L'ARN long non codant KCNQ1OT1 régule la protéine kinase CK2 via MiR -760 dans la sénescence et la restriction calorique Ⅱ

3. Débat

Epigenetic regulation mechanisms, including microRNAs (miRNAs), nucleosome remodeling, DNA methylation, and histone modification, can change heritable phenotypes without changing the DNA sequence (26). There are two main classes of non-coding RNAs(ncRNAs): the larger long ncRNAs (IncRNAs; >200 nucléotides), et les miR.NA plus petits (21-25 nucléotides) [1-3]. KCNO10T1 a été initialement identifié comme un lncRNA, qui réduit au silence plusieurs gènes dans le locus kcng1 via l'établissement d'une structure d'ordre supérieur de la chromatine (4 61. Récemment, d'autresfonctions biologiques de KCNO1OT1ont été signalés, y compris ceux associés àfibrose,Ischémie cérébrale,athérosclérose accident vasculaire cérébral, oncogenèse, différenciation ostéogénique, cicatrisation des fractures, ethypertrophie cardiaque(7-13). Cependant, les mécanismes détaillés par lesquels KCNO10T1 régule la sénescence cellulaire et la CR sont encore inconnus. Par conséquent, nous avons tenté de clarifier si KCNO10T1 était impliqué dans la sénescence et la CR. Cette étude montre que l'inactivation de KCNO10T1 induit plusieurs marqueurs de sénescence cellulaire, notamment l'induction de l'activité SA--gal, l'activation de la voie p53-21Cip1/WAF1, l'augmentation de la triméthylation H3K9 nécessaire à la formation de SAHF et le facteur SASP (L{{ 13}}, IL-6 et MMP3), dans les cellules cancéreuses humaines HCT116 et MCF-7 (figures 1 et 2A). Étant donné que le stress oxydatif est une cause importante de sénescence (14,15, l'effet de KCNO10T1 sur la génération de ROS a été étudié. Comme prévu, KCNO1OTknockdown a augmenté les ROS intracellulaires dans les cellules HCT116 et MCF-7 (Figure 2B). De plus, le niveau de KCNO10T1 L'ARNm a été réduit dans les cellules sénescentes induites par le LPS et l'expression ectopique de KCNQ10T1 a supprimé l'expression du facteur SASP médiée par le LPS dans ces cellules cancéreuses (Figure 3A, B). {39}} cellules, et l'expression de KCNO10T1 a diminué pendant la sénescence réplicative dans les cellules IMR -90 (Figure 6). Collectivement, ces résultats indiquent que KCNO10T1 agit comme unréactif anti-âgeetantioxydantdans les cellules cancéreuses humaines accrochées aux fibroblastes.

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Il a été précédemment montré que l'inactivation de Ck2 induit des marqueurs de sénescence tels que la coloration SA-gal [16], l'activation de la voie p53-p21Cip1/WAF1 (génération 171ROS [formation de 18SAHF (19l et expression du facteur SASP 20). Par conséquent, la relation entre KCNO10T1 et CK2 a été examinée Cette étude montre que la surexpression de CK2x a abrogé ces marqueurs de sénescence causés par le knockdown de KCNO10T1 (Figures 1, 2 et 6B) De plus, le knockdown de KCNO10T1 a diminué les niveaux de protéines et d'ARNm de CK2x (Figures 1B, 2A et 4B ), et la surexpression de KCNO10T1 (36, 181-37, 140) a stimulé le niveau d'ARNm de CK2x (figure 4A), indiquant que KCNQ1OT1 fonctionne comme un régulateur positif de CK2a dans les cellules. Des études récentes ont révélé que les lncARN peuvent éponger les miARN inhibant le expression de l'ARNm cible (1-3). Étant donné que des études antérieures ont montré que miR-760 interagit avec CK2a (21,22] et KCNO10T1 [27], un réseau de signalisation de KCNO10T1, CK2x et miR{{ Cette étude montre qu'un traitement supplémentaire avec un miR-760 imite la régulation à la hausse de la CK2x induite par KCNQ10T1-, et qu'un traitement supplémentaire avec un inhibiteur de miR-760 supprime la CK2 induite par le knockdown de KCNO10T1 régulation à la baisse (Figure 4). De manière constante, le traitement au LPS, qui a diminué l'expression de KCNO10T1, a augmenté le niveau de miR -760 (Figure 3C). Par conséquent, ces études suggèrent que la quantité d'ARN de KCNQ1OT1 peut titrer miR-760 et ainsi réguler la disponibilité de miR-760 pour la liaison à l'ARNm de CK2x. KCNO1OT1 et CK2a peuvent dialoguer grâce à la capacité de leur transcription à concourir pour la liaison miR-760.

Parce que CR fournit uneffet anti-âge(23], comment CR régule KCNQ1OT1 et miR -760 a été examiné. Cette étude montre que la condition CR a augmenté l'expression de KCNO10T1 et CK2x et a diminué le niveau de miR -760 (Figure 5A,B). , le traitement avec un miR-760 imite la régulation à la hausse de la CK2x induite par la CR (Figure 5C). } induction (Figure 5D). Enfin, la condition CR a sauvé la diminution de l'expression de KCNO1OT1 et CK2a, médiée par la sénescence réplicative (Figure 6C). Au total, ces résultats ont révélé que la condition CR réduisait miR -760 via une régulation positive de KCNO10T1, entraînant une régulation positive de CK2x dans les cellules humaines Bien que l'ARNlnc SNHG6 agisse comme une éponge de miR -760 dans les cellules CRC [25], la CR n'a pas modifié l'expression de SNHG6 dans des conditions expérimentales (données non présentées). D'autres groupes ont précédemment démontré que les facteurs de transcription NFY et -caténine régulent KCNO10T1 (28,29). Cependant, CR ne pouvait pas réguler l'expression de NF-Y et B-caténine moins dans des conditions expérimentales (données non présentées). Ainsi, des études supplémentaires sont nécessaires pour identifier un régulateur en amont spécifique de KCNO10T1 dans des conditions CR.

En conclusion, sur la base des résultats de cette étude, un modèle du rôle de KCNQ1OT1 dans la sénescence et la RC a été proposé. KCNQ1OT1 régule à la hausse CK2 en épongeant miR-760. La voie KCNQ1OT1–miR-760–CK2 est impliquée dans la sénescence et la CR. Le traitement au LPS et la division cellulaire dans les fibroblastes induisent la sénescence en régulant à la baisse KCNQ1OT1. La CR supprime la sénescence en activant la voie KCNQ1OT1–miR-760–CK2 (Figure 6D). Par conséquent, cette étude suggère KCNQ1OT1 comme une nouvelle cible thérapeutique dans le vieillissement et les maladies liées à l'âge, ainsi qu'un traitement alternatif qui imite les effets de la RC.

4. Matériels et méthodes

4.1. Matériaux

4.2. Culture cellulaire et CR

Des cellules IMR -90 de fibroblastes diploïdes humains ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) à un niveau de doublement de la population (PDL) de 24. Cellules MCF -7 du cancer du sein humain, Les cellules HCT116 du cancer du côlon (ATCC) et les cellules IMR-90 ont été cultivées dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco contenant 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal et 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine, dans une atmosphère humidifiée de 95 % (v/v) d'air et 5 % (v/v) de CO2 à 37 ◦C. Le PDL des cellules IMR-90 a été calculé à l'aide de la formule PD=log(Nf/Ni)/log2, où Nf est le nombre final de cellules et Ni est le nombre initial de cellules ensemencées. Pour la famine cellulaire (restriction calorique), les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate ont été lavées deux fois et cultivées dans une solution saline équilibrée d'Earle (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), avec du glucose 5, 5 mM, sans acides aminés, pendant sept heures.

4.3. Extraction d'ARN et PCR quantitative en temps réel de miARN

4.4. Transfection d'ADN et interférence d'ARN

4.5. SA- -gal Test d'activité

Les cellules des cultures sous-confluentes ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée, fixées avec du formaldéhyde à 3 % (v/v) dans du PBS pendant 1 0 min à température ambiante, puis incubées avec une coloration solution contenant 1 mg/mL de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl -D galactoside, 40 mM d'acide citrique-phosphate de sodium (pH 6,0), 5 mM de ferricyanure de potassium, 5 mM de ferrocyanure de potassium, NaCl 150 mM et MgCl2 2 mM pendant 24 h à 37 ◦C. Les cellules colorées en bleu ont été comptées dans au moins dix champs à un grossissement de 400 × et exprimées en pourcentage de cellules positives.

4.6. Mesure des niveaux de ROS intracellulaires

La sonde fluorescente sensible à l'oxydation CM-H2DCFDA a été utilisée pour évaluer les niveaux de ROS. Les cellules ont été traitées avec 5 µM CM-H2DCFDA pendant 20 min à 37 ◦C dans l'obscurité,détaché par trypsinisation, puis lavé au PBS. L'intensité de la fluorescence a été dissuaderextrait à l'aide d'un trieur de cellules Coulter Elite ESP (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA). Leles portes de diffusion vers l'avant et latérales ont été définies pour exclure toutes les cellules mortes de l'analyse ; au moins10 000 événements au sein de la porte ont été acquis par échantillon.

4.7. Transcription inverse (RT)-PCR

4.8. Immunoblot

4.9. Analyses statistiques

L'analyse unidirectionnelle des tests de variance des données a été réalisée à l'aide du programme de progiciel SPSS (IBM, Armonk, NY, États-Unis). Les résultats étaient considérés comme significatifs si la valeur de p était<0.05. Duncan's multiple range test was conducted if the differences between the groups were identified as α = 0.05. 

Documents supplémentaires : les informations complémentaires suivantes peuvent être téléchargées à l'adresse :

Contributions des auteurs : Y.-SB a conçu et conçu les expériences, YL a réalisé les expériences et Y.-SB a rédigé l'article. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement : cette recherche a été soutenue par le programme de recherche scientifique fondamentale, par l'intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le ministère des Sciences, des TIC et de la planification future (NRF-2019R1A2C1005219).

Déclaration du comité d'examen institutionnel : sans objet.

Déclaration de consentement éclairé : non applicable.

Déclaration de disponibilité des données : Sans objet.

Conflits d'intérêts : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Les références

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