par centrifugation sur gradient de densité. Pour la coloration des cytokines, les cellules immunitaires intratumorales ont été incubées dans un milieu de culture RPMI contenant du PMA (5 ng/ml), de l'ionomycine (500 ng/ml), de la brefeldine A (1 : 1,000) et du Monessen (1 : 1 ,000) à 37 degrés pendant 4 heures. 2-3 ul d'Anti-CD45 (30-F11, BD Biosciences), anti-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), anti-CD3 (145-2C11, BD Biosciences), des anticorps anti-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) et anti-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) ont été ajoutés pendant 20 minutes pour la coloration de surface. Les cellules ont ensuite été lavées et remises en suspension dans 1 ml de solution Fix/Perm fraîchement préparée (BD Biosciences) à 4 degrés pendant la nuit. Après avoir été lavées avec du tampon Perm/Wash (BD Biosciences), les cellules ont été colorées avec du 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences), anti-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), et anti-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) pendant 30 minutes, lavé et fixé dans du formaldéhyde à 4% (Sigma Aldrich). Tous les échantillons ont été lus sur un cytomètre LSR Fortessa et analysés avec le logiciel FACS DIVA v. 8.0 (BD Biosciences).

Calcul du score de signature

Nous avons utilisé l'expression normalisée des gènes pour définir les signatures suivantes : infiltration de lymphocytes T CD8+ (CD8A, CD8B, PRF1 et GZMB), expression du MHC-I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) et signalisation HSF1 (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5 et HSP90B1).

analyses statistiques

Pour les expériences cellulaires, des triples biologiques ont été réalisés dans chaque expérience en général, sauf indication contraire. Pour les études animales, pas moins de 5 répétitions par groupe ont été utilisées. Les animaux ont été randomisés en différents groupes après inoculation de cellules tumorales. Les enquêteurs n'étaient pas aveugles à l'attribution pendant les expériences et l'évaluation des résultats. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes avec dérivation standard. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.). Un test t bilatéral 2-latéral a été utilisé pour comparer les groupes de traitement avec les groupes témoins ; La fonction de survie a été estimée par les méthodes de Kaplan – Meier et le test du log-rank a été utilisé pour calculer les différences statistiques.

Disponibilité des données

Les données de séquençage d'ARN (GSE99299) et les données traitées sur une seule cellule (GSE123814) ont été obtenues à partir de Gene Expression Omnibus (GEO). Les données protéomiques MS (PXD006003) ont été obtenues à partir du référentiel PRIDE. Les ensembles de données TCGA sur le cancer ont été obtenus auprès de UCSC Xena (//xena.ucsc.edu/). Les données d'ARN-seq et les informations cliniques pour les essais cliniques ICB ont été fournies par les auteurs correspondants respectifs. Toutes les données brutes étayant les résultats de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant. Les données sources sont fournies dans cet article.

Disponibilité des codes

Toutes les analyses utilisées dans cette étude ont été effectuées conformément aux manuels de Prism Graphpad version 8.0 et au site Web en ligne http://xena.ucsc.edu/. Aucun nouveau code ou algorithme n'a été développé au cours de cette étude.

Données étendues

Données étendues Fig. 1 :

LIMIT est en corrélation avec les gènes immunitaires effecteurs dans plusieurs types de cancer.

Données étendues Fig. 2 :

Locus génétiques et séquences de LIMIT humain et de souris Limit.

Données étendues Fig. 3 : LIMIT augmente l'expression du CMH-1

Données étendues Fig. 5 :

LIMIT augmente l'expression du CMH-1 chargé en antigène in vivo.

Données étendues Fig. 6 :

LIMIT active les GBP en cis pour renforcer le CMH-1 et l'immunité tumorale.

Données étendues Fig. 7 :

Les GBP activent HSF1 pour stimuler l'expression du CMH-I.

Données étendues Fig. 8 :

HSF1 pilote l’expression du CMH-I et l’immunité tumorale.

Données étendues Fig. 9 :

Les gènes de signalisation HSF1 étaient corrélés au CMH-I et à l'immunité tumorale.

Données étendues Fig. 10 : Schéma montrant comment l'axe LIMIT-GBP-HSF1 affecte le CMH-I et l'immunité tumorale

Matériel complémentaire

Reportez-vous à la version Web sur PubMed Central pour obtenir du matériel supplémentaire.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Zou pour leur apport intellectuel. Ce travail a été soutenu en partie par les subventions de recherche des subventions US NIH/NCI R01 (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ) et (CA216919, CA213566, CA120458 (MC) et du NIH par l'intermédiaire de l'Université. du Michigan Rogel Cancer Center Grant (CA46592).

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