Le profilage immunitaire longitudinal révèle des épitopes dominants médiateurs de l'immunité humorale à long terme chez les personnes en convalescence liées au COVID-19

Arrière-plan: Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est un coronavirus hautement pathogène et contagieux qui a provoqué une pandémie mondiale avec 5,2 millions de morts à ce jour. Les questions concernant les caractéristiques sérologiques de l'immunité à long terme, en particulier les épitopes dominants médiateurs de réponses anticorps durables après une infection par le SRAS-CoV-2, restent à élucider.

Objectif: Nous avions pour objectif de disséquer la cinétique et la longévité des réponses immunitaires chez les patients atteints de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), ainsi que les épitopes responsables d'une immunité humorale soutenue à long terme contre le SRAS-CoV-2.

Méthodes : Nous avons évalué la dynamique immunitaire du SRAS-CoV-2 jusqu'à 180 à 220 jours après le début de la maladie chez 31 individus qui présentaient principalement des symptômes modérés de COVID-19, puis avons effectué un profilage à l'échelle du protéome des épitopes dominants responsables du réponses immunitaires humorales persistantes.

Résultats: L'analyse longitudinale a révélé des anticorps soutenus spécifiques à la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 et des anticorps neutralisants chez les patients COVID-19, ainsi que l'activation de la production de cytokines aux premiers stades après l'infection par le SRAS-CoV-2. Il a été démontré que les épitopes hautement réactifs capables de médier les réponses anticorps à long terme étaient situés au niveau des protéines Spike et ORF1ab. Les épitopes clés de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 ont été cartographiés sur le domaine N-terminal de la sous-unité S1 et de la sous-unité S2, avec divers degrés d'homologie de séquence parmi les coronavirus humains endémiques et une identité de séquence élevée entre les premiers stades du SRAS-CoV. CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) et variantes en circulation actuelles.

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Conclusion: L'infection par le SRAS-CoV-2 induit une immunité humorale persistante chez les personnes convalescentes au COVID-19 en ciblant les épitopes dominants situés au niveau du pic et les protéines ORF1ab qui médient les réponses immunitaires à long terme. Nos résultats ouvrent la voie à la conception rationnelle de vaccins et au développement de diagnostics. (J Allergy Clin Immunol 2022 ; 149 : 1225-41.)

Mots clés:

SRAS-CoV-2, COVID-19, réponse immunitaire à long terme, immunité humorale, micropuce peptidique à l'échelle du protéome, épitope dominant

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV- 2), l'agent pathogène responsable de la pandémie actuelle de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), appartient au genre Betacoronavirus, qui comprend 2 autres humains hautement pathogènes connus. coronavirus : les coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) et du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS).1 Depuis l'apparition du premier cas enregistré fin décembre 2019, l'infection par le SRAS-CoV-2 a entraîné plus de 263 millions de cas. cas confirmés et 5,2 millions de décès dans le monde en novembre 2021, affectant 220 pays et régions sur les 5 continents.2 Après l'infection, les présentations cliniques varient considérablement, incluant des infections asymptomatiques, des symptômes légers ou modérés, voire une pneumonie grave potentiellement mortelle.3 Malgré les En raison de la disponibilité de plusieurs types d’approches vaccinales, de nombreux pays ont encore du mal à contenir de nouvelles vagues d’infections, avec l’émergence de variantes virales qui semblent présenter une transmissibilité et une résistance accrues aux réponses immunitaires antivirales. Une réponse immunitaire humorale efficace médiée par des anticorps neutralisants devrait posséder une immunité adaptative puissante et indispensable pour bloquer l’infection et éliminer les agents pathogènes viraux. Après l'infection par le SRAS-CoV-2, un taux élevé (supérieur à 90 %) de séroconversion robuste parmi les individus infectés a été observé 7 à 14 jours après le début de la maladie.4-6 La production d'IgA, d'IgG, spécifiques de l'antigène, et les IgM reconnaissant la protéine de pointe (S) et la protéine de nucléocapside (N) du SRAS-CoV-2 étaient détectables pendant la phase aiguë de la maladie et au début de la convalescence.4,5,7 L'ampleur des anticorps neutralisants semblait être associée à l’âge, à l’infection symptomatique et à la gravité de la maladie. Les patients âgés et les individus présentant des symptômes graves du COVID-19 ont tendance à développer des niveaux plus élevés d'anticorps neutralisants.4,8-10 Plusieurs études concernant la longévité des réponses en anticorps ont révélé que malgré une perte de réactivité sérique/plasmatique au virus antigènes et une diminution des titres d'anticorps neutralisants au fil du temps dans certains cas symptomatiques de COVID-19, un niveau soutenu d'immunité humorale globale à long terme a été observé jusqu'à 8 à 12 mois après l'infection chez les personnes convalescentes au COVID-19 .10-13 De plus, le nombre de cellules B mémoire spécifiques de l'antigène SRAS-CoV-2 est resté stable pendant au moins 6 à 12 mois12,13, parallèlement à la sélection et à l'accumulation continues de clones de cellules B exprimant anticorps neutralisants,12,14 indiquant le maintien d’une immunité humorale persistante après une infection par le SRASCoV-2.

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Les anticorps neutralisants jouent un rôle fondamental dans les défenses de l’hôte contre les infections virales. Un panel d'anticorps monoclonaux très puissants du SRAS-CoV-2 a été identifié,15-17 ciblant principalement les épitopes situés au niveau du domaine de liaison au récepteur de la protéine S qui s'assemble en trimères à la surface du virion et facilite l'entrée du virus. et la fusion lors de l'engagement du récepteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2.18 D'autres régions de la protéine S, y compris le domaine N-terminal (NTD) de la sous-unité S1 et de la sous-unité S2, contiennent également des épitopes immunogènes capables d'induire des anticorps neutralisants.16 ,19,20 Outre la neutralisation, les anticorps du SRAS-CoV-2 peuvent conférer une protection in vivo via des fonctions effectrices médiées par le Fc, telles que la phagocytose dépendante des anticorps déclenchée par les cellules tueuses naturelles et la cytotoxicité dépendante des anticorps par les monocytes ou les macrophages. 21,22 En plus de lutter contre les infections virales, les anticorps générés par une infection naturelle ou par la vaccination peuvent faciliter la pathogenèse du virus, soit par une activation accrue de l'inflammation, soit par une infectivité accrue du virus via la formation de complexes immuns antigène/anticorps ou par des fonctions dépendantes du Fc,23-25 bien que l'infection virale accrue n'ait pas été observée dans le contexte du SRAS-CoV-2 in vivo. Ces rôles divergents des réponses anticorps nécessitent une caractérisation systématique des épitopes du SARSCoV-2, ainsi que des propriétés des anticorps de longue durée ciblant les épitopes neutralisants ou non neutralisants. Malgré les progrès récents sur la cinétique et la durée des réponses anticorps après une infection par le SRAS-CoV-2, l'analyse longitudinale des principaux épitopes qui soutiennent les réponses immunitaires humorales à long terme est encore limitée. Des études antérieures ont dressé le profil des épitopes de la réponse en anticorps chez les personnes infectées par le COVID-19, principalement à l'aide de tests basés sur ELISA26,27, d'approches basées sur la présentation de phages ou de bactéries,28-31 et de technologies basées sur des puces à ADN.30,{{ 38}} Plusieurs épitopes immunodominants de la protéine S du SRAS-CoV-2 ont été identifiés ; les régions les plus fréquemment détectées ont été cartographiées à proximité ou s'étendant sur le peptide de fusion (FP) de la sous-unité S2, la deuxième heptade se répète au sein de la sous-unité S2 et sur le domaine C-terminal de la sous-unité S1.26, 28-30, 32,33 De plus, le dépistage sérologique a également révélé des épitopes situés au niveau d'autres protéines du protéome du SRAS-CoV-2, notamment la protéine N, la protéine membranaire (M) et ORF1ab, ORF3a et ORF7a.28-30, 34,35 Bien que des études antérieures aient fourni des informations importantes sur les épitopes antigéniques, ces études se sont largement concentrées sur le profilage des épitopes des patients COVID-19 au début de la phase de convalescence. Les épitopes exacts médiateurs des réponses anticorps durables spécifiques au SRAS-CoV-2 ainsi que la dynamique de la reconnaissance des épitopes restent à élucider. Ici, pour obtenir une compréhension plus approfondie de la cinétique et de la longévité des réponses immunitaires humorales chez les patients COVID-19, en particulier les épitopes responsables d'une immunité soutenue à long terme contre le SRAS-CoV-2, nous avons mené une analyse longitudinale complète. du profilage immunitaire chez 31 patients COVID-19 jusqu'à 180 à 220 jours après l'apparition des symptômes. Sur la base de l'évaluation des anticorps liant l'antigène et neutralisants ainsi que des taux sériques de cytokines, nous avons en outre identifié un panel d'épitopes situés au niveau des protéines ORF1ab, S et N du SARSCoV-2 qui médient les réponses immunitaires humorales persistantes à l'aide d'un peptide. micropuce englobant le protéome complet du SRAS-CoV-2. Nos résultats mettent en lumière les caractéristiques de l’immunité à long terme permettant de vaincre l’infection virale et contribueront à éclairer la conception rationnelle de vaccins et le développement d’outils de diagnostic sérologique améliorés.

MÉTHODES

Participants à l’étude et prélèvement d’échantillons

Pour évaluer longitudinalement la cinétique des réponses immunitaires dirigées par le SRAS-CoV-2, 101 échantillons de sérum ont été collectés auprès de 31 personnes infectées par le SRAS-CoV-2 qui ont été admises au troisième hôpital de Nantong affilié à l'université de Nantong (Nantong , Chine) entre janvier et mars 2020. Tous les patients ont reçu un diagnostic d'infection confirmée par le SRAS-CoV-2 grâce à un test PCR quantitatif de transcription inverse ; la gravité de la maladie a été définie comme un COVID léger à modéré (non grave) ou grave-19 selon la version 7 du protocole de diagnostic et de traitement de la pneumonie à nouveau coronavirus publié par la Commission nationale de la santé de la République populaire de Chine.36 Les patients ont été suivis. longitudinalement pendant 4 à 8 mois après la guérison d'une infection aiguë. Des échantillons de sang ont été prélevés de manière longitudinale de 4 à 219 jours après l'apparition des symptômes chez 20 patients parmi 31 participants à l'étude (médiane de 4,5 échantillons par individu, allant de 2 à 8), tandis qu'un échantillonnage en un seul point temporel a été effectué pour chacun des 11 autres personnes qui étaient dans une phase de convalescence tardive (jours 122 à 214 après le début de la maladie). En conséquence, les sérums (n 5 20) provenant de donneurs sains de même âge et sexe ont également été inclus en tant que groupe témoin. Aucun participant à l’étude n’avait eu d’infection antérieure documentée par le SRAS ou le MERS.

L'étude a été approuvée par le comité d'éthique du Nantong Third Hospital affilié à l'Université de Nantong (approbation EL2020006). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de chacun des participants à l'étude. Le sérum a été séparé du sang périphérique dans des tubes de gel de sérum par centrifugation, formé en aliquotes et conservé à 2808 °C avant utilisation.

Lignées cellulaires

Les cellules HEK293T et Huh7 ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (Gibco ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) complété par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (Gibco), 100 U/mL de pénicilline (Gibco) et 100 mg/ml de pénicilline. mL de streptomycine (Gibco) à 378°C avec 5 % de CO2.

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Détection des anticorps IgG par ELISA

Les niveaux d’anticorps IgG liant l’antigène dans les échantillons de sérum humain ont été déterminés par ELISA. Des plaques ELISA à 96 puits (Corning, Corning, NY) ont été pré-enduites avec la protéine de nucléocapside du SRAS-CoV-2 (Sino Biological, Pékin, Chine, n° de catalogue 40588-V08B , 50 ng par puits) ou protéine de pointe (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng par puits), protéine de pointe du SRAS-CoV (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng par puits) puits), ou la protéine de pointe MERS-CoV (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng par puits) pendant la nuit à 48 °C. Après blocage avec 5 % de lait écrémé dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,05 % de Tween 20 (PBS-T) pendant 2 heures à 378 C, 3- fois les échantillons de sérum inactivés par la chaleur dilués en série à une dilution initiale de 1 :200 ont été ajoutés dans des plaques prérevêtues pendant 2 heures à 378°C. Les puits ont été lavés 3 fois entre chaque étape avec du PBS-T. Les réactions ont été visualisées par incubation avec un anticorps anti-IgG humain conjugué à la peroxydase de raifort (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni, dilution 1:100, 000) pendant 1 heure à 378 °C, suivie de l'ajout d'un substrat de tétraméthylbenzidine (Life Technologies, Carlsbad). , Californie). Les réactions de développement ont été arrêtées avec 2 moles de H2SO4 et l'absorbance a été mesurée à 450 nm avec la longueur d'onde de correction fixée à 630 nm (OD450 2 OD630). Pour calculer le titre final des anticorps de liaison, les données ont été linéarisées en traçant le log10 des dilutions sériques par rapport aux valeurs de densité optique (DO) corrigées (OD450 2 OD630) dans la partie linéaire de la courbe (y 5 kx 1 b , r2 > 0,99), et la dilution sérique à laquelle la valeur de DO ajustée (OD450 2 OD630) 5 0 a été calculée pour donner un titre final. Les anticorps IgG spécifiques de l'antigène chez des souris immunisées contre un peptide ont été évalués par ELISA à base de peptide. En bref, des plaques ELISA à 96- puits (Thermo Fisher Scientific) ont été recouvertes de 1 mg par puits de 4 peptides mélangés (peptides 318, 356, 510 et 530) dans un tampon carbonate (pH 9,6) pendant une nuit à 48 °C. Après blocage avec du PBS-T contenant 5 % de lait écrémé, les puits ont été incubés avec des échantillons de sérum dilués au 1:40 pendant 1 heure à 378°C. Ensuite, les plaques ont été lavées et incubées avec un anticorps IgG anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (Abcam). Les réactions ont été visualisées avec un substrat tétraméthylbenzidine (Life Technologies) et l'absorbance à 450 nm a été mesurée après arrêt des réactions avec 2 moles de H2SO4.

Production et titrage de pseudovirus

Le gène optimisé pour les codons codant pour la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 (NC_045512) ou du SRAS-CoV (AY291315.1) avec délétion C-terminale 19 aa, ou MERS-CoV (JX{{10 }}) la protéine de pointe tronquée avec le C-terminal 16 aa a été clonée dans le vecteur pcDNA3.1(1), respectivement. Les cellules HEK 293T cultivées dans une boîte de culture tissulaire de 100 mm ont été cotransfectées avec 1 mg d'un plasmide codant pour une protéine de pointe et 15 mg d'un squelette exprimant la luciférase déficient en env (pNL4-3.luc.RE) en utilisant de la polyéthylèneimine (Polysciences , Warrington, Pennsylvanie). Les surnageants de culture cellulaire contenant des pseudovirus ont été collectés 48 heures après la transfection, filtrés et conservés à 2808 °C en aliquotes. Pour la détermination des titres de virus (dose infectieuse de 50 % en culture tissulaire), des dilutions en série de pseudovirus ont été ajoutées à des cellules Huh7 1 3 104 pré-ensemencées dans des plaques à puits 96-. Après 12 heures d'infection, le milieu contenant le virus a été remplacé par un milieu de croissance frais et les cellules ont été cultivées pendant 48 heures supplémentaires. L'activité luciférase de la lyse cellulaire a été mesurée avec le système de dosage Steady-Glo Luciferase (Promega, Madison, Wisc) à l'aide d'un lecteur de microplaques (BioTek Instruments, Winooski, Vt), et les puits produisant des unités de luminescence relative supérieures à 10 fois la valeur de fond moyenne ont été pris en compte. positif.

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Des échantillons de sérum inactivés par la chaleur provenant de patients COVID-19 ou de donneurs sains ont été 2- fois dilués en série et incubés avec 200 pseudovirus à une dose infectieuse de 50 % en culture tissulaire pendant 1 heure à 378 °C. Les mélanges ont ensuite été appliqués pour infecter les cellules Huh7 pré-ensemencées dans des plaques à puits 96- en double. Les puits ont été remplis avec du milieu de croissance frais 12 heures après l'infection et l'activité luciférase des cellules a été déterminée 48 heures plus tard. Les titres de neutralisation à 50 % (NT50) contre les pseudovirus SARS-CoV-2 et SARS-CoV ont été calculés par régression non linéaire à l'aide du logiciel GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, La Jolla, Californie) ; et le NT50 du pseudovirus MERS-CoV a été défini comme la dilution de sérum la plus élevée entraînant une réduction de 50 % des unités de luminescence relative par rapport au contrôle viral sans application d’échantillons de sérum.

Détection de cytokines basée sur des puces à protéines

La mesure quantitative de plusieurs cytokines (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 , IL-13, MCP-1, IFN-g et TNF-a) dans des échantillons de sérum ont été réalisés à l'aide d'une matrice ELISA multiplex (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) conformément au protocole du fabricant. En bref, des lames de verre préalablement recouvertes d'anticorps spécifiques aux cytokines ont été bloquées avec un diluant d'échantillon à température ambiante pendant 30 minutes, suivies de l'ajout de 60 ml d'échantillons de sérum dilués au facteur 2- ou de dilutions standard de cytokines. Après une nuit d'incubation à 48 °C, les lames ont été lavées 5 fois et colorées avec 80 ml de cocktail d'anticorps de détection biotinylé, puis de streptavidine conjuguée au colorant équivalent Cy3 à température ambiante pendant 1 heure. L'intensité de la fluorescence a été détectée par le scanner de puces à ADN InnoScan 300 (Innopsys, Chicago, Illinois) à 532 nm et les données ont été analysées par le logiciel Q-Analyzer (RayBiotech).

Synthèse peptidique et conjugaison avec de l'albumine sérique bovine

Un total de 515 peptides (15 aa de longueur, se chevauchant de 11 aa) qui couvrent le protéome du SRAS-CoV-2 ont été synthétisés par GL Biochem (Shanghai, Chine) sur la base de la séquence d'acides aminés du SRAS-CoV. -2 souche Wuhan-Hu-1. Les peptides ont été conjugués avec de l'albumine sérique bovine (BSA) en utilisant l'agent de réticulation Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) conformément aux instructions du fabricant. En bref, du Sulfo-SMCC a été ajouté à un excès molaire de 30- fois à la BSA, suivi d'une dialyse au PBS. Ensuite, le peptide contenant la cystéine a été ajouté dans un rapport de 1:1 (poids/poids), incubé pendant 2 heures, puis dialysé avec du PBS pour éliminer les peptides libres.

Fabrication de micropuces peptidiques

Pour préparer la puce à peptides, les peptides du SRAS-CoV-2, ainsi que le contrôle négatif (BSA) et les contrôles positifs (anticorps anti-IgG humaines et anti-IgM humaines ; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) , ont été immobilisés sur des lames de substrat PATH (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) en triple exemplaire à l'aide d'une imprimante Super Marathon (Arrayjet, Édimbourg, Écosse, Royaume-Uni). Ensuite, les micropuces peptidiques ont été conservées à 2808 °C pour une utilisation ultérieure.

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Cartographie d'épitopes basée sur des puces à ADN

Une analyse sérique basée sur une puce à ADN a été réalisée selon Li et al,37 avec des modifications mineures. Afin de créer des chambres individuelles pour les sous-réseaux identiques, un joint en caoutchouc de chambre 14- a été monté sur chaque lame de micropuce à peptides. Les réseaux de lames ont été réchauffés à température ambiante avant utilisation, puis bloqués avec 3 % de BSA dans du PBS-T pendant 3 heures. Les échantillons de sérum de patients COVID-19 ou les sérums regroupés de 20 donneurs sains (groupe témoin) ont été dilués au 1:200 dans du PBS-T pour la plupart des échantillons, puis incubés avec chaque sous-réseau pendant 2 heures à 48C. Les matrices ont été lavées avec du PBS-T et incubées avec des IgG anti-humaines de chèvre conjuguées au Cy3- et des IgM anti-humaines d'âne conjuguées à Alexa Fluor 647 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvanie) à une dilution de 1 : 1000. chacun pendant 1 heure à température ambiante. Après incubation, les matrices ont été lavées avec du PBS-T puis complètement séchées par centrifugation à température ambiante. Par la suite, les matrices ont été numérisées à l'aide d'un scanner de puces à ADN LuxScan 10K-A (CapitalBio, Pékin, Chine) et les données d'intensité de fluorescence FL ont été obtenues et analysées par le logiciel GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, Californie).

FIG 1. Dynamique longitudinale des réponses en anticorps chez les patients COVID-19. Un schéma de la conception de l’étude. Au total, 31 personnes infectées par le SRAS-CoV-2 et 20 donneurs sains ont été inscrits à l'étude. La collecte d'échantillons de sérum a été réalisée longitudinalement à plusieurs moments dans le temps pour 20 patients parmi 31 personnes infectées par le SRAS-CoV-2, tandis qu'un échantillonnage à un moment unique a été effectué pour les 11 autres patients. Le nombre de participants et les échantillons de sérum utilisés dans divers tests sont répertoriés. B et C, un total de 101 échantillons de sérum provenant de 31 patients COVID-19 ont été testés par ELISA pour détecter les anticorps IgG liant les protéines N (B) et S (C) du SRAS-CoV-2 à différents moments après l'apparition des symptômes (jours 1-30, n 5 37 ; jours 31-61, n 5 18 ; jours 100-150, n 5 21 ; jours {{21 }}, n5 25). Des échantillons de sérum provenant de 20 donneurs sains ont été inclus comme groupe témoin. D, NT50 contre les pseudovirus du SRAS-CoV-2 au fil du temps a été calculé par régression non linéaire. E, La distribution de l'activité neutralisante du sérum chez les patients COVID-19 aux moments indiqués après le début de la maladie est présentée. Les échantillons avec un titre NT50 inférieur à 20 ont été définis comme non neutralisants.

Analyse des données de puces à peptides

Les données IgG et IgM ont été analysées respectivement. L'intensité du signal de chaque point a été définie comme étant le premier plan moins l'arrière-plan et la moyenne des points triples pour chaque peptide. La valeur seuil de la réponse peptidique positive des échantillons COVID-19 a été fixée à deux fois l'intensité du signal du contrôle donneur sain. Les peptides présentant des taux positifs supérieurs à 80 % parmi les échantillons testés aux trois moments d'échantillonnage (jours 10-60, 100-150 et 180-220 après le début de la maladie) ont été définis comme des peptides dominants et persistants et des peptides avec une fréquence de réponse positive supérieure à 60 % à tous les 3- moments a été considérée comme sous-dominante et persistante. L'intensité moyenne du signal de chaque peptide dans 3 groupes de points de temps d'échantillonnage a été calculée ; des peptides présentant une intensité de signal élevée (au-dessus de la moyenne de 1 écart-type des intensités de signal de tous les échantillons testés) ont également été sélectionnés. Le traitement et l'analyse des données ont été effectués par le logiciel R v3.6.3 (//www.r-project.org/), et les changements significatifs d'intensité du signal entre différents groupes de points de temps d'échantillonnage ont été évalués sur la base de Limma. Les différences avec P < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Immunisation de la souris

Des souris femelles BALB/c âgées de 6 à 8 semaines ont été achetées auprès de Beijing Vitalstar Biotechnology (Beijing, Chine). Toutes les souris ont été hébergées dans des installations spécifiques exemptes d'agents pathogènes et l'étude animale a été approuvée par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'université médicale de Tianjin (Tianjin, Chine). Pour l'immunisation, des groupes de souris (n 5 5) ont reçu une injection intramusculaire de 25 mg par dose de chaque peptide (peptides 318, 356, 510 et 530 respectivement) mélangés à 50 mg d'alun (InvivoGen, San Diego, Californie) et 10 mg d'adjuvants CpG, et renforcés deux fois avec 50 mg par dose de peptides en présence d'adjuvants à des intervalles de 2- semaines. La vaccination avec des adjuvants seuls a servi de contrôle négatif. Les sérums ont été collectés sur des souris immunisées au jour 10 ou au jour 14 après les deuxième et troisième immunisations.

Analyses statistiques et structurelles

Tous les graphiques ont été tracés par GraphPad Prism. Les comparaisons statistiques entre les groupes des figures 1, 2 et 4 ont été effectuées par 1-voie ANOVA avec comparaison multiple de Tukey. Les corrélations présentées sur les figures 1, E9 et E10 dans le référentiel en ligne disponible sur www.jacionline.org ont été déterminées par analyse de corrélation de Pearson. Les différences avec P < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Les structures de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 (Protein Data Bank [PDB ; http://www.wwpdb.org/] ID : 6VXX et PDB ID : 6ZGI) et le domaine de dimérisation du SRAS-CoV{{ 13}} protéines de nucléocapside (ID PDB : 6YUN) ont été utilisées pour disséquer les détails structurels des épitopes identifiés situés sur la protéine de pointe et le domaine de dimérisation de la protéine de nucléocapside. L'alignement des séquences et l'analyse de l'homologie entre divers coronavirus humains ont été réalisés par l'algorithme Clustal W du logiciel MEGA v10.1.6.

RÉSULTATS

L'infection par le SRAS-CoV-2 induit une liaison soutenue spécifique à l'antigène et des anticorps neutralisants

Pour évaluer longitudinalement les réponses en anticorps après une infection par le SRAS-CoV-2, 101 échantillons de sérum ont été collectés auprès de 31 personnes présentant une infection par le SRAS-CoV-2 confirmée par PCR (Fig. 1, A). Les participants à l'étude comprenaient 26 patients atteints de COVID modéré-19, 1 avec une présentation asymptomatique, 2 avec une maladie légère et 2 avec des symptômes sévères (voir le tableau E1 dans le référentiel en ligne disponible sur www.jacionline.org). Les patients inclus dans cette étude étaient âgés de 17 à 66 ans (âge médian 45 ans), avec une répartition à peu près égale d'hommes (51,6 %) et de femmes (48,4 %). Les symptômes les plus courants parmi les participants à l'étude comprenaient la fièvre (83,9 %), la toux (67,7 %), la myalgie (22,6 %) et les frissons (22,6 %), avec une durée médiane de maladie de 15 jours. Un total de 90 échantillons de sérum provenant de 20 patients COVID-19 ont été collectés pendant l'hospitalisation et la sortie après la guérison à plusieurs moments jusqu'à 219 jours après l'apparition des symptômes (Fig. 1, A et voir le tableau E2 dans le référentiel en ligne). L'échantillonnage auprès des 11 autres participants a été effectué à un moment donné au cours de la fin de la convalescence (jours 122 à 214 après l'apparition des symptômes). De plus, des échantillons provenant de 20 donneurs sains présentant une répartition par âge et par sexe correspondant ont été inclus en tant que groupe témoin (tableau E1). Les anticorps IgG spécifiques à l'antigène dans les échantillons de sérum ont été quantifiés par ELISA pré-enduit de protéine N ou de protéine S du SRAS-CoV -2. Par rapport aux donneurs sains, des anticorps IgG anti-N et anti-S ont été développés chez des patients COVID-19 dans les 30 jours suivant l'apparition des symptômes, avec un titre final moyen géométrique de 4,10 (log10 anti-N IgG) et 4,20 (log10 anti-S IgG) (Fig. 1, B et C ; et voir le tableau E3 dans le référentiel en ligne sur www.jacionline.org ; Fig E1, A et B ; et Fig E2), en accord avec les observations précédentes selon lesquelles la séroconversion survient 1 à 2 semaines après l'infection par le SRAS-CoV-2.5,38 Par la suite, les titres d'anticorps liant l'antigène ont diminué à des degrés divers au fil du temps. Une diminution rapide et spectaculaire des taux d'anticorps anti-N IgG a été observée chez les patients atteints de COVID-19, tandis que des niveaux plus élevés de titres d'anti-S IgG ont été maintenus jusqu'à 180 à 220 jours après le début de la maladie par rapport aux donneurs sains (Fig. 1, B , et C). L'analyse de corrélation a révélé une corrélation significative entre les titres log10 d'IgG anti-N et les titres d'IgG anti-S (r 5 0,50 et P < ,001 ; Fig. 1, F). En plus de quantifier les anticorps de liaison, la dynamique des anticorps neutralisants fonctionnels chez les individus atteints de COVID-19 a été déterminée en utilisant le SARS-CoV pseudotypé-2. Plus de 95 % des échantillons de sérum de patients (35/37) collectés entre 4 et 30 jours après l'apparition des symptômes présentaient de solides activités neutralisantes contre le SRAS-CoV-2, et une grande proportion d'échantillons présentaient des activités modérées (NT50 80-320 ) à une activité neutralisante forte (NT50 > 320) (Fig. 1, D et E). Il convient de noter que 2 échantillons avec des titres neutralisants faibles ou nuls (NT50 à une dilution sérique minimale de 1:20) ont été collectés tôt après l'infection virale (au jour 4 et au jour 11 après l'apparition des symptômes) avant de provoquer de puissants anticorps neutralisants (Fig. 1, D et Fig E1, C). Malgré la baisse des niveaux d'anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2 chez les patients atteints de COVID-19 au fil du temps, la plupart des échantillons de sérum de patients (24/25) obtenus pendant 180 à 220 jours après l'apparition des symptômes ont maintenu une positivité pour la neutralisation contre le SRAS- CoV-2, avec une diminution de 2,8-fois des titres moyens géométriques NT50 (Fig. 1, D et E ; Tableau E3 ; Fig E3). Comme prévu, par rapport aux anticorps anti-N IgG, une corrélation plus forte entre les titres d'IgG de liaison au SRAS-CoV-2 S et les titres d'anticorps neutralisants a été identifiée (r 5 0,61 et P < ,001 ; Fig. 1 , G et H), ce qui concorde avec les découvertes selon lesquelles la protéine S du SRAS-CoV-2 est la cible principale des anticorps neutralisants. La protéine S du SRAS-CoV-2 partage une similarité de séquence élevée avec le SRAS-CoV hautement virulent (identité de séquence de 76 %) et présente une faible homologie de séquence avec le MERS-CoV (identité de séquence de 34 %). Une réactivité sérologique croisée entre les coronavirus a été signalée ;8,10,28,29 ; cependant, les données sur l'évaluation de suivi longitudinal de la réactivité croisée des anticorps contre le SRAS-CoV-2 envers d'autres coronavirus restent limitées. Nous avons déterminé les anticorps de liaison croisée et de neutralisation croisée dans les sérums longitudinaux d'individus infectés par le SRAS-CoV-2. Les résultats ont montré que plus de 80 % des échantillons de sérum de patients se sont liés aux protéines S du SRAS-CoV et/ou du MERS-CoV dans le mois suivant l'apparition des symptômes, 27 % des échantillons présentant une double réactivité croisée (Fig. 1, I). La réactivité à la protéine S du SRAS-CoV possédait une proportion plus élevée (73 %) que celle du MERS-CoV (35 %) parmi les échantillons testés à un stade précoce (1-30 jours après le début de la maladie) (Fig. 1, I). Les anticorps à double liaison croisée et à liaison croisée contre le SRAS-CoV ont présenté un déclin progressif au fil du temps, avec seulement 8 % d'échantillons à double liaison croisée et 20 % d'échantillons à liaison croisée simple contre le SRAS-CoV 180 à 220 jours après le début de la maladie (Fig. 1). , I ; dans le référentiel en ligne disponible sur www.jacionline.org, voir Fig E4, A ; Fig E5, A ; et Fig E6 dans le référentiel en ligne de cet article sur www.jacionline.org). Curieusement, la positivité des anticorps réactifs à la protéine MERS-CoV S est restée relativement constante au fil du temps (Fig. 1, I). À la différence de la capacité de liaison croisée élevée, seul un petit nombre d'échantillons de sérum de patients ont neutralisé de manière croisée les pseudovirus du SRAS-CoV et/ou du MERS-CoV (Fig. 1, I ; Fig. E4, B ; Fig. E5, B ; et voir Fig. E7 dans le Dépôt en ligne). Environ 27 % des échantillons collectés 1 à 30 jours après l'apparition des symptômes présentaient une activité de neutralisation croisée, et ce nombre est tombé à 20 % entre 180 et 220 jours, avec des changements plus spectaculaires dans l'activité de neutralisation croisée du SRAS-CoV (Fig. 1, I). ). Une proportion plus élevée d’échantillons ont neutralisé le SARSCoV que le MERS-CoV dans les 30 jours suivant le début de la maladie. Il convient de noter que malgré des proportions similaires d’échantillons présentant une neutralisation croisée du SRAS-CoV et du MERS-CoV, les valeurs NT50 du MERS-CoV étaient bien inférieures à celles du SRAS-CoV parmi les échantillons de sérum positifs pour la neutralisation croisée (Fig. E4, B ; Fig. E5, B ; Fig. E7).

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L'infection par le SRAS-CoV-2 entraîne l'activation de la production de cytokines

Pour caractériser de manière exhaustive les changements immunologiques après une infection par le SRAS-CoV-2, nous avons en outre évalué les changements dans la dynamique des taux de cytokines dans les sérums de patients atteints de COVID-19. Cinquante-cinq échantillons de sérum longitudinaux collectés au cours des deux premiers mois suivant l’apparition des symptômes ont été utilisés pour la détection de la production de cytokines par micropuce à base de protéines. Des taux sériques accrus de plusieurs cytokines ont été observés au cours du premier mois de la maladie, notamment l'IL-1a (proinflammatoire), l'IL-6 (proin-inflammatoire) et l'IL-10 (anti-inflammatoire). ), qui ont été liés au syndrome de libération de cytokines dans les cas graves de COVID-19,39,40 ainsi qu'à l'IFN-g (type TH1) et à l'IL-4 (type TH2) (Fig. 2, A, et Fig E8 dans le référentiel en ligne disponible sur www.jacionline.org). Plus précisément, les taux sériques d'IL-6, d'IL-10 et d'IFN-g ont augmenté dans les 15 jours suivant l'apparition des symptômes chez les patients et ont diminué au cours des phases ultérieures, tandis que la libération d'IL-1 Il a été démontré que a et IL-4 augmentaient remarquablement pendant 16 à 30 jours après le début de la maladie, puis tombaient rapidement à la normale (Fig. 2, A). L'analyse de corrélation a indiqué une association linéaire faible ou inexistante entre les réponses en anticorps spécifiques de l'antigène et la production de cytokines après une infection par le SRAS-CoV-2, bien qu'une signification statistique ait été observée entre les niveaux d'IL-10 et le SRAS-CoV{{ 34}} Anticorps de liaison à la protéine N (r 5 0,321 et P < ,05), entre la production d'IL-1b et l'anticorps de liaison à la protéine S (r 5 20,335 et P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

La cartographie des épitopes à l'échelle du protéome identifie les épitopes dominants médiateurs des réponses immunitaires humorales persistantes chez les patients COVID-19

Pour mieux caractériser les caractéristiques distinctives de l'immunité humorale contre le SRAS-CoV-2 au fil du temps, nous avons appliqué une cartographie des épitopes à l'échelle du protéome à l'aide de microréseaux à base de peptides. Une bibliothèque de peptides couvrant le protéome du SRAS-CoV-2 a été générée et immobilisée sur des lames, dans lesquelles chaque peptide mesurait 15 aa de longueur avec un chevauchement de 11 aa. Un total de 51 échantillons de sérum longitudinaux provenant de 19 patients présentant des symptômes asymptomatiques (n 5 1) ou légers (n 5 2) à modérés (n 5 15) ou sévères (n 5 1 ) Les infections par le SRAS-CoV-2 ont été testées (Tableau I). Pour obtenir des nombres d'échantillonnage, des intervalles et des points temporels relativement équilibrés, des échantillons ont été collectés séquentiellement à 2 ou 3 points temporels auprès de chaque participant COVID-19, allant de 16 à 219 jours après l'apparition des symptômes. La majorité des patients (18/19) ont généré des anticorps neutralisants après une infection virale, à l'exception du seul individu présentant une infection asymptomatique (Tableau I). Selon les différents moments d'échantillonnage, les échantillons ont été divisés en 3 groupes : jours 10-60 (n 5 18), jours 100-150 (n 5 18) et jours {{28 }} (n5 15). Une évaluation longitudinale des profils d'épitopes viraux chez les patients atteints de COVID-19 a été réalisée pour les anticorps sériques IgG et IgM, avec des sérums regroupés provenant de 20 donneurs sains utilisés comme contrôle négatif. À l'aide de la micropuce protéomique du SRAS-CoV-2, la cinétique des réponses des anticorps se liant aux peptides a été déterminée et analysée pour (1) l'intensité du signal de liaison et (2) le pourcentage d'échantillons réactifs positifs (taux positif) pour chaque peptide. . Sur la base de la valeur seuil pour une réponse positive de liaison aux peptides, qui a été fixée à deux fois l'intensité du signal du contrôle négatif, nous avons identifié un total de 460 peptides positifs pour les IgG et 479 peptides positifs pour les IgM qui étaient réactifs avec au moins 1 patient. échantillon de sérum. Le nombre de peptides positifs et la distribution des réponses dans différents cadres de lecture ouverts (ORF) du SRAS-CoV-2 étaient relativement stables parmi les différents groupes d'échantillonnage, avec une tendance à une légère diminution du nombre de peptides positifs au fil du temps (Fig. 3, UN). La plus grande réactivité a été identifiée dans la polyprotéine réplicase ORF1ab, qui est le plus grand ORF, englobant plus des deux tiers du génome entier (Fig. 3, A). Il est intéressant de noter que nous avons observé des degrés de corrélation modérés à forts entre les réponses positives de liaison aux peptides et les taux sériques de cytokines tôt après l'infection par le SRAS-CoV-2 (jours 10-60 après le début de la maladie ; voir la figure E10 dans le référentiel en ligne à l'adresse www.jacionline.org). Il a été démontré que le nombre de peptides de liaison positifs pour les IgM était associé aux taux sériques d'IL-6 et d'IL-10 ; de même, l'intensité moyenne du signal des peptides réactifs totaux et celle des peptides de liaison ORF1ab pour les IgM présentaient des associations positives avec la production d'IL-6 et d'IFN-g dans les échantillons de sérum. Ces données suggèrent que les changements dans les niveaux de cytokines après une infection par le SRAS-CoV-2 peuvent influencer l'ampleur et l'étendue des épitopes reconnus par les réponses humorales spécifiques à l'antigène. Sur la base de l'identification des épitopes positifs, nous avons en outre sélectionné les épitopes les plus courants qui sont restés systématiquement réactifs dans plus de 80 % des échantillons de COVID-19 parmi chacun des 3 groupes d'échantillonnage (appelés épitopes dominants et persistants). Les résultats ont révélé que ces épitopes hautement dominants, capables de médier les réponses immunitaires humorales à long terme, étaient situés au niveau de la polyprotéine ORF1ab du SRAS-CoV-2 et de la protéine S, avec plus d'épitopes reconnus par les anticorps IgM (n 5 33) que Anticorps IgG (n 5 10) (Fig. 3, B et Tableau II ; voir Fig E11 et Fig E12 dans le référentiel en ligne sur www.jacionline.org). La polyprotéine ORF1ab possédait le nombre maximal d'épitopes dominants médiateurs de réponses à long terme, et les épitopes étaient largement distribués sur les régions des protéines non structurales (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14, et nbsp 16 (Tableau II). Notamment, nous avons identifié un épitope immunodominant, 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), qui pourrait être reconnu par les anticorps IgG et IgM de 100 % des patients COVID-19, quels que soient les moments d'échantillonnage du sérum (Fig. 3, B et tableau II ; voir les figures E13 et E14 dans le référentiel en ligne). Ce peptide hautement réactif est situé dans la région hélicase (nsp 13) de la polyprotéine ORF1ab, qui est essentielle au déroulement des modèles d'ARN double brin lors de la réplication du SRAS-CoV-2.41 Parmi les peptides sélectionnés d'ORF1ab, 2 peptides immunodominants avec les intensités de signal moyennes les plus élevées reconnues par les anticorps IgG, le numéro 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) et le numéro 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), sont tous deux situés sur la nsp 13. Pour les réponses IgM, le peptide 685 (ORF1ab, aa 249-263) sur nsp 2 et peptide 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) sur nsp 13 présentaient les intensités de liaison les plus robustes (Fig. 3, B). Compte tenu de la variation des signaux de base (sérums regroupés provenant de donneurs sains) pour différents peptides (Fig. 3, B), nous avons en outre calculé les changements d'intensité des signaux concernant chaque peptide clé, par rapport au groupe témoin sain. Les résultats ont montré que le peptide 2073 (liaison aux IgG) et le peptide 1985 (liaison aux IgM) situés dans la région nsp 13 maintenaient les intensités de liaison peptidique les plus élevées (changement de facteur) parmi les sérums de patients collectés jusqu'à 180 à 220 jours (Fig. E13 et Fig. E14).

FIG 2. Cinétique de production de cytokines chez les patients COVID-19. A, Les niveaux de production de cytokines dans 55 échantillons de sérum collectés auprès de 16 patients COVID-19 pendant la phase aiguë et un stade précoce de convalescence ont été détectés par ELISA basé sur des micropuces à protéines (jours 1-15, n 5 11 ; jours 16-30, n 5 26 ; jours 31-61, n 5 18 ; donneurs sains, n 5 20). Chaque point représente un échantillon de sérum individuel ; les lignes pointillées indiquent la limite de détection. La signification statistique a été déterminée par 1-voie ANOVA avec des comparaisons multiples de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01 et ****P < 0,0001. B, Changement de pli de chaque niveau de production de cytokines chez les patients COVID-19 indiqués en (A) par rapport aux valeurs moyennes de 20 échantillons provenant de donneurs sains. Chaque colonne indique un échantillon de sérum distinct collecté à partir des moments indiqués après l'apparition des symptômes ; chaque ligne représente 1 cytokine individuelle testée.

TABLEAU I. Caractéristiques des patients COVID-19 et des cohortes d'échantillons dans la cartographie des épitopes

FIG 3. Reconnaissance IgM et IgG des épitopes dominants qui contribuent aux réponses anticorps à long terme chez les individus infectés par le SRAS-CoV-2. Analyse longitudinale de la reconnaissance sérique des épitopes chez 19 individus atteints de COVID-19 à l'aide d'une micropuce peptidique couvrant le protéome du SRAS-CoV-2. La valeur seuil pour la réponse positive de la liaison peptidique dans les échantillons de patients (n 5 51) ​​a été fixée à deux fois l'intensité du signal des sérums regroupés provenant de 20 donneurs sains. A, nombre de peptides et distribution des peptides de liaison positifs qui étaient détectables dans 1 ou plusieurs échantillons collectés à 10-60 jours (n 5 18), 100-150 jours (n 5 18), et 180- 220 jours (n 5 15) après le début de la maladie. Les nombres indiquent le total des épitopes IgG et IgM identifiés pour chaque ORF. B, Intensités du signal des épitopes IgG et IgM dominants et persistants (axe des x) qui étaient durablement réactifs dans plus de 80 % des échantillons dans les 3 points de temps d'échantillonnage. Chaque point indique les sérums regroupés provenant de donneurs sains (en haut) ou un échantillon de sérum de patient distinct collecté à des moments indiqués après l'apparition des symptômes. E, protéine d'enveloppe.

TABLE II. Epitopes with >Taux positif de 80 % aux 3 points de temps d'échantillonnage

Les épitopes dominants et persistants de la protéine S du SRAS-CoV-2 sont situés dans les sous-unités NTD et S2

Au total, 4 épitopes dominants et persistants de la protéine S du SARSCoV-2 ont été identifiés : le peptide 318 (S, aa 45-59) et le peptide 356 (S, aa 197-211), qui sont situés dans la région MTN ; le peptide 510 (S, aa 813-827), qui couvre le site de clivage S2' et des parties du FP de la sous-unité S2, et le peptide 530 (S, aa 893-907), qui est situé au niveau de la région de connexion entre FP et la première région de répétition heptade de la sous-unité S2 (Fig. 3, B et Tableau II). Parmi ces peptides clés de la protéine S que nous avons sélectionnés, le peptide 318, situé au niveau du NTD de la protéine S, possédait l'intensité de liaison la plus robuste (changement de facteur par rapport au contrôle ; Fig E13 et Fig E14). Les analyses structurelles ont révélé que ces épitopes sont entièrement exposés à la surface de la protéine S monomère ; cependant, certains résidus d'épitopes des peptides 318, 356 et 530 sont dissimulés sous la surface de la protéine S trimérique (Fig. 4, A et B), ce qui suggère que les structures du monomère S et du trimère sont reconnues efficacement par le système immunitaire de l'hôte sous certaines conditions. circonstances. Pour être plus précis, 2 segments de boucle du peptide 318 (aa 45-46 et aa 56-59) sont exposés sur la protéine S trimérique, avec le brin b central enfoui à l'intérieur ; et la plupart des résidus du peptide 356 sont accessibles en surface, y compris un brin b central (aa 203-209) et un segment de boucle (aa 210-211). Le peptide 510 contient un site de clivage S2' et une hélice centrale de FP, tous deux entièrement présentés à la surface de la protéine S ; les résidus du peptide 530 sont pour la plupart cryptiques, avec seulement une petite fraction de la boucle (aa 893-895) exposée sur la protéine S trimérique (Fig. 4, C). L'analyse de l'homologie de séquence parmi 7 coronavirus humains courants a révélé que 2 épitopes situés au niveau de la sous-unité S2 (peptides 510 et 530) partagent une identité de séquence élevée avec d'autres coronavirus, suggérant une réactivité croisée sérologique ciblant ces épitopes parmi les coronavirus humains (Fig. 4, D). La séquence du peptide 318 présentait une grande similarité avec le SRASCoV, tandis qu'un faible niveau d'homologie de séquence pour le peptide 356 a été montré parmi les coronavirus, suggérant des réponses en anticorps spécifiques au SRAS-CoV-2 ciblant cette région (Fig. 4, D). En tenant compte des nouveaux variants émergents et circulants du SRAS-CoV-2 dans le monde, nous avons en outre effectué un alignement de séquences en ce qui concerne les épitopes clés de la protéine S entre la souche précoce du SRAS-CoV-2 (Wuhan-Hu{{52} }) et 5 variantes préoccupantes (Alpha, Beta, Gamma, Delta et Omicron), ainsi que 2 variantes intéressantes (Lambda et Mu), selon la classification des variantes virales de l'Organisation mondiale de la santé (mise à jour le 30 novembre 2021). ). Les résultats ont montré que les séquences de ces épitopes dominants et persistants sont presque identiques parmi les variants analysés, à l'exception d'une seule mutation N211I identifiée dans le nouveau variant Omicron (Fig. 4, E). Ces données indiquent que les anticorps générés par les premières souches du SRAS-CoV-2 peuvent reconnaître systématiquement les variantes en circulation actuelles et que ces épitopes dominants peuvent être capables de médier des réponses anticorps soutenues à long terme en cas d'infection par le SRAS-CoV-2 variantes. Pour déterminer plus en détail les caractéristiques immunologiques des épitopes identifiés sur la protéine S et pour étudier plus en détail la valeur potentielle de ces épitopes de protéine S en tant que candidats vaccins peptidiques, nous avons réalisé une étude d'immunisation de souris en utilisant des peptides sélectionnés. Des souris BALB/c ont été inoculées 3 fois avec chaque peptide en présence d'adjuvants alun et CpG (Fig. 4, F). Parmi les 4 peptides sélectionnés, la vaccination avec le peptide 356 a provoqué des anticorps spécifiques de l'antigène après les deuxième et troisième doses (Fig. 4, G). Les résultats du test de neutralisation sérique ont révélé que l'immunisation avec des peptides linéaires n'a pas généré de niveaux significatifs d'anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2 (Fig. 4, H), ce qui suggère que ces peptides linéaires fonctionnent mal pour induire des réponses robustes en anticorps neutralisants.

La protéine N du SRAS-CoV-2 est dépourvue de la plupart des épitopes réactifs qui assurent la médiation de réponses d'anticorps durables après une infection virale

Un certain nombre d'études ont élucidé la puissante antigénicité de la protéine N du SRAS-CoV-2.4,11,12 Cependant, nous n'avons pas réussi à identifier les épitopes dominants et persistants situés au niveau de la protéine N sur la base des critères de sélection actuels. (taux positif supérieur à 80 % aux 3 points de temps d'échantillonnage). Pour l'évaluation longitudinale des profils d'épitopes de la protéine N chez les individus atteints de COVID-19, nous avons effectué un deuxième cycle de criblage d'épitopes basé sur les données obtenues à partir de la puce à peptides pour la sélection d'épitopes sous-dominants qui sont restés systématiquement positifs. dans plus de 60 % des échantillons COVID-19 pour chacun des 3 points temporels d'échantillonnage (appelés épitopes sous-dominants et persistants). Au total, 4 épitopes sous-dominants et persistants de la protéine N du SRAS-CoV-2 ont été identifiés, parmi lesquels le peptide 2455 (N, aa 213-227) présentait une réactivité aux anticorps IgG et IgM dans le COVID{{16. }} patients, avec des niveaux d'intensité de signal relativement plus élevés (Fig. 5, A et B, et voir le tableau E4 dans le référentiel en ligne sur www.jacionline.org). Les 2 peptides qui se chevauchent, le peptide 2455 (N, aa 213-227) et le peptide 2456 (N, aa 217-231), sont situés dans la région de liaison riche en Ser/Arg entre le domaine de liaison à l'ARN N-terminal. et domaine de dimérisation C-terminal de la protéine N. Le peptide 2482 (N, aa 321-335) et le peptide 2491 (N, aa 357-371) sont entièrement ou partiellement situés dans le domaine de dimérisation de la protéine N (tableau E4). En raison du manque de structures 3-D concernant la conformation intacte de la protéine N, nous avons effectué uniquement des analyses structurales de 2 épitopes identifiés sur la structure dimère du domaine de dimérisation C-terminal. Les résidus du peptide 2482 forment des brins 2 b disposés de manière antiparallèle dans les interfaces de dimérisation, tandis que aa 357-364 du peptide 2491 forme des structures à base d'hélice situées aux extrémités opposées du dimère (Fig. 5, C). . L'alignement des séquences entre le SRAS-CoV précoce-2 (souche Wuhan-Hu-1) et 7 variants émergents a en outre révélé que les séquences de ces épitopes sous-dominants et persistants dans la protéine N sont presque identiques parmi les variants en circulation actuels, avec un une seule substitution G215C du peptide 2455 se produisant dans la variante Delta et une seule mutation G214C du peptide 2455 identifiée dans la variante Lambda, suggérant que les anticorps ciblant ces peptides reconnaissent potentiellement l'antigène des variantes émergentes du SRAS-CoV -2 (Fig. 5, D ).

FIG 4. Epitopes dominants de la protéine Spike du SRAS-CoV-2 en termes de médiation des réponses immunitaires humorales durables. A et B, emplacements des épitopes dominants et persistants sur les structures 3-D de la protéine S monomère (A) et trimérique (B) (ID PDB : 6VXX). Les épitopes sont surlignés en vert (peptide 356, aa 197-211), rouge (peptide 318, aa 45-59), bleu (peptide 510, aa 813-827) et violet (peptide 530, aa 893-907), respectivement. Les trois monomères S en conformation fermée sont représentés respectivement en gris, rose et cyan. C, Analyse détaillée de la structure des épitopes dominants dans la protéine S du SRAS-CoV-2 à l'état fermé du trimère S (ID PDB : 6VXX). D, Alignement des séquences des épitopes identifiés parmi les coronavirus humains courants. Les résidus d'épitopes conservés entre le SRAS-CoV-2 et d'autres coronavirus humains sont ombrés en gris. E, analyse de la conservation des épitopes du premier SRAS-CoV-2 (souche Wuhan-Hu-1) et de 7 variantes émergentes. Les points noirs représentent des résidus identiques entre la souche Wuhan-Hu-1 et celle indiquée.

FIG 5. Les épitopes sous-dominants situés au niveau de la protéine nucléocapside du SRAS-CoV-2 sont capables de médier les réponses anticorps persistantes. Fréquences de reconnaissance A, IgG et IgM des peptides sous-dominants (réactifs de manière durable dans plus de 60 % des échantillons) parmi les échantillons de sérum de patients collectés à plusieurs moments après le début de la maladie. B, Cinétique d’intensité du signal des épitopes sous-dominants identifiés au fil du temps. Chaque point représente un échantillon de sérum de patient distinct obtenu auprès de patients COVID-19 à des moments indiqués après l'apparition des symptômes. Les lignes horizontales en pointillés indiquent les valeurs seuils de réponse positive pour chaque peptide. C, Analyse détaillée de la structure des épitopes sur le domaine de dimérisation C-terminal de la protéine N (PDB ID : 6YUN). Les épitopes sont étiquetés en bleu (peptide 2482, aa 321-335) ​​et en marron (peptide 2491, aa 357-364). Les 2 structures monomères sont représentées respectivement en gris et cyan. D, Analyse d'alignement de séquence des épitopes de protéine N identifiés entre le premier SRAS-CoV-2 (souche Wuhan-Hu-1) et 7 variantes émergentes. Les points noirs désignent des séquences identiques entre la souche Wuhan-Hu-1 et la variante indiquée. Les changements dans la séquence d’acides aminés sont surlignés en rouge.

FIG 6. Epitopes de revêtement avec une intensité de liaison élevée et des fréquences réactives décroissantes au fil du temps, reconnus par les individus infectés par le SRAS-CoV-2. A et B, analyse longitudinale et distribution des peptides identifiés présentant une intensité de signal de liaison élevée (au-dessus de la moyenne 1 SD des intensités de signal de tous les échantillons testés) mais un taux positif décroissant au fil du temps. La fréquence de reconnaissance (A) et l'intensité du signal (B) des épitopes ont été tracées avec 3 points de temps d'échantillonnage après l'apparition des symptômes. Chaque point en (B) représente un échantillon de sérum de patient individuel collecté aux moments indiqués après l'apparition des symptômes ; les lignes horizontales en pointillés indiquent les valeurs seuils de positivité pour chaque peptide. L'analyse de signification statistique a été réalisée sur la base du logiciel Limma of R v3.6.3. *P < 0,05 et **P < 0,01. C, Comparaisons de localisation et de séquence de 2 épitopes adjacents, le peptide 510 (dominant et persistant) et le peptide 511 (intensité de signal élevée et positivité décroissante au fil du temps), sur la structure de la protéine S du SRAS-CoV-2 (ID PDB : 6ZGI) . Les régions superposées entre les 2 épitopes sont surlignées en vert ; les séquences uniques sont étiquetées en rouge et bleu.

L'analyse sérologique longitudinale identifie des épitopes présentant une intensité de signal élevée mais une réactivité décroissante au fil du temps

En plus des épitopes hautement réactifs sélectionnés qui sont responsables des réponses immunitaires humorales soutenues mentionnées ci-dessus, nous avons en outre identifié et caractérisé un panel de 9 peptides positifs qui présentaient des intensités de liaison robustes (au-dessus de la moyenne de 1 écart-type des intensités de signal de tous les échantillons testés) avec une tendance à la diminution de la réactivité (changements du taux positif supérieur à 20 %) parmi les échantillons de sérum provenant de patients COVID-19 au fil du temps, conformément à une tendance générale au déclin des réponses immunitaires humorales. Ces épitopes sont positionnés au sein des 3 antigènes dominants : les protéines ORF1ab, S et N (Fig. 6, A ; et voir le tableau E5 dans le référentiel en ligne sur www.jacionline.org). De plus, des réductions significatives des intensités de signal de 4 peptides des protéines ORF1ab (peptides 784-IgG, 1617-IgM et 1986-IgM) et N (peptide 2457-IgG) ont été observées. entre les échantillons provenant d'une période précoce de points de temps d'échantillonnage (jours 10-60 après l'apparition de la maladie) et de la phase ultérieure de points de temps d'échantillonnage (jours 100-150 ou jours 180-220 après l'apparition des symptômes) (Fig. 6 ,B). Notamment, bien qu'ils se chevauchent largement, 2 peptides de la protéine S, le peptide 510 (dominant et persistant ; figure 3, B) et le peptide 511 (intensité de signal élevée et taux positif décroissant au fil du temps ; figure 6, A) présentaient différents modèles de réactivité parmi les échantillons de sérum des patients au fil du temps. L'analyse de la séquence et de l'emplacement a indiqué que le peptide 510 contient un site de clivage S2' et des acides aminés supplémentaires de 813-SKRS-816, alors que le peptide 511 est complètement dans le FP avec un 828-LADA{{29 étendu. }} résidus entièrement exposés à la surface de la protéine S trimérique (Fig. 6, C). Ces résultats ont révélé de nouvelles caractéristiques des épitopes qui pourraient à terme contribuer à une immunité humorale plus durable et plus forte contre le SRAS-CoV-2.

DISCUSSION

Une caractérisation systématique des réponses immunitaires à long terme à l’infection par le SRAS-CoV-2 est essentielle au développement de diagnostics améliorés, d’interventions thérapeutiques efficaces et de vaccins. Dans la présente étude, nous avons effectué une analyse longitudinale complète des patients COVID-19 sur un suivi de 180 à 220 jours, montrant des réponses immunitaires humorales persistantes et une production de cytokines activée après une infection virale.

De manière significative, en tirant parti de la puce à base de peptides couvrant le protéome du SRAS-CoV-2, nous avons en outre révélé la cinétique de reconnaissance des épitopes et identifié un panel d'épitopes dominants capables de médier l'immunité humorale à long terme. Les résultats que nous rapportons ici concernant la longévité des réponses immunitaires humorales après une infection par le SRAS-CoV-2 confirment certaines données publiées précédemment5,10,12,13,42 mais les étendent en effectuant un profilage sérologique approfondi et un dépistage des épitopes à l'aide d'échantillons de sérum longitudinaux. provenant d'individus atteints de COVID-19 grâce à l'approche des puces à ADN à l'échelle du protéome. Dans cette étude, nous avons identifié 4 épitopes dominants (peptides 318, 356, 510 et 530) au sein de la protéine S du SRAS-CoV-2 qui étaient capables de réagir de manière persistante avec plus de 80 % de patients atteints de COVID-19. échantillons testés, jusqu’à 180 à 220 jours après l’apparition des symptômes. Le peptide 510 (S, aa 813-827), comprenant le site de clivage S2 et le FP de la sous-unité S2, a été couramment identifié dans des études antérieures d'autres groupes.26,28,32-34 Les analyses fonctionnelles ont indiqué des anticorps le ciblage de cette région peut présenter un pouvoir de neutralisation limité contre le SRAS-CoV-226,33 bien qu'il soit fortement exposé à la surface de la protéine S (Fig. 4, AC). Dans le cas du peptide 530 (S, aa 893-907), qui est positionné entre le FP et la première région de répétition heptade de la sous-unité S2, les résidus sont généralement enfouis à l'intérieur de la structure trimérique de la protéine S, ce qui la rend difficile d'accès via des anticorps neutralisants robustes contre le SRAS-CoV-2 (Fig. 4, AC). De plus, 2 peptides dirigés vers S1-NTD qui pourraient médier les réponses anticorps à long terme du SRAS-CoV-2 ont également été sélectionnés. Les analyses concernant la séquence peptidique et l'emplacement ont indiqué que les résidus de ces 2 peptides - le peptide 318 (S, aa 45-59) et le peptide 356 (S, aa 197-211) - sont à proximité immédiate des épitopes signalés et reconnus. par des anticorps renforçant l'infection23,25 mais en dehors des sites clés d'anticorps neutralisants très puissants ciblant les NTD de la sous-unité S1,16,19,43 suggérant la possibilité d'une reconnaissance d'épitopes par des anticorps non neutralisants envers ces 2 peptides identifiés. En plus des détails mentionnés ci-dessus, l'immunisation de souris avec des peptides sélectionnés a en outre indiqué la faible efficacité de ces peptides linéaires à domaine de liaison non récepteur pour induire de robustes réponses en anticorps neutralisants (Fig. 4, G). Collectivement, ces données suggèrent que les épitopes linéaires dominants médiateurs des réponses immunitaires humorales à long terme lors d’une infection par le SRAS-CoV-2 induisent probablement des anticorps sans pouvoir neutralisant ou limité. Une compréhension plus complète du paysage des épitopes des anticorps du SRAS-CoV-2, en particulier des épitopes dirigés vers la protéine S, fournit de nouvelles informations sur la dissection fonctionnelle des anticorps, ce qui facilite encore la conception de vaccins innovants et rationnels. Les anticorps neutralisants confèrent une protection pour éliminer les infections virales, tandis que les anticorps non neutralisants peuvent jouer un rôle bénéfique, neutre, voire nocif, lors de l'élimination du virus. Les anticorps non neutralisants offrent une protection supplémentaire in vivo via une gamme de fonctions effectrices médiées par Fc dans le contexte de la phagocytose dépendante des anticorps et de la cytotoxicité dépendante des anticorps. En revanche, certaines études ont proposé la possibilité d’un rôle pathogène des anticorps non neutralisants dans l’infection à coronavirus. Des études antérieures utilisant plusieurs types de vaccins candidats contre le SRAS-CoV et le MERS-CoV ont observé une immunopathologie améliorée chez les petits animaux vaccinés et les primates non humains après la provocation virale.24,44-50 Plus récemment, des études de 2 groupes ont rapporté que les vaccins non neutralisants les anticorps ciblant les ATN de la protéine S du SRAS-CoV-2 étaient capables d'améliorer l'infection virale in vitro grâce à des mécanismes indépendants du récepteur Fcg,23,25 bien que les anticorps renforçant l'infection administrés passivement dans des modèles animaux se soient révélés protecteurs contre le SRAS. -Infection au CoV-2 in vivo. Compte tenu des rôles controversés des anticorps au cours de l’infection par le coronavirus, des recherches plus approfondies sont nécessaires pour valider le rôle potentiel des anticorps dans la reconnaissance de ces épitopes dominants et persistants dans la lutte contre l’infection virale in vivo. La prochaine étape de la conception rationnelle d'un vaccin contre le SRAS-CoV-2 pourrait être conçue en produisant des anticorps neutralisants très puissants et des anticorps protecteurs non neutralisants, ainsi qu'en réduisant la présentation d'épitopes renforçant l'infection ou d'épitopes immunodominants qui n'ont pas d'anticorps. effets bénéfiques. Bien qu'un certain nombre d'études antérieures se soient uniquement concentrées sur la protéine S du SRAS-CoV-2 dans le but de délimiter les fonctions des anticorps concernant la neutralisation, nous avons effectué une cartographie complète des épitopes à l'échelle du protéome et identifié un panel d'épitopes au sein de la polyprotéine ORF1ab qui a été systématiquement reconnu par une proportion élevée d’échantillons de sérum de patients au fil du temps. Bien que ces peptides dirigés par ORF1ab et distribués sur plusieurs protéines non structurales ne puissent pas générer d'anticorps fonctionnels ciblant le virion du SRAS-CoV -2, ils pourraient être applicables comme outil de diagnostic pour aider à différencier l'infection naturelle de la vaccination. Avec le nombre croissant de personnes vaccinées dans le monde, les tests sérologiques actuels basés sur la protéine S et la protéine N sont confrontés à des défis en tant qu'approche efficace pour faciliter les tests moléculaires pour la détection de l'infection par le SRAS-CoV-2, ainsi que pour la détermination du statut immunitaire après une infection virale. En tirant parti des peptides les plus courants et les plus réactifs de l'ORF1ab chez les individus infectés par le COVID, le diagnostic sérologique de l'infection naturelle sera effectué sans prendre en compte le statut vaccinal impliquant la protéine S basée sur le domaine de liaison au récepteur. des approches vaccinales à base de virus et à base de virus inactivés. De futures études sont nécessaires pour évaluer la réactivité, la sensibilité et la spécificité des peptides ORF1ab identifiés dans des cohortes plus importantes comprenant à la fois des individus infectés par le SRASCoV-2 et des vaccinés. De plus, une évaluation plus approfondie de l’efficacité de la détection grâce à de multiples stratégies de combinaison de peptides sera nécessaire pour surmonter la moindre sensibilité des peptides par rapport à la protéine complète et l’éventuelle réactivité croisée entre les coronavirus humains courants. Les principales limites de notre étude sont le nombre relativement restreint d'échantillons obtenus à partir d'une petite cohorte de patients, et la majorité des participants ont souffert de maladies COVID-19 non graves. Ceci peut limiter certaines de nos conclusions en ce qui concerne la fréquence des réponses positives et l'ampleur des réponses immunitaires, qui peuvent varier en fonction de la gravité de la maladie. Néanmoins, les données présentées dans cette étude fournissent des informations précieuses sur la cinétique des réponses immunitaires au fil du temps après une infection par le SRAS-CoV-2 et les caractéristiques des épitopes dominants capables de médier une immunité humorale soutenue chez les individus atteints de COVID-19. Ensemble, ces résultats offrent une compréhension plus approfondie de la longévité de l’immunité naturelle induite par une infection virale et ont de vastes implications pour des stratégies de vaccination innovantes et des approches diagnostiques améliorées.

LES RÉFÉRENCES

1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H et al. Caractérisation génomique et épidémiologie du nouveau coronavirus 2019 : implications pour les origines du virus et la liaison aux récepteurs. Lancet 2020 ; 395 : 565-74.

2. Organisation mondiale de la santé (OMS). Tableau de bord de l'OMS sur le coronavirus (COVID-19), 2021. Disponible sur : https://COVID19.who.int/. Consulté le 30 novembre 2021.

3. Wu Z, McGoogan JM. Caractéristiques et enseignements importants de l'épidémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) en Chine : résumé d'un rapport de 72 314 cas du Centre chinois de contrôle et de prévention des maladies. JAMA 2020 ; 323 : 1239-42.

4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D et al. Immunité adaptative spécifique à l'antigène contre le SRAS-CoV-2 dans les cas de COVID aigu-19 et associations avec l'âge et la gravité de la maladie. Cellule 2020 ; 183 : 996-1012.e19.

5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S et al. L'infection par le SRAS-CoV-2 induit des réponses immunitaires humorales soutenues chez les patients convalescents suite à un COVID symptomatique-19. Nat Commun 2021;12:1813.

6. Long QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK et al. Réponses en anticorps contre le SRAS-CoV-2 chez les patients atteints de COVID-19. Nat Med 2020 ; 26 : 845-8.

7. Sterlin D, Mathian A, Miyara M, Mohr A, Anna F, Claer L et al. Les IgA dominent la réponse précoce en anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2. Sci Transl Med 2021;13 : eabd2223.

8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y et al. Cellules T auxiliaires folliculaires circulantes spécifiques aux pointes et réponses en anticorps neutralisants croisés chez les personnes convalescentes COVID-19. Nat Microbiol 2021 ; 6 : 51-8.

9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q et al. Les réponses en anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2 sont plus robustes chez les patients atteints d'une maladie grave. Les microbes émergents infectent 2020 ; 9 : 2091-3.

10. Vanshylla K, Di Cristanziano V, Kleipass F, Dewald F, Scommers P, Gieselmann L et al. Cinétique et corrélats de la réponse des anticorps neutralisants à l'infection par le SRASCoV-2 chez l'homme. Microbe hôte cellulaire 2021 ; 29 : 917-29.e4.

11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H et al. Diminution des niveaux d'anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2 chez les patients convalescents COVID-19 un an après l'apparition des symptômes. Front Immunol 2021;12:708523.

12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C et al. Action neutralisante naturellement améliorée contre le SRAS-CoV-2 un an après l'infection. Nature 2021 ; 595 : 426-31.

13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE et al. Mémoire immunologique au SRAS-CoV-2 évaluée jusqu'à 8 mois après l'infection. Sciences 2021 ;371 :eabf4063.

14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I et al. Maturation et persistance de la réponse des lymphocytes B mémoire anti-SARS-CoV-2. Cellule 2021 ; 184 : 1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X et al. Anticorps neutralisants humains provoqués par l'infection par le SRAS-CoV-2. Nature 2020 ; 584 : 115-9.

16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q et al. Anticorps neutralisants puissants contre plusieurs épitopes lors du pic du SRAS-CoV-2. Nature 2020 ; 584 : 450-6.

17. Zost SJ, Gilchuk P, Case JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP et al. Anticorps humains puissamment neutralisants et protecteurs contre le SRAS-CoV-2. Nature 2020 ; 584 : 443-9.

18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X et al. Dynamique conformationnelle de la glycoprotéine de pointe trimérique du SRAS-CoV-2 en complexe avec le récepteur ACE2 révélée par cryo-EM. Sci Adv 2021;7:eabe5575.

19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC et al. La cartographie antigénique du domaine N-terminal révèle un site de vulnérabilité pour le SRASCoV-2. Cellule 2021 ; 184 : 2332-47.e16.

20. Sauer MM, Tortorici MA, Park YJ, Walls AC, Homad L, Acton OJ et al. Base structurelle pour une large neutralisation du coronavirus. Nat Struct Mol Biol 2021;28 :478-86.

21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE et al. Les anticorps humains ultrapuissants protègent contre le SRAS-CoV-2 via de multiples mécanismes. Science 2020 ; 370 : 950-7.

22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S et al. Neutralisation croisée du SRAS-CoV-2 par un anticorps monoclonal humain contre le SRAS-CoV. Nature 2020 ;583 :290-5.

23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S et al. Un site améliorant l'infectiosité sur la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 ciblée par les anticorps. Cellule 2021 ; 184 : 3452-66.e18.

24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H et al. Les IgG anti-pic provoquent de graves lésions pulmonaires aiguës en faussant les réponses des macrophages lors d’une infection aiguë par le SRAS-CoV. JCI Insight 2019;4:e123158.

25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Schäfer A, Alam SM, et al. Fonctions in vitro et in vivo des anticorps renforçant et neutralisant l’infection par le SRAS-CoV-2. Cellule 2021 ; 184 : 4203-19.e32. 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS et al. Deux épitopes linéaires sur la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 provoquent des anticorps neutralisants chez les patients atteints de COVID-19. Nat Commun 2020;11:2806.

27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC et al. Extraction d'épitopes sur la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 provenant de patients COVID-19. Cellule Rés 2020 ; 30 : 702-4.

28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL et al. Le profilage des épitopes révèle les signatures de liaison de la réponse immunitaire du SRAS-CoV-2 lors d'une infection naturelle et d'une réactivité croisée avec les CoV humains endémiques. Représentant cellulaire 2021 ; 35 : 109164.

29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y et al. Le profilage des épitopes viraux des patients atteints de COVID-19 révèle une réactivité croisée et des corrélats de gravité. Science 2020 ;370 :eabd4250.

30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM et al. ReScan, un pipeline de diagnostic multiplex, analyse les sérums humains pour les antigènes du SRAS-CoV-2- 2. Cell Rep Med 2020;1:100123.

31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A et al. Cartographie des épitopes à haute résolution et caractérisation des anticorps du SRAS-CoV-2 dans de grandes cohortes de sujets atteints de COVID-19. Commun Biol 2021;4:1317.

32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H et al. Évaluation systématique des réponses IgG aux peptides dérivés de la protéine Spike du SRAS-CoV-2 pour la surveillance des patients atteints de COVID-19. Cell Mol Immunol 2021 ; 18 : 621-31.

33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY et al. Paysage d'épitopes linéaires de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 construit à partir de 1 051 patients COVID-19. Représentant cellulaire 2021 ; 34 : 108915.

34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D et al. Micropuce protéomique du SRAS-CoV-2 pour cartographier les interactions des anticorps COVID-19 à la résolution des acides aminés. ACS Cent Sci 2020 ; 6 : 2238-49.

35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y et al. Cartographie fonctionnelle des épitopes linéaires des cellules B du SRAS-CoV-2 dans la population de convalescence COVID-19. Les microbes émergents infectent 2020 ; 9 : 1988-96.

36. Commission nationale de la santé et Administration nationale de médecine traditionnelle chinoise. Protocole de diagnostic et de traitement de la pneumonie à nouveau coronavirus (version d'essai 7). Chin Med J (anglais) 2020 ; 133 : 1087-95 ; https://doi.org/10.1097/CM9.0000000000000819.

37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC et al. Le profilage longitudinal du répertoire d'autoanticorps sériques identifie les biomarqueurs associés à la chirurgie dans l'adénocarcinome du poumon. EBioMedicine 2020;53:102674.

38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y et al. Réponses d'anticorps au SRASCoV-2 chez les patients atteints d'une nouvelle maladie à coronavirus 2019. Clin Infect Dis 2020 ;71 : 2027-34.

39. Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M et al. Les analyses longitudinales révèlent des ratés immunologiques en cas de COVID grave-19. Nature 2020 ;584 : 463-9.

40. Moore JB, juin CH. Syndrome de libération de cytokines dans les cas de COVID grave-19. Science 2020 ; 368 : 473-4.

41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB et al. Base structurelle du couplage hélicase-polymérase dans le complexe réplication-transcription du SRAS-CoV-2. Cellule 2020 ; 182 : 1560-73.e13.

42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M et al. Des anticorps neutralisants robustes contre l’infection par le SRAS-CoV-2 persistent pendant des mois. Sciences 2020 ; 370 : 1227-30.

43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M et al. Un anticorps humain neutralisant se lie au domaine N-terminal de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2. Sciences 2020 ; 369 : 650-5.

44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL et al. L'immunisation avec les vaccins contre le coronavirus du SRAS conduit à une immunopathologie pulmonaire lors d'une provocation par le virus du SRAS. PLoS One 2012;7:e35421.

45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M et al. Un vaccin contre le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère doublement inactivé offre une protection incomplète chez la souris et induit une réponse pulmonaire proinflammatoire éosinophile accrue en cas de provocation. J Virol 2011 ; 85 : 12201-15.

46. ​​Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J et al. L'immunisation avec le virus de la vaccine modifié, le vaccin recombinant à base d'Ankara contre le syndrome respiratoire aigu sévère, est associée à une hépatite accrue chez le furet. J Virol 2004;78 : 12672-6.

47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S et al. Une immunisation antérieure contre la protéine nucléocapside du coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) (SRAS-CoV) provoque une pneumonie grave chez les souris infectées par le SRAS-CoV. J Immunol 2008;181 : 6337-48.

48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A et al. Efficacité du vaccin chez les souris sénescentes confrontées à des variantes épidémiques et zoonotiques de SRAS-CoV recombinant. PLoS Med 2006;3:e525.

49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T et al. Les épitopes immunodominants du coronavirus du SRAS chez l’homme ont provoqué des effets à la fois stimulants et neutralisants sur l’infection chez les primates non humains. ACS Infect Dis 2016 ; 2 : 361-76.

50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH et al. L'immunisation avec le vaccin inactivé contre le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient conduit à une immunopathologie pulmonaire lors d'une provocation avec un virus vivant. Hum Vaccin Immunother 2016 ; 12 : 2351-6.