Lipidomics révèle des altérations des lipides rénaux induites par le cisplatine lors d'une lésion rénale aiguë et leur atténuation par la cilastatine
Feb 21, 2022
Résumé: La néphrotoxicité est une complication majeure de la chimiothérapie à base de cisplatine, entraînant deslésion rénaleen env. 30 % des patients, sans intervention préventive ni traitement disponible pour une utilisation clinique. La cilastatine s'est avérée exercer un effet néphroprotecteur pour les thérapies au cisplatine dans des modèles in vitro et in vivo, ayant récemment fait l'objet d'essais cliniques. Une compréhension plus approfondie au niveau moléculaire des effets induits par le cisplatineatteinte rénaleet l'effet d'agents protecteurs potentiels pourrait être essentiel pour développer des thérapies néphroprotectrices efficaces et pour établir de nouveaux biomarqueurs deatteinte rénaleetnéphroprotection. Une approche lipidomique ciblée, utilisant la LC-MS/MS, a été employée pour la quantification de 108 espèces lipidiques (comprenant des phospholipides, des sphingolipides et du cholestérol libre et estérifié) dansun reinextraits de cortex et de medulla de rats traités avec du cisplatine et/ou de la cilastatine. Jusqu'à 56 et 63 espèces lipidiques se sont avérées altérées dans le cortex et la moelle, respectivement, après traitement au cisplatine. Le co-traitement avec la cilastatine a atténué bon nombre de ces changements lipidiques, totalement ou partiellement par rapport aux niveaux de contrôle. L'analyse multivariée a révélé que les espèces lipidiques peuvent être utilisées pour discrimineratteinte rénaleetnéphroprotection, les esters de cholestérol étant les espèces les plus discriminantes, avec les sulfatides et les phospholipides. Biomarqueurs diagnostiques potentiels de cisplatine induite atteinte rénaleet la cilastatinenéphroprotectionont également été retrouvés.
Mots clés:lipidomique; cisplatine; lésion rénale aiguë; cilastatine; néphroprotection; biomarqueurs; les esters de cholestérol ; les sphingolipides; phospholipides; chimiothérapie
Introduction La néphrotoxicité est un effet secondaire grave de la chimiothérapie au cisplatine [1], avec deslésion rénale(AKI) en cours de développement en ca. 30 pour cent des patients traités [2]. C'est aussi le principal facteur dose-limitant et un inconvénient important des thérapies à base de cisplatine, l'un des traitements les plus pertinents pour les tumeurs solides [2]. Le cisplatine s'accumule et endommagerénalles cellules épithéliales du tubule proximal (RPTEC), et les dommages se localisent particulièrement dans le segment S3 du tubule proximal, descendant durénalcortex vers la jonction corticomédullaire et la moelle externe [3]. Cependant, des dommages directs à la boucle de Henle médullaire ont également été suggérés [4,5]. Une série d'événements cellulaires ont lieu en relation avecrénallésion des cellules tubulaires, suite à l'absorption de cisplatine, y compris le stress oxydatif, le stress nitrosatif, les lésions vasculaires, l'inflammation, les lésions mitochondriales ou l'inhibition de Na plus , K plus - ATPase dans la membrane cellulaire et le stress du réticulum endoplasmique, suivi de la mort des cellules du tubule proximal principalement par apoptose (impliquant toutes deux des voies intrinsèques et extrinsèques) ou nécrose, entraînant une perte defonction rénale[2,6,7]. Cela se manifeste par la diminution du taux de filtration glomérulaire (TFG) et des taux sériques de magnésium et de potassium, avec une augmentation de l'azote uréique sanguin (BUN) et de la créatinine sérique [2].
Diverses approches ont été étudiées pournéphroprotectionlors de thérapies au cisplatine à la fois in vitro et in vivo, basées sur un certain nombre de cibles moléculaires [7–9]. Cependant, la possible perturbation de l'effet cytotoxique du cisplatine sur les cellules tumorales et un effet protecteur souvent incomplet ont limité le développement des rénoprotecteurs [9]. En conséquence, il n'existe aucune intervention à usage clinique qui prévienne ou traite avec succès l'IRA induite par le cisplatine [7]. Une meilleure compréhension des voies moléculaires liées à l'IRA induite par le cisplatine et des cibles potentielles pournéphroprotectionsemble cruciale à cet égard.
Il a été prouvé que la cilastatine protège efficacementun reindes dommages causés par plusieurs agents, dont le cisplatine [10,11], la gentamicine [12], la vancomycine [13], la cyclosporine A et le tacrolimus [14], dans des modèles in vitro et in vivo. La cilastatine exerce son effet protecteur en inhibant sélectivementrénaldéhydropeptidase I (DHP-I) localisée dans les radeaux lipidiques en bordure en brosse des RPTEC [11]. En conséquence, les processus impliquant l'extériorisation membranaire tels que l'apoptose extrinsèque médiée par Fas sont altérés par la cilastatine et la progression deatteinte rénaleaprès une insulte toxique est détenu [11]. Outre l'altération de l'apo tose extrinsèque par la cilastatine, le stress oxydatif, l'inflammation et l'accumulation de composés néphrotoxiques ont tous été réduits [10–13,15,16]. Ainsi,fonction rénalereste conservé sous co-traitement avec le cisplatine et la cilastatine [11]. Récemment, la cilastatine a terminé avec succès les essais cliniques de phase I pour son utilisation comme néphroprotecteur et est sur le point d'entrer dans les essais de phase II. Une étude récente prometteuse a également révélé que la cilastatine (administrée sous forme d'imipénème plus cilastatine) peut avoir un effet rénoprotecteur chez les patients atteints de carcinose péritonéale lors d'un traitement par cisplatine intrapéritonéal hyperthermique [17].
Ces dernières années, les technologies omiques, en particulier la protéomique [18,19] et la métabolomique [20-23], se sont révélées utiles pour la découverte de nouveaux biomarqueurs diagnostiques précoces de l'IRA, en plus de l'urée ou de la créatinine dans le sérum [18,20]. De plus, l'analyse métabolomique peut fournir des informations précieuses pour la compréhension des mécanismes de cisplatine de la néphrotoxicité [5,24] et l'effet thérapeutique des néphroprotecteurs potentiels [25-27].
En particulier, la lipidomique peut également fournir des informations pertinentes concernantmaladie du rein[28], considérant que les lipides jouent un rôle clé dans la structure, la signalisation cellulaire et le métabolisme, et qu'ils peuvent être altérés dans les cellules, les tissus et les biofluides sousrénalétats pathologiques [29,30]. À cet égard, des niveaux accrus de triglycérides et d'acides gras non estérifiés ont été trouvés dans leun reinpendant le traitement au cisplatine [31], en plus des lipides neutres tal [32]. Des niveaux élevés de sphingolipides - céramides (Cer) et hexosyl céramides (HexCer) - ont également été observés dans lerénalcortex au cours de l'IRA induite par le cisplatine [33]. D'autre part, les espèces de phospholipides, y compris les espèces de phosphatidylcholine (PC), de phosphatidyléthanolamine (PE) et de lysophosphatidylcholine (LPC), se sont également avérées altérées danstissu rénalou des cellules pendant le traitement au cisplatine [26]. Les niveaux de diverses espèces de LPC se sont également avérés modifiés dans le sérum de rat après l'administration de cisplatine [23]. De plus, une approche semi-quantitative non ciblée par imagerie par spectrométrie de masse a permis de comparer la distribution des lipides chez le ratun reinsections et ont suggéré que le cis platine entraînait des altérations sur divers phospholipides (PC, PE, phosphatidylglycérols (PG), phosphatidylinosytols (PI), phosphatidylsérines (PS), acides phosphatidiques (PA)), sulfatides (Sulf) ou cardiolipines) [34] (montrant un comportement différent dans le cortex et la moelle), tandis que le co-traitement avec la cilastatine avait tendance à atténuer certains de ces changements [4].
Dans ce travail, nous sommes allés plus loin et avons examiné de plus près les lipides structuraux importants dans leun rein, tels que les phospholipides (PC, LPC et PE), les sphingolipides (Sulf, sphingomyélines (SM), dihydrosphingomyélines (dhSM), Cer, dihydrocéramides (dhCer), HexCer, dihydrohexosylcéramides (dhHexCer)), et le cholestérol libre (FC) et ses composés estérifiés (esters de cholestérol (CE)), couvrant de nouvelles classes et espèces de lipides et utilisant une approche quantitative ciblée plus fiable basée sur la chromatographie liquide couplée à l'analyse par spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Au total, 108 espèces lipidiques ont été quantifiées à la fois surrénaldes extraits de cortex et de moelle de rats traités, afin de mieux comprendre l'effet néphrotoxique du cisplatine et l'effet néphroprotecteur de la cilastatine. De nouvelles informations sur l'impact du cisplatine associé à l'IRA surrénaldes espèces lipidiques ont été obtenues et des informations supplémentaires ont été obtenues sur l'effet protecteur de la cilastatine, ce qui a conduit à une atténuation de certaines des altérations lipidiques spécifiques causées par le cisplatine soit dans lerénalcortex ou moelle. Divers biomarqueurs potentiels induits par le cisplatineatteinte rénaleetnéphroprotectionavec la cilastatine ont également été trouvés.
Résultats
Effet protecteur de la cilastatine contre les lésions rénales induites par le cisplatine
Évaluation defonction rénalechez des rats traités au cisplatine et/ou à la cilastatine a d'abord été réalisée en utilisant plusieurs indicateurs biochimiques dans le sérum et l'urine. Comme le montre le tableau 1, la créatinine sérique, l'urée, les protéines urinaires, le volume urinaire et l'excrétion fractionnelle de sodium et de potassium ont été significativement augmentés en raison du traitement au cisplatine par rapport au groupe témoin, tandis que le co-traitement avec la cilastatine et le cisplatine a entraîné leur diminution par rapport avec des niveaux de contrôle. D'autre part, le DFG a été diminué chez les rats traités au cisplatine par rapport aux échantillons témoins, alors que la co-administration de cilastatine a diminué cet effet. Ces résultats confirmentatteinte rénaleinduite par le cisplatine et protection par la cilastatine. La cilastatine seule n'a montré aucun effet surfonction rénaleparamètres.
Une analyse histopathologique a également été réalisée sur des coupes colorées à l'hématoxyline/éosine pour étudier les altérations morphologiques liées àatteinte rénale. La figure 1 montre les signes de dommages induits par le cisplatine dans la partie proximalerénaltubules, y compris le gonflement des tubules, le détachement des débris cellulaires ou la perte de la membrane de la bordure en brosse (figure 1C, G, I). L'accumulation de moulages de protéines a également été observée dans les tubules du cortex et de la médulla (figure 1C, G, respectivement). Cela contraste avec la morphologie normale observée dans les groupes de contrôle ou de cilastatine dans le cortex (figure 1A, B, respectivement) et la médulla (figure 1E, F, respectivement). Le co-traitement de la cilastatine avec le cisplatine a entraîné une nette réduction de toutes ces altérations induites par le cisplatine dans le cortex et la médulla (Figure 1D, H, J).
Cisplatine Altération des classes globales de lipides rénaux dans le cortex et la médulla. Effet protecteur de la cilastatine
Les niveaux totaux de différentes classes de lipides, y compris les stérols (CE, FC), les phospholipides (LPC, PC, PE) et les sphingolipides (Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, Sulf, SM, dhSM) ont été déterminés dans lerénalcortex et medulla, afin d'évaluer l'effet global du cisplatine sur les lipides au cours de l'IRA. Les résultats complets de l'analyse des lipides se trouvent dans le tableau S1. Comme on peut le voir sur la figure 2A, B, des tendances assez similaires ont été observées dans le cortex et la médulla pour tous les groupes. CE et Cer ont été significativement augmentés, tandis que SM, dhSM et PE ont été diminués, à la fois dans le cortex et la médulla pendant le traitement au cisplatine, par rapport aux groupes témoins. Parmi ceux-ci, Cer et CE subissent les changements induits par le cisplatine les plus importants observés. De plus, dhCer et HexCer ont été significativement augmentés dans la moelle, tandis que dans le cortex, dhHexCer a été augmenté et LPC et Sulf ont diminué pendant le traitement au cisplatine.
Figure 1. Analyse histopathologique de l'hématoxyline/éosine coloréerénalmontre la protection de la cilastatine contre les dommages induits par le cisplatine. Les images sont présentées à un grossissement de 20 × pour le cortex de contrôle (A) ; (B) cortex de cilastatine ; (C) cortex de cisplatine ; (D) cisplatine plus cortex de cilastatine ; (E) moelle de contrôle ; (F) moelle de cilastatine ; (G) medulla de cisplatine ; et (H) cisplatine plus medulla de cilastatine. La barre d'échelle de A à H représente 100 µm. Des images détaillées derénalles tubules à un grossissement de 60 × sont affichés pour (I) le cisplatine et (J) le cisplatine plus la cilastatine. La barre d'échelle pour I et J représente 25 µm.Rénalles indicateurs de dommages sont représentés : → : accumulation de cylindres protéiques dansrénaltubules. & région : gonflement des tubules. * : perte de la membrane de la bordure en brosse. # : détachement des débris cellulaires.
La co-administration de cilastatine et de cisplatine a eu tendance à atténuer certaines de ces modifications lipidiques induites par le cisplatine, ce qui n'a entraîné aucune différence par rapport aux groupes témoins dans le cas des taux de Cer et de dhHexCer dans le cortex, ou de dhCer, HexCer, SM, dhSM et PE niveaux dans la moelle. De plus, dans le cas d'une augmentation de CE induite par le cisplatine dans le cortex, la cilastatine co-administrée avec le cisplatine a entraîné une diminution significative des taux par rapport au groupe cisplatine, bien que la récupération ait été partielle par rapport aux groupes coiatrol. Le reste des classes de lipides altérés par le cisplatine est resté non récupéré pendant le co-traitement avec cilastatisi. D'autre part, la cilastatine elle-même n'a eu aucun effet sur les lipides du cortex et de la médulla, à l'exception du LPC et du dhCer dans le cortex, qui semblaient être diminués et augmentés, respectivement, par rapport au groupe témoin. Les niveaux totaux de FC, PC et dhHexCer n'ont montré aucun changement significatif dans le cortex et la moelle après le traitement au cisplatine.
La figure 2C, D affiche les cartes thermiques de corrélation pour les classes de lipides dans le cortex et la médulla, respectivement, offrant des tendances similaires.
Alitration individuelle des espèces de lipides rénaux par traitement au cisplatine. Egect atténuant la cilastatine
Esters de cholestérolAnalyse de cinq espèces CE individuelles (CE 18 :1, CE 18 :2, CE 18 :0, CE 20 :4 et CE 22 :6) réalisées dans lerénalle cortex et la moelle ont révélé que le cisplatine augmentait significativement chacun d'eux par rapport aux niveaux de contrôle (Figure 3). D'autre part, la co-administration de cilastatine et de cisplatine a entraîné une diminution générale des niveaux d'espèces CE individuels par rapport au traitement au cisplatine, ce qui était statistiquement significatif pour toutes les espèces CE dans le cortex et CE 18: 2 dans la moelle, comme on peut le voir. vu dans la figure 3. Cette récupération dans les espèces CE du cortex due au co-siège de la cilastatine était partielle par rapport aux niveaux du groupe témoin, alors qu'aucune récupération statistiquement significative dans la plupart des espèces de la médelle CE (à l'exception de CE 18: 2) n'a été observée pour la co-administration de la cilastatine par rapport au cisplatine. Les résultats complets de l'analyse statistique sur les espèces de lipides du cortex et de la moelle sont présentés dans les tableaux S2 et S3, respectivement.
Sphingolipides : Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, SM, dhSM et SulfAu total, 43 espèces de sphingolipides ont été quantifiées dans lerénalcortex et medulla pour évaluer l'impact du traitement au cisplatine et à la cilastatine sur leurs niveaux, comme illustré à la figure 4. peut être vu, le traitement au cisplatine a entraîné une augmentation significative de 19 espèces de trois classes dans lerénalcortex et médullaire. Encore une fois, le co-traitement avec le cisplatine et la cilastatine montre une tendance à atténuer l'effet du cisplatine, avec une diminution générale des taux de lipides modifiés par le cisplatine dans le cortex et la moelle. En fait, pour les espèces dhCer (figure 4B) et dhHexCer (figure 4D), aucune différence n'a été observée entre les groupes traités au cisplatine plus cilastatine et les groupes témoins pour les espèces modifiées au cisplatine, indiquant un rétablissement complet. Dans le cas de Cer (Figure 4A) et HexCer (Figure 4C), ce recoeery était également le cas pour certaines espèces altérées, telles que HexCer 34:1 (cortex et medulla) et HexCer 38:1 et HexCer 42:1 (medulla ); Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 et Cer 42:2 dans le cortex ; et Cer 34: 1 et Cer 42: 2 dans la moelle, étant totalement ou partiellement récupérés. À l'inverse, le traitement cisplatine plus cilastatine a encore montré des différences significatives par rapport aux groupes témoins pour Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 et HexCer 36:1 dans la moelle, sans récupération, pointant à un bien meilleur effet de récupération exercé par la cilastatine dans le cortex que dans la moelle pour Cer et HexCer.
Dans le cas des espèces SM (Figure 4E) et dhSMt (Figure 4F), le cisplatine a entraîné une diminution du cortex et de la moelle épinière pour les espèces à chaîne la plus courte et la plus longue, ce qui était statistiquement significatif pour SM 34:1, dhSM 34 :{{ 5}}, SM 42:2, SM 42:1 et dhSM 42:1. En revanche, l'effet observé pour le traitement au cisplatine sur les espèces SM et dhSM à chaîne intermédiaire dans le cortex et la médulla était une augmentation, qui était statistiquement significative pour le dhSM 36 :0 (à la fois dans le cortex et la médulla) et le dhSM 4{{ 15}} :0, SM 36 :1, SM 38 :1 et SM 40 :1 dans la moelle. La co-administration de cisplatine et de cilastatine a eu tendance à normaliser les niveaux d'espèces SM et dhSM dans de nombreux cas, avec SM 34: 1, SM 36: 1, SM 38: 1, SM 40: 1, SM 42: 2, SM 42: 1, dhSM 36: 0, dhSM 40: 0 et dhSM 42: 1 ne montrant aucune différence par rapport aux groupes témoins dans la moelle. Enfin, certaines espèces Sulf ont également été altérées par le traitement au cisplatine dans lerénalcortex et medulla, comme le montre la figure 4G. Alors que Sulf 40:1 s'est avéré significativement augmenté à la fois dans le cortex et la moelle après traitement au cisplatine, d'autres espèces telles que Sulf-OH 40:1 ou Sulf-OH 42:2 à longue chaîne, Sulf-OH 42: 2 ont été diminués dans le cortex, Sulf 42: 0 et Sulf-OH 42: 1 étant également diminués à la fois dans le cortex et la moelle. La cilastatine co-administrée avec le cisplatine a de nouveau entraîné un léger effet de récupération, en particulier pour Sulf 40: 1 (cortex et medulla) et Sulf 40: 2 et Sulf-OH 42: 1 (medulla), ne montrant aucune différence par rapport aux groupes témoins.
Phospholipides : PC, PE et LPCLa quantification de 60 espèces de phospholipides (28 PC, 20 PE et 12 LPC) a été réalisée dans lerénalcortex et medulla pour l'évaluation des altérations potentielles induites par le cisplatine et de l'effet rénoprotecteur de la cilastatine. Les résultats pour les espèces de PC sont présentés dans la figure 5A,B, respectivement. Comme on peut le voir, le cisplatine a modifié de manière significative jusqu'à 19 espèces de PC dans le cortex ou la moelle. La plupart de ces espèces de PC ont été diminuées par le cisplatine, à l'exception de PC 40:2, PC 40:4 et PC 34:2, qui ont été augmentées dans le cortex. La fraction d'espèces de PC hautement insaturées a été considérablement réduite à la fois dans la moelle et le cortex, tandis que la fraction d'espèces contenant deux doubles liaisons a été considérablement augmentée, comme on peut le voir sur la figure 5C,D. Le traitement par le cisplatine et la cilast atine a montré des effets similaires à ceux précédemment observés, avec un certain effet atténuant observé, conduisant dans certains cas à une récupération complète des niveaux de PC, sans différence significative avec le groupe témoin, ou à une récupération partielle. Cette récupération a été principalement observée dans Les résultats de la détermination des espèces de PE dans le cortex et la médulla sont illustrés à la figure 6A,B, respectivement. Un total de 16 espèces de PE ont été significativement modifiées par le cisplatine dans le cortex ou la médulle, le plus grand nombre d'espèces modifiées se trouvant dans la médulle. Dans la plupart des cas, les espèces de PE ont été diminuées par le traitement au cisplatine, à l'exception de PE 38: 2, PE 40: 6 et PE 40: 4, qui ont été augmentées soit dans le cortex, la médulla, soit à la fois le cortex et la médulla, respectivement. En conséquence, compte tenu de la longueur totale des chaînes d'acides gras dans les espèces de PE dans la moelle, la quantité totale de PE avec 34, 36 et 38 C a été considérablement réduite avec le cisplatine, tandis que les espèces de 40 C ont été augmentées, comme le montre la figure 6C. . Le co-traitement de la cilastatine avec le cisplatine a atténué la plupart des changements induits par le cisplatine dans les espèces PE individuelles trouvées dans la moelle, offrant des niveaux sans différences significatives par rapport aux groupes témoins dans 11 des 15 espèces altérées par le cisplatine dans la moelle, avec 2 espèces de PE supplémentaires partiellement récupéré. Cependant, dans le cortex, seules 2 des 11 espèces altérées par le cisplatine ont été récupérées avec de la cilastatine à des niveaux de contrôle, 2 espèces de PE supplémentaires étant partiellement récupérées. Semblable aux observations pour les espèces PC, la fraction des espèces PE hautement insaturées a été significativement diminuée dans la moelle, tandis que la fraction des espèces contenant des doubles liaisons 1-3 a été significativement augmentée, comme le montre la figure 6D.
En ce qui concerne l'analyse des espèces LPC, la plupart des changements induits par le cisplatine observés ont été trouvés dans lerénalcortex, où LPC 16:1, LPC 16 :0, LPC 18:1, LPC 18 :0 , LPC 20:3, LPC 22:6 et LPC 22:5 ont été significativement diminués avec par rapport aux échantillons de contrôle, comme on peut le voir sur la figure 7A. D'autre part, LPC 17: 1 et LPC 18: 2 se sont avérés être augmentés dans la moelle pendant le traitement au cisplatine (figure 7B). Le co-traitement avec le cisplatine et la cilastatine n'a eu aucun effet de récupération sur les espèces LPC du cortex. A l'inverse, LPC 17:1 et LPC 18:2 ont été récupérés dans la moelle, sans différence significative par rapport aux échantillons témoins.
Lipides rénaux comme variables de classification pourLésions rénaleset Protection
Une analyse multivariée a été réalisée en utilisant toutes les variables lipidiques mesurées dans le cortex et la moelle épinière pour évaluer si ces espèces pouvaient servir à la classification des groupes et à la détection des effets induits par le cisplatine.atteinte rénaleetnéphroprotectionpar la cilastatine. L'analyse en composantes principales (PCA) et les projections orthogonales à l'analyse de discrimination des structures latentes (OPLS-DA) ont été effectuées en utilisant séparément les lipides du cortex ou de la moelle, comme illustré à la figure 8. Analyse PCA du cortex (figure 8A) et de la moelle (figure 8B) les lipides ont offert aux modèles la capacité de montrer une séparation claire du groupe cisplatine par rapport aux groupes contrôle et cilastatine, ces deux derniers se regroupant étroitement. D'autre part, le groupe traité par cisplatine plus cilastatine avait tendance à se séparer du groupe cisplatine et à se situer entre les groupes contrôle et cisplatine, suggérant des différences entre les groupes. Tous les modèles PCA présentaient des R2 supérieurs à 0.7 et des valeurs Q2 supérieures à 0.5.
L'analyse OPLS-DA multi-groupes a également montré un regroupement clairement séparé des différents groupes à l'aide de variables lipidiques du cortex (figure 8C) ou de la moelle épinière (figure 8D). Les modèles OPLS-DA ont présenté des valeurs Q2 acceptables et des valeurs R2 supérieures à 0.7 et se sont avérées valides lors des tests de permutation pour 100 itérations, comme le montre la figure 8E,F. Les caractéristiques avec une importance variable dans les scores de projection (VIP) supérieurs à 1 peuvent être trouvées dans la figure 8G, H, indiquant respectivement les lipides du cortex ou de la médulla, qui ont un impact plus élevé sur la séparation des groupes. Ceux-ci comprenaient diverses espèces de lipides des classes CE, sphingolipides et phospholipides. Déterminer les différences lipidiques spécifiques entre les groupes individuels liés au traitement au cisplatine etnéphroprotection, une autre analyse OPLS-DA a été effectuée séparément avec les lipides du cortex et de la moelle, comme on peut le voir sur les figures 9 et 10, respectivement. Des modèles OPLS-DA ont été construits pour le cisplatine par rapport au groupe témoin, le cisplatine plus cilastatine par rapport au cisplatine, ainsi que le cisplatine plus cilastatine par rapport au groupe témoin. Les modèles OPLS-DA les plus discriminants étaient ceux entre le contrôle et les groupes traités au cisplatine ou au cisplatine plus cilastatine, compte tenu de leurs valeurs R2 et Q2 les plus élevées, avec une validation appropriée basée sur les résultats des tests de permutation avec 100 cycles (Figure 9A, B, D, E et Figures 10A, B, D, E).
D'autre part, les modèles OPLS-DA pour les groupes cisplatine plus cilastatine et cisplatine, tous deux utilisant des lipides du cortex (Figure 9C) ou de la moelle épinière (Figure 10C), permettaient également une discrimination de groupe, avec des valeurs R2 et Q2 raisonnables. et les résultats de validation appropriés des tests de permutation de cycle 100- (figures 9F et 10F), les lipides médullaires étant ceux présentant une meilleure prévisibilité. Les parcelles en S pour les différents modèles OPLS-DA sont incluses dans la figure 9G,H,I et la figure 10G,H,I, pour les caractéristiques lipidiques du cortex ou de la médulla. Espèce avec un |p(corr)| supérieurs à 0,5 et les scores VIP supérieurs à 1 ont été marqués dans les S-plots comme les caractéristiques les plus pertinentes pour la discrimination des groupes. Des données complètes, y compris les valeurs p (corr) et VIP des modèles OPLS-DA, ainsi que les statistiques univariées pour chaque espèce de lipide, peuvent être trouvées dans les tableaux supplémentaires S2 (lipides du cortex) et S3 (lipides de la moelle). Il semble clair querénalles lipides du cortex et de la médullaire peuvent servir de critères discriminants pour laatteinte rénaleet pour la cilastatinenéphroprotectionpendant le traitement au cisplatine.
Lipides rénaux en tant que biomarqueurs potentiels des lésions rénales induites par le cisplatine Afin de sélectionner des biomarqueurs lipidiques potentiels des lésions rénales
causée par le cisplatine, une combinaison de critères multiples de valeurs p statistiquement significatives issues d'une analyse univariée du cisplatine par rapport aux groupes témoins, ainsi que des valeurs p(corr) et VIP trouvées dans le modèle OPLS-DA correspondant, a été utilisée. Lipides sélectionnés avec des valeurs p <0.05 ; fdr="">< 0.1 ;="" |p(corr)|=""> 0,5 et VIP > 1 peuvent être trouvés dans le tableau 2 (lipides du cortex) et le tableau 3 (lipides médullaires), où le changement de pli (FC) et les aires sous la courbe (AUC) pour les courbes de caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC) sont également inclus.
Comme on peut le voir, jusqu'à 40 lipides de la moelle et 27 lipides du cortex, comprenant des espèces CE, des sphingolipides et des phospholipides, sont sélectionnés dans les tableaux 2 et 3, respectivement. Les valeurs d'ASC pour les courbes ROC obtenues pour chaque lipide étaient supérieures à 0.85 et, dans la plupart des cas, proches de 1, indiquant de bonnes capacités de discrimination de l'espèce entre le cisplatine et les groupes témoins. Remarquablement, les espèces CE augmentées de cisplatine (CE 18 :1, CE 18 :2, CE 18 :0, CE 20 :4 et CE 22 :6) semblent être les plus discriminantes. caractéristiques à la fois dans la moelle et le cortex, montrant les valeurs FC, VIP, p(corr) et AUC les plus élevées. dhHexCer 34:0 est un autre lipide accru dans le cortex avec un FC élevé et des scores pertinents. D'autre part, les sulfatides tels que Sulf 42: 0, Sulf-OH 40: 1 ou Sulf-OH 42: 1 sont également très pertinents dans le cortex, tandis que PE 36: 5, PE 38: 6, PE 38: 5 PC 36:5 ou PC 36:6 sont également très importants dans la moelle, tous étant diminués pendant le traitement au cisplatine.
Lipides rénaux comme biomarqueurs potentiels de la néphroprotection de la cilastatine
Pour sélectionner les biomarqueurs lipidiques potentiels de la protection de la cilastatine contre la néphrotoxicité du cisplatine, la même approche à critères multiples que dans la section 2.5 a été appliquée en utilisant une analyse univariée des groupes cisplatine plus cilastatine par rapport aux groupes cisplatine, et les valeurs p (corr) et VIP trouvées dans l'OPLS- correspondant Modèle DA. Lipides sélectionnés avec des valeurs p <0.05 ; fdr="">< 0.1 ;="" |p(corr)|=""> 0,5 et VIP > 1 peuvent être trouvés dans le tableau 4 (lipides du cortex) et le tableau 5 (lipides médullaires), où FC et AUC pour les courbes ROC ont également été calculées.
Comme on peut le voir dans le tableau 4, toutes les espèces CE (CE 18 :1, CE 18 :2, CE 18 :0, CE 20 :4 et CE 22 :6) dans le cortex pourraient être considérés comme les indicateurs les plus puissants de la protection exercée par la cilastatine, réduisant significativement, dans le même temps, les altérations induites par le cisplatine. PE 36: 5 et dhHexCer 34: 0 dans le cortex sont également des biomarqueurs potentiels importants de la protection de la cilastatine, en particulier cette dernière, qui subit une récupération totale grâce à la cilastatine vers des niveaux de contrôle. En ce qui concerne les lipides médullaires, comme le montre le tableau 5, une quantité plus élevée de biomarqueurs potentiels de la protection de la cilastatine a été trouvée que dans le cortex. Notamment, Sulf 40:2 semble être l'espèce la plus discriminante dans la moelle, compte tenu de ses scores FC et VIP les plus élevés. Diverses espèces de PC et de PE ont également été trouvées, y compris PE 36:5, PE 38:5, PE 38:6, PE 36:4, PE 34:3 et PC 36:6, pour n'en nommer que quelques-unes, en plus de Cer 42:2, dhHexCer 36:0 et HexCer 34:1, en tant que biomarqueurs significatifs de la protection de la cilastatine dans la moelle. Dans tous les cas, ces lipides étaient associés à une récupération partielle ou totale induite par la cilastatine des niveaux de contrôle par rapport à leurs niveaux modifiés par le cisplatine. Pour toutes les espèces, les valeurs AUC pour les courbes ROC obtenues étaient supérieures à 0,85, prouvant leurs bonnes capacités de discrimination
DiscussionDans ce travail, nous avons quantifié un total de 108 espèces lipidiques comprenant des lipides structuraux importants tels que les phospholipides, les sphingolipides et le cholestérol ainsi que ses formes estérifiées, sur leun reincortex et medulla de rats traités avec du cisplatine et/ou de la cilastatine. Ceci a été réalisé afin de mieux comprendre l'effet néphrotoxique du cisplatine et l'effet protecteur de la cilastatine. Jusqu'à 63 espèces de lipides ont été significativement modifiées dans la moelle par le traitement au cisplatine, tandis que 56 espèces de lipides ont été affectées dans le cortex, reflétantatteinte rénaledans les deux régions. Bien que, traditionnellement, la plupart des études sur l'IRA induite par le cisplatine se concentrent sur les cellules des tubules proximaux etrénalles lésions corticales, où l'accumulation de médicament est principalement concentrée, des études récentes indiquent que les lésions médullaires peuvent même être aussi graves que dans le cortex, sur la base des tests d'apoptose TUNEL [5]. Cela pourrait être lié à l'accumulation de cisplatine dans le segment S3 des tubules proximaux [3,5], descendant vers la médulla externe, en dehors des dommages directs et secondaires potentiels de l'anse de Henle [4]. De plus, la moelle a été signalée comme la plus sensiblerénalzone pour observer les modifications globales des métabolites liées au cisplatine par rapport au cortex [5]. Nos résultats précédents ont également mis en évidence un dommage direct des cellules médullaires (en dehors des dommages secondaires) par le cisplatine, reflété dans diverses altérations des phospholipides et des cardiolipines [4]. Ces nouveaux résultats élargissent ces observations avec des espèces et des classes de lipides supplémentaires modifiées par le cisplatine et renforcent la pertinence des lésions médullaires dans l'IRA induite par le cisplatine.
Bien que FC dansun reinn'a pas été modifié de manière significative par le traitement au cisplatine, à la fois la CE totale et toutes les espèces de CE individuelles mesurées ont été remarquablement augmentées à la fois dans le cortex (augmentation de huit fois pour la CE totale) et dans la moelle épinière (augmentation de quatre fois pour la CE totale) en association avec le cisplatine induitatteinte rénale.Le cholestérol est un composant clé des membranes plasmiques, s'intercalant parmi les phospholipides et influençant la fluidité, la charge de surface et les interactions des groupes de têtes polaires [35,36]. Sa présence est également fondamentale dans les radeaux lipidiques, établissant des interactions hydrophobes avec le SM, et étant essentielle pour la ségrégation des molécules et pour contrôler leur interaction avec d'autres composants de la membrane [37]. Les cellules maintiennent un équilibre du cholestérol entre la synthèse de novo dans le réticulum endoplasmique (ER) et l'absorption médiée par les LDL. La plupart du cholestérol est situé dans la membrane plasmique, mais peut également revenir au RE où le FC peut être converti (par estérification médiée par l'ACAT) en CE, qui est considéré comme une forme de stockage cytosolique du cholestérol [36]. Le CE peut également être hydrolysé en FC, constituant le cycle des esters de cholestérol [36]. Le fait que le FC n'a pas été modifié pendant le traitement au cisplatine, mais que le CE a été augmenté à la fois dans le cortex et la médulla, suggère une altérationrénalmétabolisme du cholestérol associé à l'IRA induite par le cisplatine. Des études antérieures ont montré des observations assez similaires dans les cellules du tubule proximal humain HK -2 et dans le cortex rénal de souris, au cours d'une ischémie aiguëlésion rénale, avec un FC inchangé et des niveaux de CE accrus [36]. Dans ce cas, une lésion de la membrane plasmique, déclenchant un trafic accru de FC de la membrane vers le RE, semblait être l'explication la plus plausible, entraînant une génération croissante de CE. À cet égard, les dommages aux radeaux lipidiques riches en cholestérol plutôt qu'à la membrane plasmique semblaient être plus efficaces dans l'augmentation du trafic de cholestérol vers les urgences [36]. Un rôle cytoprotecteur de CE a également été impliqué dans ces études antérieures. Une augmentation des niveaux de CE a également été signalée chez le ratrénalcortex au cours de la néphropathie diabétique de stade précoce [29]. Les résultats sont également en accord avec une augmentation globale des lipides neutres chezrénaltubules proximaux rapportés lors d'un traitement par cisplatine [32]. Nos résultats indiquent pour la première fois une augmentation globale du CE total en plus des espèces de CE individuelles, à la fois dans lerénalcortex et medulla, pendant l'IRA induite par le cisplatine. La cilastatine elle-même, d'autre part, semblait augmenter légèrement CE 18 :0 et CE 22:6 uniquement dans le cortex, bien que les niveaux totaux de FC ou de CE n'aient pas été modifiés. Ce léger effet pourrait être dû au fait que sa cible, DHP-I, est située dans les radeaux lipidiques du tubule proximal (principalement dans le cortex), et qu'une petite perturbation de la membrane pourrait être impliquée lors de son interaction. La co-administration de cisplatine et de cilastatine, d'autre part, a entraîné une réduction de toutes les espèces CE augmentées de cisplatine dans le cortex, tandis que dans la moelle, presque aucun effet de récupération n'a été observé, avec seulement une récupération partielle de CE18: 2 . Cela souligne l'action spécifique de la cilastatine dans les cellules du tubule proximal, exerçant une protection significative de l'expansion de la mort cellulaire liée aux dommages directs du cisplatine sur la membrane plasmique et les radeaux lipidiques dans le cortex, tandis que les dommages cellulaires liés au déséquilibre du cholestérol dans l'ensemble de la moelle semblent rester largement sans protection.
Les sphingolipides sont des lipides actifs principalement présents dans les membranes cellulaires et sont assez riches en radeaux lipidiques [37]. Les céramides sont les métabolites centraux du métabolisme des sphingolipides, impliquant diverses molécules et enzymes jouant un rôle important dans les processus cellulaires, notamment la croissance cellulaire, l'apoptose, la différenciation, la résistance aux médicaments et la sénescence [38,39]. De plus, les sphingolipides participent aux voies liées à la mort des cellules cancéreuses au cisplatine et à l'IRA [33]. Les céramides peuvent être générés par plusieurs voies, dont la synthèse de novo, l'hydrolyse de la sphingomyéline ou le recyclage de sphingolipides complexes [38]. La synthèse de novo est la voie principale et a lieu dans le RE, à partir du palmitoyl-CoA et de la sérine, à travers une série de voies enzymatiques pour produire de la sphinganine, qui conduit aux dihydrocéramides via la dihydrocéramide synthase (CerS). Enfin, la désaturation de dhCer génère Cer [40]. Le SM peut également être hydrolysé par des sphingomyélinases, produisant Cer. Cer peut être transformé en sphingolipides plus complexes dans l'appareil de Golgi : phosphorylé pour générer Cer-1-P, une molécule de signalisation ; converti en SM par l'action de la SM synthase ; ou glycosylés pour produire des hésoxylcéramides (glucosyl- ou galactosyl-céramides), précurseurs des sulfatides [38]. Cer peut également être dégradé en sphingosine, un précurseur de la sphingosine-1-phosphate (S1P), qui joue un rôle important dans la survie et la prolifération cellulaire, l'inflammation et la résistance aux médicaments [39]. Enfin, la dégradation du S1P en éthanolamine et hexadécénal est la voie de sortie de cette voie [38].
Lors de la quantification des espèces de sphingolipides, une augmentation globale des niveaux totaux de Cer, dhCer, HexCer et dhHexCer a été observée pendant le traitement au cisplatine, ce qui était particulièrement pertinent pour Cer. Différences par rapport au contrôleun reinétaient plus évidentes lorsque les sous-espèces individuelles étaient quantifiées, 19 espèces sur 22 étant augmentées soit dans le cortex (11 espèces) et/ou dans la moelle épinière (18 espèces) avec un traitement au cisplatine. Ceci est en accord avec les observations précédentes indiquant une augmentation de Cer et HexCer chez la sourisrénalcortex associé au traitement au cisplatine [33], mais ici, nous avons constaté que la moelle est également affectée par cet effet.
Ces observations peuvent refléter une production métabolique accrue de Cer/dhCer et HexCer/dhHexCer. D'une part, cela pourrait se faire par une activité CerS accrue, à la lumière des observations précédentes dans lerénalcortex, où l'activité de CerS à longue chaîne a été mesurée pendant le traitement au cisplatine et l'inhibition de CerS a conduit à une réduction de l'accumulation Cer/HexCer observée [33]. De plus, une réduction induite par le cisplatine des niveaux de SM/dhSM trouvés dans le cortex et la médulla suggère une production accrue supplémentaire de Cer/dhCer par hydrolyse de SM/dhSM par la voie de la sphingomyélinase (SMase) [38], avec un impact particulier sur Cer/dhCer à longue chaîne, tous étant préjudiciables dans les modèles d'IRA [40]. Cela serait également en accord avec le fait que les espèces de Cer à longue chaîne semblent être pertinentes au cours de l'IRA [40] et avec les observations antérieures d'une activité SMase accrue dans lerénalcortex au cours du traitement par cisplatine [33]. Cer est impliqué dans l'apoptose induite par le cisplatine via la signalisation dans les voies intrinsèques et extrinsèques [39]. Dans la voie mitochondriale intrinsèque, le cisplatine provoque la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale. L'augmentation de Cer, avec ses métabolites en aval, peut contribuer à cette perméabilisation, et la formation de canaux par Cer facilite l'apoptose dans la membrane mitochondriale, permettant l'entrée de Bax dans la membrane externe mitochondriale, ainsi que la sortie de cytochrome C [39]. De plus, l'apoptose extrinsèque médiée par Fas utilise le récepteur Fas situé dans les radeaux lipidiques, son regroupement étant médié par l'activation de la SMase causée par le cisplatine et l'élévation de Cer [39]. Ainsi, Cer détermine l'apoptose dans les AKI induites par le cisplatine, tandis que leur nivellement via leur transformation en HexCer semble être protecteur [33] et est associé à une résistance au cisplatine [39]. Le CER généré en grande quantité peut également affecter les propriétés physiques des membranes et peut déplacer le cholestérol et conduire son estérification [35]. D'autre part, la SM est principalement présente dans les membranes plasmiques et a une association directe avec les molécules de cholestérol, particulièrement importantes dans les radeaux lipidiques [41]. Un manque de régénération du SM pourrait être négatif pour le bon fonctionnement de la membrane [41].
Sulf sont abondants dans leun rein,en particulier dans la membrane apicale des tubules distaux [42]. Bien qu'ils ne soient pas essentiels à la vie normalefonction rénale, une carence en Sulf s'est avérée être compensée par une génération accrue de glycolipides sulfatés et de cholestérol térol [42]. Le sulfatide est un ligand clé de la L-sélectine dans leun rein,joue un rôle essentiel dans l'infiltration des monocytes dansun reininterstitiel [42]. D'autre part, la myéline associée au radeau lipidique et la protéine lymphocytaire (MAL) forment des complexes avec les sulfatides et les glycosphingolipides dansrénalmembranes, contribuant à la stabilisation et au tri des microdomaines enrichis en glycosphingolipides [42]. Nos résultats sur les altérations Sulf dans le cortex et la médulla confirment les études précédentes où diverses espèces de sulfatides étaient également supposées être altérées par le cisplatine dans le rein [34].
Toutes les espèces Cer, dhCer, HexCer et dhHexCer altérées dans le cortex par le cisplatine ont été partiellement ou totalement récupérées par la co-administration de cilastatine, tandis que dans la moelle, une grande quantité d'espèces Cer n'ont pas été récupérées, avec une récupération presque complète de dhCer , HexCer et dhHexCer. Compte tenu de l'implication de l'espèce Cer dans l'apoptose extrinsèque médiée par Fas et son blocage par la liaison de la cilastatine à la DHP-I dans les radeaux lipidiques au niveau du tubule proximal, cela pourrait expliquer l'effet protecteur et la récupération de Cer se déroulant principalement dans les cellules du cortex. En ce qui concerne le SM, le dhSM et le Sulf, la récupération de la cilastatine semble être plus pertinente dans la moelle que dans le cortex, ce qui suggère que les dommages secondaires sont altérés par l'action de la cilastatine dans les tubules proximaux atteignant la moelle externe, où la plupartatteinte rénaleest concentré [4].
Les phospholipides sont les espèces les plus abondantes dans les membranes cellulaires, où PC et, dans une moindre mesure, PE prédominent, avec une présence plus élevée de PC du côté luminal et de PE plus abondante dans le feuillet cytosolique [35,43]. Les lysophospholipides sont, d'autre part, des espèces de signalisation qui peuvent être générées à partir de l'hydrolyse des glycérophospholipides dont les LPC [35]. La plupart des 60 espèces de PC, PE et LPC quantifiées se sont avérées altérées par le traitement au cisplatine, soit dans le cortex, soit dans la médullaire, le PC et le LPC présentant une quantité plus élevée de changements dans le cortex, tandis que les changements associés à la PE étaient plus nombreux. et proéminent dans la moelle. Modifications derénalLes espèces PC, PE ou LPC à la suite d'un traitement au cisplatine sont conformes aux observations antérieures signalées dansun reinpendant l'IRA [4,5,26,34,44]. Nos résultats indiquent que la plupart des espèces PE, PC et LPC altérées ont été réduites par le cisplatine à la fois dans le cortex et la moelle. En ce qui concerne l'effet néphroprotecteur de la cilastatine, de manière frappante, un degré plus élevé d'effet de récupération partielle ou totale a été observé dans la moelle pour les lipides modifiés par le cisplatine que dans le cortex. Un autre fait intéressant est que toutes ces espèces PC, PE et LPC augmentées de cisplatine dans le cortex et la moelle ont été récupérées par la cilastatine, tandis que la plupart des espèces diminuées de cisplatine dans le cortex étaient encore altérées lors du co-traitement avec la cilastatine. Cela pourrait indiquer un degré plus élevé de dommages directs causés par l'accumulation de cisplatine dans le cortex, non protégé par la cilastatine, et entraînant la mort cellulaire et la libération associée de PC, PE (les principaux composants de la membrane cellulaire) et de LPC dans les corps apoptotiques et, par conséquent, la réduction de leurs niveaux. En revanche, les dommages secondaires associés à l'apoptose extrinsèque et à l'accumulation de fonte protéique qui en résulte dans les tubules proximaux peuvent être protégés par la cilastatine. Cela impliquerait que les espèces PC, PE et LPC ont diminué dans la moelle et sont davantage liées aux dommages cellulaires secondaires induits par le cisplatine. D'autre part, une augmentation des espèces PC, PE et LPC pourrait être associée à la régénération de la membrane cellulaire ou aux processus de signalisation, qui, selon ces résultats, pourraient être davantage liés à l'apoptose extrinsèque secondaire causée par le cisplatine et protégée par la cilastatine.
De plus, une diminution induite par le cisplatine du pourcentage d'espèces PC et PE avec des chaînes grasses hautement insaturées a également été observée, qui peut être liée aux processus de peroxydation des lipides, et serait réduite par la cilastatine [4,10,11].
Globalement, au sein des espèces lipidiques quantifiées ici, l'effet de récupération de la cilastatine a été observé dans 26 des 56 lipides modifiés par le cisplatine dans le cortex et dans 50 des 63 lipides modifiés par le cisplatine dans la moelle. Cela reflète peut-être un degré élevé de changements lipidiques associés à des dommages mitochondriaux directs non protégés exercés par le cisplatine principalement dans le cortex par rapport à la moelle, avec plus de changements lipidiques associés à une protection contre les dommages secondaires détectés dans l'ensemble de la moelle. De plus, une analyse multivariée a permis d'identifier de nouveaux biomarqueurs lipidiques potentiels pour l'IRA induite par le cisplatine et la cilastatine.néphroprotection, y compris les espèces CE, Sulf, PE, PC, Cer ou HexCer, comme décrit dans les sections 2.5 et 2.6. D'après nos résultats, CE 18: 2 et PE 36: 5 sont des biomarqueurs candidats possibles capables de discerner à la fois les dommages causés par le cisplatine et la cilastatinenéphroprotectiondans le cortex et la moelle. Cependant, comme la récupération de ces deux espèces avec la cilastatine est partielle, des espèces plus appropriées comme biomarqueurs seraient dhHexCer 34 :0 dans le cortex et Sulf 42 :0 dans la moelle, étant capable de distinguer les deuxatteinte rénaleet la protection, avec la cilastatine recouvrant complètement leurs niveaux modifiés par le cisplatine à ceux du groupe témoin. Cela pourrait être extrapolé à toute lésion rénale médiée par le ligand Fas/Fas, mais devrait être confirmé dans de futures études. Plusieurs nouveaux biomarqueurs de l'IRA ont été proposés ces dernières années, principalement des protéines (par exemple, KIM-1 [45] ou NGAL [46]). Le fait que nous ayons trouvé de nouveaux biomarqueurs potentiels de l'IRA induite par le cisplatine et de la protection associée à la cilastatine, de nature lipidique chezun reintissus, élargit les connaissances existantes et offre des options complémentaires pour un meilleur diagnostic, pronostic et suivi. En fait, une combinaison de détection de biomarqueurs pourrait même potentiellement être utilisée comme indication d'une IRA spécifique causée soit par un néphrotoxique particulier (comme le cisplatine) soit par une autre cause, et même distinguer l'état/la progression de la maladie. Une autre étape supplémentaire consisterait à déterminer si nos résultats sur lesrénalles schémas lipidiques se reflètent également dans les lipides circulants dans le sang ou dans l'urine. Cela rendrait la détection de biomarqueurs pour l'IRA induite par le cisplatine et la cilastatinenéphroprotectionplus réalisable chez les patients.
Les changements liés à l'IRA induits par le cisplatine dans les taux de lipides sont nombreux et divers, comprenant d'importants lipides structuraux au niveau complet.rénalstructure : le cortex et la moelle. L'atténuation d'un grand nombre de ces changements par la cilastatine montre son grand potentiel d'améliorationfonction rénaleet réduire les changements structurels liés aux lipides, en corrélation avec une normalisationrénalmorphologie. Encore une fois, la cilastatine s'est avérée utile pour discerner les dommages cellulaires directs non protégés causés par le cisplatine et les changements secondaires liés aux dommages primaires, qui peuvent être altérés dans les tubules proximaux par le blocage par la cilastatine de la voie apoptotique médiée par Fas.
Matériaux et méthodes
RéactifsLa cilastatine (aimablement fournie par Merck Sharp et Dohme SA, Madrid, Espagne) et le cisplatine (Pharmacia Nostrum (Madrid, Espagne) ont été utilisés. Une solution de {{0}}.9 % de NaCl (Braun Medical SA, Barcelone, Espagne) a été utilisé pour la préparation de solutions médicamenteuses destinées à l'administration. ß-1,10-N-dodécanoyl-D-érythro-sphingosine [HexCer 30 :1 (d18:1/12 :0)], N-dodécanoyl D -érythro sphinganylphosphorylcholine [dhSM 3{{50}} :0 (d18:0/12:0)], 1,2-dimyristoleoyl-sn glycéro-3- phosphocholine [PC 28:2 (14:1/14:1)], 1-heptadécanoyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3- phosphocholine [LPC (17:0)], et 1, 2- dipalmitoleoil-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine [PE 32:2 (16:1/16:1)] ont été achetés chez Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA). D-érythro-sphingosine [Cer 42 :1-d7 (d18:1/24:0)], N-stéaroyl D-érythro-dihydrosphingosine [dhCer (36 :0-d3)] , et C16-30-sulfogalactosylcéramide [Sulf 34:1(d18:1/16:0)] ont été acquis auprès de Matreya LLC (State College, PA, USA). Le cholestérol-d7 (FC-d7) et le palmitate de cholestérol-d7 [CE (16 :0-d7)] provenaient de Sigma-Aldrich.
Des solvants et des réactifs de qualité HPLC ou LC-MS ont été exclusivement utilisés, notamment du méthanol (MeOH), de l'acétonitrile (ACN) et de l'isopropanol (iPrOH) (VWR International Eurolab, Barcelone, Espagne), ainsi que du chloroforme, du dichlorométhane et de l'ammonium pour le maté (NH4COOH) (Sigma-Aldrich, Merck Life Science SL, Madrid, Espagne). L'eau ultra pure a été obtenue à partir d'un système de purification Milli-Q (Millipore, Merck Life Science SL, Madrid, Espagne).
Modèle animalDes rats Wistar mâles adultes (WKY, Criffa, Barcelone, Espagne) ont été élevés à l'Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón (IiSGM, Madrid, Espagne). Ceux-ci ont été conservés dans des conditions de température, de lumière et d'humidité contrôlées avec un accès libre à la nourriture et à l'eau. Les traitements ont été administrés par voie intrapéritonéale comme décrit précédemment [4,11] à quatre groupes de rats (n=6 animaux par groupe) : Groupe 1 : Contrôle (CNT)—0.9 % de NaCl a été injecté dans le les rats de la même manière que les traitements des groupes 3 et 4 ; Groupe 2 : cilastatine (CIL) - injectée (150 mg kg 1 de poids corporel (pc) par jour ); Groupe 3 : Cisplatine (CISPL) injecté (une dose unique de 5 mg kg 1 pc au jour 0) ; et Groupe 4 : cisplatine plus cilastatine (CISCIL) - injecté 5 mg kg 1 pc au jour 0 et cilastatine injectée (150 mg kg 1 pc par jour). Les animaux ont été sacrifiés cinq jours après le début du traitement. Auparavant, l'urine de 24 h a été recueillie dans des cages métaboliques de chaque rat. Le sérum sanguin a également été isolé par centrifugation. Les reins ont été prélevés après perfusion avec une solution saline à 0,9 % à 4 °C, suivie d'une décapsulation. Le cortex et la moelle de la gaucheun reinet la moitié en coupe transversale de la droiteun reinont été excisés, congelés instantanément dans du N2 liquide et enfin stockés à t 80 ◦C. L'autre moitié de la droiteun reina été fifixé dans du paraformaldéhyde à 4 % et inclus dans de la paraffifine pour des études histologiques.
Études histologiquesLa coloration à l'hématoxiline/éosine (Sigma-Aldrich, Steinhem, Allemagne) a été réalisée sur un rat sagittal de 5 µmun reinsections. Un microscope inversé IX70 (Olympus, Hambourg, Allemagne) a été utilisé pour prendre des microphotographies à des grossissements de 20x et 60x, pour un examen histologique.
Indicateurs de la fonction rénaleUn AutoAnalyzer Cobas 711 (Roche, Bâle, Suisse) a été utilisé pour la détermination du BUN, de la créatinine, du sodium et du potassium dans les échantillons de sérum. Le taux de clairance de la créatinine a été utilisé pour le calcul du DFG. La protéine totale a été déterminée dans l'urine en utilisant la méthode de l'acide sulfosalicylique [47].
Homogénéisation des tissus Un reindes tissus cortex et médullaire (environ 50 mg chacun) ont été ajoutés à des tubes en plastique à bouchon vissé de 1,5 mL contenant 800 µL de solution tampon de lyse : Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 125 mM, NaF 5 mM, Na4O7P2 1,4 mM, Na3VO4 1 mM, et un inhibiteur de protéase (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) et des billes de zirconium de 1,5 mm. Les tissus ont été désagrégés sur un homogénéisateur BeadBug-6 (Benchmark D1036-E, Bechmark Scientifific, Sayreville, NY, USA) à 4500 tr/min, en trois cycles de 90 s. L'homogénat a ensuite été soniqué pendant 40 s à 10 % d'amplitude et centrifugé à 600 × g pendant 1 min à 4 ◦C. Une aliquote du surnageant résultant a été diluée au 1:10 pour la détermination des protéines totales par le test de protéine à l'acide bicinchoninique (BCA) (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA). Le reste de l'extrait protéique a été stocké à t 80 ◦C jusqu'à l'analyse lipidomique.
Analyse Lipidomique par LC-MS/MSLes lipides ont été extraits des tissus (équivalent à 250 µg de protéines totales) selon la méthode de Folch [48]. Dix microlitres d'un mélange d'étalon interne (IS) ont été ajoutés avant l'extraction des lipides pour obtenir la quantification molaire relative des espèces lipidiques, comme décrit précédemment [49]. Le mélange IS était composé des éléments suivants : CE (16 :0-d7), FC-d7, Cer (42 :{{10}} d7), HexCer (30 :1), LPC (17:0), PC (28:2), PE (32:2), SM (30:1), dhSM (30:0), dhCer (35:0) et Sulf (34 :1), dans les concentrations indiquées dans le tableau S4. Les extraits lipidiques ont été séchés sous un courant d'azote et reconstitués dans 250 µL d'acétonitrile/isopropanol (1:1, vol:vol), soniqués pendant 10 min, puis transférés dans un flacon d'injection.
Cinq microlitres de l'extrait lipidique ont été injectés sur un système LC Eksigent UltraLC{{0}} (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA). Les espèces ont été séparées sur une colonne Kinetex C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 µm ; Phenomenex, Macclesfifield, UK) fonctionnant à 55 ◦C. L'élution a été appliquée à l'aide d'un mélange binaire de solvant A (60 % d'acétonitrile dans l'eau, 10 mM NH4COOH) et de solvant B (90 % d'alcool isopropylique dans l'acétonitrile, 10 mM NH4COOH) et un gradient linéaire de 60 % A à 100 % B dans 12 min et 100 pour cent B à 60 pour cent A en 8 min, à un débit de 0,4 mL min悆 1 . Un instrument QTrap 4000 (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA) a été utilisé pour la détection des lipides, avec le logiciel Analyst 1.6.2. L'azote a été utilisé à la fois comme gaz de séchage (T : 500 ◦C, pression : 30 psi) et comme gaz de nébulisation (50 psi). La détection a été réglée en mode électrospray (ESI) positif pour toutes les classes de lipides à l'exception de Sulf, qui a été analysé en mode ESI négatif. CE et FC ont été analysés à l'aide de la source d'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) en mode ions positifs. Une approche ciblée a été utilisée pour la détection des lipides en définissant des transitions de surveillance de réaction multiple (MRM) pour chaque espèce de lipide à leurs temps de rétention (tableau S5). Les chromatogrammes de pointe LC-MS/MS ont été traités à l'aide du logiciel Skyline version 4.1 (MacCoss Lab, Seattle, WA, USA) [50]. Les espèces lipidiques ont été quantifiées par comparaison directe de la surface de chaque espèce avec la surface de l'IS pour leur classe lipidique, comme décrit précédemment [49]. Les résultats ont été exprimés en nmol/mg de protéine. Les niveaux de classe de lipides totaux ont été déterminés comme la somme des espèces de classe de lipides individuelles quantifiées. Les espèces lipidiques ont été désignées selon la notation recommandée [51].
Analyses statistiquesLes valeurs ont été exprimées en moyenne ± écart-type. SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL, USA) a été utilisé pour les statistiques descriptives et l'évaluation des différences statistiques dans les variables entre les groupes par analyse de variance. Pour la comparaison des variables lipidiques entre deux groupes non appariés, des tests paramétriques (t de Student bilatéral non apparié) ou non paramétriques (Mann-Whitney) ont été effectués après le test de normalité (Shapiro-Wilk). La méthode Benjamini-Hochberg a été utilisée pour la correction du taux de fausses découvertes (FDR) des valeurs p lors de la comparaison de plusieurs espèces individuelles de lipides. Une valeur de p bilatérale <0.05 et="" un="" fdr="">< 0,1 ont="" été="" pris="" en="" compte="" pour="" l'identification="" des="" différences="" statistiquement="" significatives="" afin="" d'éviter="" de="" manquer="" des="" candidats="" biomarqueurs="" potentiels.="" le="" changement="" de="" pli="" du="" groupe="" x="" par="" rapport="" au="" groupe="" y="" a="" été="" calculé="" comme="" le="" rapport="" des="" valeurs="" moyennes="" pour="" les="" variables="" des="" groupes="" respectifs="">
L'analyse de données multivariées (MVDA) a été réalisée à l'aide de SIMCA version 14.1 (MKS Umetrics, Uppsala, Suède) et MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca (consulté le 30 2 septembre {{20}}21)) [52], y compris PCA non supervisée et OPLSDA supervisée. Les valeurs manquantes ont été remplacées à l'aide de la méthode des k plus proches voisins. Les variables ont été transformées en log et à l'échelle de Pareto avant la MVDA. Les modèles ont été évalués en fonction de leurs valeurs R2 et Q2. OPLS-DA a été validé par test de permutation (100 cycles). Les scores VIP et les S-plots des modèles OPLS-DA ont été utilisés pour identifier les variables pertinentes dans la discrimination de groupe CISPL contre CNT, CISCIL contre CNT et CISCIL contre CISPL. Conformité simultanée avec VIP > 1, chargements mis à l'échelle en tant que coefficient de corrélation |p(corr)| > 0,5, et la valeur p bilatérale < 0,05="" et="" le="" fdr="">< 0,1="" pour="" la="" comparaison="" à="" deux="" groupes="" étaient="" les="" critères="" employés="" pour="" la="" sélection="" potentielle="" de="" biomarqueurs.="" les="" valeurs="" auc="" ont="" été="" obtenues="" à="" partir="" des="" tracés="" de="" la="" courbe="">
BrevetsLes brevets suivants sont partiellement liés aux travaux présentés dans ce manuscrit : "Utilisation de la cilastatine pour réduire la néphrotoxicité de divers composés" (numéros de brevet EP2,143,429 B1 ; US 9,216,185 B2 ; US 9,522,128 B2 ; et US9,757,349 B2). Ceux-ci sont attribués à la Fundación para la Investigación Biomédica Hospital Gregorio Marañón (FIBHGM) et sous licence de la FIBHGM à Telara Pharma SL Telara Pharma SL a actuellement conclu un accord de licence avec Arch Biopartners.